兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的：建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法，观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：实验于2003-03／2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①、用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察，免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂，14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。 结果：①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样。具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin，CD29，CD44，不表达CD14，CD34。③加入成骨诱导剂14d后，骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长，现碱性磷酸酶强阳性，阳性率为90．5％。④经成软骨诱导后，Ⅱ型胶原免疫组化染色。诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

不同剂量骨碎补对兔骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

背景：现代研究表明骨碎补具有推迟细胞退行性变、降低骨关节病发病率的作用。
　　目的：比较不同剂量骨碎补冻干粉诱导兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的效果,并筛选出最佳剂量。
　　方法：利用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,分为空白组、转化生长因子β1阳性对照组、骨碎补高、中、低剂量组(分别含骨碎补0.4 mg,0.1 mg,5μg),取第3代骨髓间充质干细胞,根据实验分组加入不同培养液进行培养,1周后MTT比色法检测活细胞数目,免疫组化法测定Ⅱ型胶原表达。结果与结论：MTT 比色结果显示转化生长因子β1和骨碎补冻干粉均能促进骨髓间充质干细胞增殖,转化生长因子β1阳性对照组>骨碎补低剂量组>骨碎补中剂量组>骨碎补高剂量组>空白组。细胞免疫组化检测Ⅱ型胶原结果显示转化生长因子β1和骨碎补冻干粉均可以诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,诱导后的细胞明显表达Ⅱ型胶原,转化生长因子β1阳性对照组>骨碎补低剂量组>骨碎补中剂量组>骨碎补高剂量组>空白组。结果表明骨碎补能促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化,尤以5μg剂量效果最佳。     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景:成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系.目的:建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果.方法:分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达.不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况.结果与结论:全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养——贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的：对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法，本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法：实验于2004—09／12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6—8周龄的SD大鼠，雌雄不限，从其股骨、胫骨中取材，在无菌条件下操作，用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端，暴露骨髓腔，用含有体积分数为0．15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中，用含有体积分数为0．1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养，用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞，并观察其生长状态，测定骨髓间充质干细胞的生长曲线，分裂指数，贴壁率，用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型，第6代前生长性状稳定，增殖能力强。传代周期为7d，每次传代时细胞活力测定均&;gt;97％，传代后24h内贴壁率99％。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论：实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高，细胞活力强，生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便，条件要求低等优点，是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面生长状况

背景:颌面骨缺损是临床上常遇到的问题,寻找理想的种子细胞同支架材料复合构建组织工程化人工骨成为该类疾病治疗的发展趋势.目的:将转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞与珊瑚骨的复合培养,观察转染碱性成纤维生长因子基凶的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况.设计、时间及单位:骨组织工程实验,于2006-0312008-06 在中山大学口腔医学研究所完成.材料:选用海南省浅海滩产石头状滨珊瑚为原料,将其制成8mm×8mm×2mm的珊瑚人工骨小块.方法:采用密度梯度离心法分离新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,采用贴壁筛选法对分离出的骨髓间充质下细胞进行纯化,利用脂质体转染bFGF-pcDNA3到骨髓间充质干细胞.取生长良好的转染碱性成纤维生长因子基因骨髓间充质干细胞和未转染的骨髓间充质干细胞,分别接种于不同珊瑚表面.主要观察指标:MTT法观察细胞-支架联合培养骨髓间充质干细胞的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况.结果:MTT法检测显示细胞-支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比差异有显著性意义(P＜0.05),联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞.而联合培养的转染组细胞同单纯培养转染组细胞增殖相比差异无显著性意义(P＞0.05).扫描电镜观察显示复合骨髓间充质干细胞细胞贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,细胞向孔内长入或跨越微孔表面,部分区域有细胞外基质形成.结论:转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响骨髓间充质干细胞的增殖,可以作为骨髓间充质干细胞支架材料构建组织工程骨.     

体外培养猪骨髓间充质干细胞hHCN2基因的转染及表达

背景：通过超极化活化的阳离子电流调制心脏自律性成为该领域研究的焦点。目的：将起搏基因质粒CMV-hHCN2-3xha-IRES-EGFP转染到猪骨髓间充质干细胞,检测其在骨髓间充质干细胞中核酸和蛋白水平是否表达。方法：采用单纯直接贴壁法或密度梯度离心结合直接贴壁法分离、纯化、增殖获得骨髓间充质干细胞,脂质体2000转染质粒CMV-hHCN2-3xha-IRES-EGFP至骨髓间充质干细胞。结果与结论：单纯直接贴壁法收集到的细胞增殖速度慢,而密度梯度离心结合直接贴壁法细胞增殖速度较快,原代细胞培养第3代后转染48h荧光显微镜下可见骨髓间充质干细胞发出荧光,对照组无荧光。细胞转染率达15%-20%。RT-PCR检测及Westernblot印迹检测证明了hHCN2基因在骨髓间充质干细胞有表达。密度梯度离心结合直接贴壁法较单纯直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。转染目的基因hHCN2的骨髓间充质干细胞蛋白有表达。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性（〈1%）。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。     

In vitro and in vivo co‐culture of chondrocytes and bone marrow stem cells in photocrosslinked PCL–PEG–PCL hydrogels enhances cartilage formation

Chondrocytes (CH) and bone marrow stem cells (BMSCs) are sources that can be used in cartilage tissue engineering. Co‐culture of CHs and BMSCs is a promising strategy for promoting chondrogenic differentiation. In this study, articular CHs and BMSCs were encapsulated in PCL–PEG–PCL photocrosslinked hydrogels for 4 weeks. Various ratios of CH:BMSC co‐cultures were investigated to identify the optimal ratio for cartilage formation. The results thus obtained revealed that co‐culturing CHs and BMSCs in hydrogels provides an appropriate in vitro microenvironment for chondrogenic differentiation and cartilage matrix production. Co‐culture with a 1:4 CH:BMSC ratio significantly increased the synthesis of GAGs and collagen. In vivo cartilage regeneration was evaluated using a co‐culture system in rabbit models. The co‐culture system exhibited a hyaline chondrocyte phenotype with excellent regeneration, resembling the morphology of native cartilage. This finding suggests that the co‐culture of these two cell types promotes cartilage regeneration and that the system, including the hydrogel scaffold, has potential in cartilage tissue engineering. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景:骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的:观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法:冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论:兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化神经细胞的实验研究

目的探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法无菌取成熟大鼠长骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞，在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定。结果骨髓基质细胞能在神经干细胞条件培养基中增殖、分化，表达巢蛋白抗体抗原，在适宜诱导分化因子及条件下进一步分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经细胞特异性核蛋白抗体抗原表达阳性。结论在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，骨髓基质细胞可成功诱导出神经元样细胞。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据.目的:动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增.选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响.取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养.结果与结论:运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性.脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%).细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似.提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性.     

犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备

背景:传统的组织工程方法在收获和转移细胞方面存在诸多不足,且难以形成致密的组织,明显限制了组织工程学的发展.目的:探讨犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备方法.方法:实验犬麻醉后抽取骨髓,采用密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.取传至第4代细胞,按1×10~9 L-1密度接种于商径3.5 cm的温度反应性培养皿中,置于37℃、体积分数为5%的CO_2饱和湿度培养箱内培养,待细胞增殖融合时再将培养皿的温度降至20℃培养20 min,倒置显微镜下观察细胞形态学变化及细胞片层形成情况.结果与结论:犬骨髓间充质干细胞原代培养24 h呈椭圆形或多角形,72 h多数细胞伸展贴壁,7 d时形成细胞集落,12 d时细胞呈长梭形,完全融合,细胞界限不清.温度反应性培养皿中的骨髓间充质干细胞在降温至20℃时,细胞形态发生变化,呈短梭形,且逐步从培养皿底分离,形成含细胞外基质的完整的细胞片层.证实密度梯度离心法可成功分离培养犬骨髓间充质干细胞,通过改变应用温度反应性培养皿的温度,能获取完整的细胞片层.