SARS病毒核酸检测中不同引物对灵敏度的影响

目的筛选灵敏、特异的SARS病毒核酸检测方法。方法采用世界卫生组织(WHO)和中国疾病预防控制中心(中国CDC)推荐的9对SARS病毒核酸检测引物，同时又选择市售的2种SARS荧光定量PCR试剂，分别对不同稀释度的SARS病毒核酸进行RT—PCR、巢式PCR和荧光定量PCR扩增，比较其检测灵敏度和特异性。结果两种荧光定量PCR试剂可检测SARS病毒核酸灵敏度均为0．1TCID50，与普通RT—PCR方法检测灵敏度(0.1TCID50)相同，而较巢式PCR法(0．01TCID50)略低；采用RT—PCR方法扩增SARS核酸时，以WHO推荐的SAR1s／SAR1as、BNIinS／BNIAs、BNIoutS/BnoutAs与中国CDC推荐的CDC-P1 ／P1-灵敏度最高。结论RT—PCR扩增时各引物对之间存在明显差异；荧光定量PCR可作为SARS疑似样本检测的首选方法，必要时再采用RT—PCR和巢式PCR法加以确认。     

实时定量PCR检测TRF1、TRF2和hRAP1基因在急性髓细胞性白血病中mRNA表达

目的：建立一种实时荧光RT—PCR方法,定量检测急性髓细胞性白血病（AML）患者外周血白细胞细胞TRF1、TRF2和hRAP1mRNA的表达水平及相互关系。方法：选取48例初治AML患者和21例健康志愿者,采用实时荧光RT—PCR与Lightcyeler荧光PCR仪定量检测TRFI、TRF2和hRAP1mRNA的表达水平;采用2^—△△Ct法处理实时荧光定量RT—PCR数据。结果：AML首治患者TRF1、TRF2和hRAP1mRNA表达水平较对照组健康志愿者分别下降了2．9倍,2．2倍和16．6倍,且差异有统计学意义;AML患者组TRF1和TRF2mR—NA的表达改变具有一定的相关性（r=0．57,P〈0．01）。结论：成功利用患者外周血检测出端粒结合蛋白TRF1,TRF2在白血病细胞中mRNA的表达水平下降,并首次检测发现hRAP1在AML患者细胞中存在表达下降,间接说明了hRAP1的表达下降也是白血病的发病原因之一。     

穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1株MexAB-OprM外排泵mRNA表达的影响

目的建立实时荧光定量PCR法检测铜绿假单胞菌MexAB-OprMmRNA水平的表达，探讨中草药穿心莲内酯对铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM表达情况的影响。方法克隆铜绿假单胞菌mexAB-oprM操纵元中merB基因和30SrRNA基因rpsL，分别构建相应质粒作为实时荧光定量PCRDNA标准品。以不同浓度穿心莲内酯作用铜绿假单胞菌PA01株，采用实时荧光定量PCR法检测PA01菌株中mexB和rpsl。基冈mRNA的表达水平。结果成功构建标准曲线质粒，50、100、150和200／μg／ml。穿心莲内酯作用后PA01ⅢPTB基因mRNA表达量分别为0．04±0．03、0．06±0．07、0．09±0．03和0．04±0．03，对照组为0．24±0．04，差异有统计学意义（P〈0．05），穿心莲内酯组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论穿心莲内酯可在mRNA水平抑制外排泵Mex—AB-OprM的表达，这可能是其抗感染机制之一。     

幽门螺杆菌TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR检测方法的建立北大核心CSCD

目的建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法。方法采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌CagA和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线。检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数。结果建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是10~2~10~8拷贝/μl,CagA和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4。29份临床胃黏膜标本的CagA和VacA基因循环数Ct值分别在29~35和30~35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×10^(1.39)~1.0×10^(3.87)和1.0×10^(3.06)~1.0×10^(3.91)之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为I型。结论建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定。     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌及磺脲受体1基因表达的影响

目的 研究游离脂肪酸（FFA）对体外培养的大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌及磺脲受体1（SUR1）基因表达的影响和机制。方法 分离纯化胰岛细胞后分别与0．25mmol／L软脂酸（PA）和0．125mmol／L油酸（OA）温育48小时，放免法检测胰岛素，RT—PCR检测SUR1基因表达。结果 与对照组比较，PA使基础胰岛素分泌增加110％（P〈0．01），葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）降低43％（P〈0．01）；OA使基础胰岛素分泌增加80％（P〈0．01），GSIS降低32％（P〈0．05）。RT—PCR示OA显著抑制了SUR1基因的mRNA表达，比对照组降低64％（P〈0．01），而PA组的表达较对照组降低15％（P〉0．05）。结论 FFA抑制GSIS可能与其对胰岛β细胞SUR1基因表达的调节有关。     

HBV C基因基本核心启动子变异对乙型肝炎患者血清病毒复制和细胞因子水平的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）DNAC基因基本核心启动子（BCP）变异对机体免疫状态及乙型肝炎病毒复制的影响。方法采用PCR微板核酸杂交结合ELISA技术检测HBVDNABCP变异；采用双抗体夹心ELISA法检测患者血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平；采用荧光定量PCR法测定HBVDNA水平。结果HBVDNABCP变异病人和非变异病人血清IL-2水平分别为61．4±24．7ng／L和65．1±25．3ng／L，IFN-γ为82．0±50．1ng／L和71．8±67．0ng／L，IL-4为62．3±46．0ng／L和59．4±51．0ng／L．IL-10为74．0±88．2ng／L和81．4±67．0ng／L（P均〉0．1）；HBVDNABCP变异病人的HBVDNA水平为1×10^5.82±2.01 copies／ml，明显高于非变异病人的1×10^4.71±1.78 copies／ml（P〈0．01）。结论HBVDNABCP变异对机体血清细胞因子水平无明显影响，但对HBVDNA的复制具有一定的促进作用。     

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的RealtimePCR（实时荧光定量PCR）方法,用于裂谷热病毒（RVFV）的检测。方法根据裂符热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-timePCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-timePCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0．99,灵敏度为1．0×10^1拷贝,高于常规PCR方法（1．0×10^3拷贝）;除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批问重复的变异系数均小于1％。结论建立的裂谷热病毒Real-timePCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷执病毒感染懊涑诊眯斤殛流行病学谰杏．     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

尖锐湿疣治疗效果与人乳头瘤病毒-DNA拷贝数关系的探讨

尖锐湿疣(CA)是一种常见性病，其感染的人乳头瘤病毒(HPV)可通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法进行检测，并准确定量HPV-脱氧核糖核酸(DNA)拷贝数。采用FQ—PCR方法对CA患者进行HPV6／11、16／18检测，以CO2激光加干扰素治疗，以评估病毒拷贝数与疗效之间的关系。     

荧光定量RT—PCR检测mdr1在急性白血病中的表达及临床意义

采用荧光定量RT-PCR法检测36例不同类型白血病患者的多药耐药基因（mdr1mRNA）表达,同时检测15例骨髓或外周血正常患者,以做对照。结果对照组均为阴性表达,初治患者组mdr1阳性基因拷贝数平均为2.7×10     

非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织内脂素的表达变化

目的观察非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏脂质沉积与内脂素因子的动态变化.方法随机将80只SD大鼠分成普通饲料和高脂饲料喂养组,两组按时间节点再分为4个亚组（各10只）.检测大鼠血清内脂素水平和肝组织内脂素蛋白及mRNA水平的变化.结果在高脂饮食喂养4周后,大鼠肝细胞出现轻度脂肪变,血清和肝组织内脂素mRNA水平分别为61.23±8.07μg/ml和5.36±1.91×10^3拷贝,与正常组59.57±4.57μg/ml和1.33±0.29×10^3拷贝比,无统计学差异;第9周时分别升高为67.53±11.46μg/ml和7.12±2.28×10^3拷贝（P〈0.05）,第13周时为76.35±14.05μg/ml和19.9±3.74×10^3拷贝（P〈0.01）,第18周实验结束时为81.89±13.62μg/ml和26.67±6.87×10^3拷贝（P〈0.01）.结论非酒精性脂肪性肝病大鼠血清及肝组织内脂素因子表达上调,提示其在非酒精性非脂肪性肝病发生发展过程中起一定的作用.     

纳米银对流感病毒H3N2的抑制作用

目的探讨纳米银（NaAg）对流感病毒H3N2的抑制作用。方法采用血球凝集试验、MTT分析法、血球吸附试验和鸡胚培养法,探讨NaAg对流感病毒H3N2的抑制作用。结果NaAg／H3N2组和H3N2对照组血球凝集试验效价分别为〈1：4和1：1024（P〈0．001）;NaAg溶液在MD-25细胞上最大无毒浓度为25μg／ml;H3N2在MD-25细胞上的细胞半数感染浓度（TCID50）为10^3.5／0．1ml。等体积的50μg/mlNaAg与40TCID50流感病毒H3N2溶液室温充分混和作用2h后感染MD-25细胞,细胞存活率为（96．77±2．07）％;20TCID。流感病毒H3N2感染MD-25细胞的细胞存活率为（33．09±1．48）％（P〈0．001）。结论NaAg对流感病毒H3N2具有明显的抑制作用。     

9型重组腺相关病毒转染大鼠心脏成纤维细胞的体外研究

目的:研究9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率及其对细胞生长的影响。方法:分离、获取并培养大鼠心脏成纤维细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-EGFP)转染大鼠心脏成纤维细胞,以转染复数(MOI)将细胞分为未转染病毒A组、B组MOI=1×104、C组MOI=1×105、D组MOI=1×106,倒置荧光显微镜下观察大鼠心脏成纤维细胞中EGFP的表达情况,观察转染后细胞生长形态,应用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率,应用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响。结果:D组的细胞于转染后24h即可观察到EGFP表达,B组与C组细胞则于48h观察到EGFP的表达。倒置荧光显微镜下观察转染后大鼠心脏成纤维细胞生长及形态正常,镜下观察显示各组细胞表达EGFP的强度随MOI值的增高而增强,同时亦随着时间延长而增强,EGFP表达在转染120h达到高峰,此时检测rAAV9-EGFP对心脏成纤维细胞的转染效率,分别为B组:(2.6±0.2)%,C组:(7.3±1.4)%,D组:(45.1±2.7)%。AlamarBlue法检测表明转染组细胞各时点与未转染组的还原率比值接近于1。结论:rAAV9-EGFP能够有效转染大鼠心脏成纤维细胞,转染后EGFP基因能够有效得以表达,rAAV9对细胞增殖无明显抑制。9型重组腺相关病毒可作为基因治疗心脏疾病研究的理想载体。     

护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨护骨素（OPG）对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的影响及可能机制。方法将HUVECs细胞分为3组：正常对照组：以0．4％牛血清白蛋白处理;软脂酸组：以0．4mmol／L软脂酸处理;OPG组：以不同浓度OPG预处理24h,再加入0．4mmol／L软脂酸（OPG浓度分别为50、100、200、400μg／L）,以上各组细胞培养24h,流式细胞术及Hoechst33258核染色检测细胞凋亡。将HUVECs细胞分为5组：正常对照组：以0．4％牛血清白蛋白处理;软脂酸组：以0．4mmol／L软脂酸处理;OPG组：以400μg／LOPG预处理24h,再加入0．4mmol／L软脂酸;软脂酸±OPG±雷帕霉素组：以10μg/L雷帕霉素预处理24h,再给予400μg／LOPG处理24h,最后加入0．4mmol／L软脂酸;软脂酸±雷帕霉素组：以10μg/L雷帕霉素预处理24h,再加入0．4mmoL／L软脂酸。以Westernblotting法分析各组HUVECs细胞马铃薯球蛋白（tuberin）、磷酸化马铃薯球蛋白（P-tuberin）、核糖体蛋白s6激酶（S6K）、磷酸化核糖体蛋白S6激酶（P-S6K）、Bcl-2、Bax以及caspase3蛋白表达水平。组间均数比较采用单因素方差分析,组问两两比较采用SNK法。结果与正常对照组比较,软脂酸组早期细胞凋亡率显著增加（18．31％±0．51％比6．88％±0．60％,P〈0．05）;OPG组早期凋亡率（12．58％±0．19％、9．39％±0．42％、7．55％±0．17％、5．90％±0．14％）明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,且呈OPG剂量依赖性;与正常对照组比较,软脂酸组晚期凋亡率显著增加（9．55％±0．22％比5．28％±0．90％,P〈0．05）;OPG组晚期凋亡率（7．71％±0．17％、6．42％±0．18％、5．24％±0．16％、4．50％±0．16％）明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,且呈OPG剂量依赖性。与正常对照组比较,软脂酸组P-tubefin／tubefin（2．0942±0．0163比1．1948±0．0541）、P-s6K／S6K（2．0942±0．0163比3．2052±0．0051）、Bax／β-actin（0．3868±0．0013比1．2991±0．0026）、caspase3／β-actin（0．2346±0．0009比0．57934-0．0103）表达水平均显著提高,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,Bcl-2／β-aetin表达显著降低（0．2470±0．0038比0．0716±0．0004,P〈0．05）;OPG组P-tuberin／tubefin（0．8258±0．0074）、P．S6K／S6K（2．5073±0．1403）、Bax／β-actin（0．7452±0．0045）、easpase3／β-actin（0．4713±0．0066）表达水平明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,Bcl-2／β-actin（0．1909±0．0021）表达明显高于软脂酸组（P〈0．05）。结论OPG对软脂酸诱导的HUVECs凋亡具有保护作用,此作用可能通过下调tuberin／mTOR活性,增加Bcl-2表达、降低Bax及Caspase3表达实现的。     

采用利奈唑胺治疗肺结核合并重症肺炎的临床疗效及安全性

目的 探讨利奈唑胺治疗肺结核合并重症肺炎的临床疗效及安全性。 方法 对我院2010年3月至2012年9月收治并经过临床确诊的肺结核合并重症肺炎患者50例进行回顾性分析,总结利奈唑胺的疗效,以及比较白细胞数、中性粒细胞数、C反应蛋白、红细胞沉降率、血小板、血肌酐在治疗前后的变化。计数资料应用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。 结果 采用利奈唑胺治疗的肺结核合并重症肺炎患者50例中,细菌消除率和临床总有效率均为82.0%(41/50),白细胞数、中性粒细胞数、C反应蛋白、红细胞沉降率在治疗前分别为(14.52±6.88)×10⁹/L、(12.44±7.01)×10⁹/L、(112.28±82.59)μg/L、(66.28±37.71)mm/1h;治疗后分别为(9.94±3.43)×10⁹/L、 (7.64±3.46)×10⁹/L、(57.19±59.23)μg/L、(50.56±27.15)mm/1h。治疗前后比较,差异有统计学意义,t值分别为4.214、4.345、3.163、2.098,P值均＜0.05。血小板治疗前为（306.54±150.94）×10⁹/L,治疗后为（259.18±140.39）×10⁹/L,治疗前后比较,t=1.625,P=0.107;差异无统计学意义。血肌酐治疗前为（104.88±118.54）μmol/L,治疗后(118.15±122.18) μmol/L,t=-0.535,P=0.594;差异无统计学意义。结论 利奈唑胺作为治疗肺结核合并重症肺炎的用药是安全有效的,可作为经验性用药。     

复合蛋白营养剂治疗乙型肝炎肝硬化患者营养状态及肝功能的变化

目的观察复合蛋白营养剂对存在蛋白质-能量营养不良（PEM）的乙型肝炎肝硬化患者营养状态及肝功能的影响。方法选择存在PEM的乙型肝炎肝硬化患者40例,基线均不存在相关并发症,分为复合蛋白营养剂组25例及对照组15例。复合蛋白营养剂组给予新型夜间加餐（原味酸牛奶200g＋复合蛋白营养剂15g）配合一般综合治疗,对照组给予一般综合治疗;观察两组患者的血清白蛋白、前白蛋白、淋巴细胞计数,并记录患者发生并发症的情况。结果在两组患者基线资料具有可比性的情况下,与治疗前相比,复合蛋白营养剂组患者血清白蛋白、前白蛋白、淋巴细胞计数明显上升,在6周末,对照组患者白蛋白为（30.2±3.2）g/L,显著低于治疗组[（33.6±3.7）g/L,P〈0.05],前白蛋白为（122.10±24）g/L,显著低于治疗组[（159.0.6±30.4）g/L,P〈0.05],淋巴细胞数为（1.08.10±0.31）×10^9/L,显著低于治疗组[（1.36±0.26）×10^9/L,P〈0.05],并发症发生较少,与对照组相比其差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论复合蛋白营养剂可以改善存在PEM的乙型肝炎肝硬化患者的营养状态及肝功能,有可能减少患者并发症的发生。     

阿德福韦酯挽救治疗拉米夫定耐药患者的临床分析

目的观察阿德福韦酯挽救治疗拉米夫定治疗后HBVDNA突破患者的疗效。方法将49例拉米夫定治疗后HBVDNA突破的慢性乙型肝炎患者分为3组。A组12例患者直接改用阿德福韦酯治疗,B组25例患者先用拉米夫定与阿德福韦酯联合治疗,HBVDNA阴转后再单用阿德福韦酯治疗,C组12例患者持续应用拉米夫定与阿德福韦酯联合治疗。观察挽救治疗1年血清HBVDNA阴转情况。结果A组10例患者在治疗（3．50±2．07）个月（1～7个月）发生HBVDNA阴转;B组21例患者在治疗（2．05±1．36）个月（1～5个月）发生HBVDNA阴转;C组12例患者在治疗（1．33±0．65）个月（1-3个月）发生HBVDNA阴转。挽救治疗有效的患者维持应答〉12个月,治疗期间未发生肾功能损害等明显不良反应。结论拉米夫定治疗后HBVDNA突破患者直接改用阿德福韦酯治疗、先用拉米夫定联合阿德福韦酯再单用阿德福韦酯治疗以及持续拉米夫定联合阿德福韦酯治疗3种方案均是安全有效的。持续拉米夫定联合阿德福韦酯治疗可能是最快和最有效的挽救治疗方案。     

软脂酸对HIT—T15细胞线粒体形态功能和胰岛素分泌的影响

目的观察软脂酸（PA）对HIT-T15细胞凋亡、线粒体结构和功能及胰岛素分泌的影响并探讨可能的机制。方法试验分对照组、0．5 mmol／LPA和1．0 mmol／LPA组,透射电镜观察细胞及线粒体形态,流式细胞仪（FC）和原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡率,高效液相色谱法（HPLC）检测细胞ATP／ADP,RT—PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1（PGC-1）和核呼吸因子1（NRF-1）mRNA,放免法测基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌（GSIS）。结果PA能使线粒体肿胀、嵴破坏;细胞的凋亡率增加,且FC检测高浓度PA组凋亡率增加更显著;ATP／ADP比率下降;PGC-1mRNA和NRF-1mRNA表达增加,高浓度PA组增加更显著;GSIS下降（P均〈0．05）。结论PA导致HIT-T15细胞的线粒体结构和功能的损害及GSIS下降,可能与PGC-1和NRF-1的调节作用有关。