副黏病毒Tianjin株NP蛋白的稳定表达及其检测

目的:构建副黏病毒Tianjin株NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,经G418筛选出稳定表达NP蛋白的细胞.方法:应用RT-PCR技术克隆副黏病毒Tianjin株NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经PCR、酶切和测序鉴定后,将构建的pcDNA3.1(+)-NP用LipofectaminenTM2000转染试剂转染HEK293细胞.应用免疫荧光法及Western Blot检测NP蛋白的瞬时和稳定表达.结果:RT-PCR扩增得到NP基因,重组质粒pcDNA3.1(+)-NP转染HEK293细胞后,经免疫荧光法检测到目的蛋白的瞬时和稳定表达.Western Blot法可见NP蛋白瞬时和稳定表达的条带.结论:副黏病毒Tianjin株NP基因在HEK293细胞可以瞬时和稳定表达,为研究副黏病毒Tianjin株NP蛋白功能与病毒致病性、宿主亲嗜性奠定了基础.     

辣根过氧化物酶标记JWA抗体及其免疫检测反应中应用

目的：运用辣根过氧化物酶标记JWA 单克隆抗体,并且将标记的抗体应用于ELISA法和western blot等免疫检测反应中。方法：运用高碘酸盐-四氢硼化钠氧化还原体系活化辣根过氧化物酶,活化的辣根过氧化物酶按1∶1标记JWA单克隆抗体;将HRP标记的抗体分别运用直接和双夹心ELISA测试;同时将标记单克隆抗体运用于western blot检测。结果：辣根过氧化物酶成功标记JWA单克隆抗体。其中HRP-JWA（4C9）抗体在直接法ELISA试验中和多肽的结合能力高于HRP-JWA（7C3）;其在450 nm处的最大吸光度值为0.96。双夹心ELISA实验中,预先包被JWA（4C9）单抗,检测抗体使用HRP-JWA（7C3）可以得到较好的实验结果,在450 nm处的最大吸光度值为1.30。在western blot实验HRP-JWA抗体浓度1.0μg·mL-1可以检测出SGC7901细胞中目的蛋白。结论：运用氧化还原方法成功标记JWA单克隆抗体,并可以初步应用于免疫反应的检测。     

AIB1蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测法的建立及初步应用

目的 建立双单克隆抗体夹心ELISA方法检测血清中AIB1的水平,探讨其在AIB1蛋白检测中的应用价值.方法 应用抗AIB1-C单克隆抗体4B9F12作为固相抗体,Biotin-1A2E1作为标记抗体,ELISA双抗体夹心法检测AIB1.构建及优化的内容包括:最适包被浓度、最适包被缓冲液、生物素标记抗体工作的浓度;鉴定的指标包括:敏感性、特异性、稳定性等.结果 使用0.05 mo·L-1碳酸盐缓冲液(pH9.6)为包被缓冲液,包被抗体4B9F12工作浓度为10μg·mL-1,Biotin-1A2E1工作浓度选择1∶500;采用双抗体夹心法检测外周血中AIB1的特异性和敏感性均较高.结论 抗AIB1双抗体夹心ELISA方案的构建、鉴定达到了预期目的 ,为临床研究奠定了基础.     

抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用

目的分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)鼠源单克隆抗体的性质,筛选性质和生物学活性较优的抗体,并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。方法分别利用间接ELISA法和Western blot对HPV11的22株单克隆抗体的亚类、与HPV11 VLP的结合能力和构象敏感性进行检测;采用血凝抑制实验对单克隆抗体的血凝抑制活性进行分析;运用基于假病毒的抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行鉴定,选出中和活性高的单抗进行两两配对,采用双抗夹心ELISA法捕获单抗并筛选合适的配对双抗。结果对22株单抗的性质进行了详细和完整的鉴定,并根据构象敏感性进行排序,筛选出6株型别特异、结合活性强且中和活性高的单抗(2A2、4A1-3、16G7、14A6、9C12和19C7);成功建立了基于单抗的双抗夹心(14A6∶Ag∶9C12-HRP)ELISA定量分析方法。结论获得了较全面的HPV11 VLP单抗性质信息,建立了重组HPV11抗原质量分析的双抗夹心ELISA法,为HPV11抗原的生命周期管理或尖锐湿疣疫苗的研发、工艺优化、产品放行和稳定性研究等提供了技术支持。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用

目的  建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV）D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价。方法  以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水。牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体（多抗）和小鼠单抗。以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA。对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证。结果  纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80%和90%以上。经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000、1:10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1:10 000、1:20 000、1:10 000。建立的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4~13.0、0.4~12.0和0.4~20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99。该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应。用该法对高、中、低浓度样品进行测定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值（×100%）分别为97%～111%、91%～104%和95%～102%、相对标准偏差分别为≤7%、≤9%和≤10%;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势。结论  建立了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价。     

基于IgY的ELISA用于囊尾蚴循环抗原的检测

目的 建立基于IgY的双抗体夹心ELISA用于囊尾蚴病的诊断.方法 制备并纯化抗囊尾蚴循环抗原(CA)卵黄抗体(IgY),建立以抗CA的IgY为捕获抗体,酶标记抗CA的单克隆抗体1A5为检测抗体的双抗体夹心ELISA法,共检测样品450份,并与捕获抗体和检测抗体均为单克隆抗体的ELISA法比较,验证方法的敏感性、特异性与实用性.结果 成功制备并鉴定了特异性IgY抗体,建立了基于Igy的双抗体夹心ELISA检测体系.IgY-ELISA和双单抗-ELISA检测囊尾蚴CA的灵敏度分别为8.3 μg/L和13.9 μg/L.IgY-ELISA检测囊尾蚴病患者血清与脑脊液的CA阳性率分别为100％ (139/139)与89.5％ (17/19),囊尾蚴病猪血清的阳性率100％ (222/222),健康人与健康猪血清的阴性率为100％.结论 建立的基于lgY的双抗体夹心ELISA检测囊尾蚴CA用于囊尾蚴病诊断,具有较高的特异性和敏感性,可用于囊尾蚴病的辅助诊断.     

人用狂犬病疫苗ELISA快速鉴别试验的建立及验证

目的:建立人用狂犬病疫苗快速鉴别试验并进行验证。方法:采用双抗体夹心ELISA,以4株抗狂犬病毒核蛋白单抗包被微孔板,通过捕捉检品中狂犬病病毒核蛋白进行快速鉴别试验,对该方法进行特异性、灵敏度、重复性和适用性验证。结果:采用双抗体夹心ELISA进行鉴别试验,验证结果显示该方法具有较高的特异性和灵敏性,RSD<15%,对于不同疫苗生产毒株均可有效鉴别。结论:双抗体夹心ELISA可以替代传统效力试验对人用狂犬病疫苗进行快速鉴别。     

婴幼儿仙台病毒天津株感染的IgM抗体检测及意义

目的:通过对婴幼儿仙台病毒天津株感染的IgM抗体检测,了解人兽共患病原体——仙台病毒对婴幼儿急性下呼吸道的致病情况。方法:观察组为2006年冬季天津市儿童医院0～7岁首诊呼吸道感染患儿83例血清标本,通过间接免疫荧光检测法(IFA)排除了7种常见呼吸道病毒的感染,用自建的酶联免疫吸附法(ELISA)对仙台病毒的IgM抗体进行检测,同时设20例正常儿童血清标本为阴性对照组。结果:观察组16例为阳性,阳性率19.28%。与2004年同期数据44.59%(33/74)相比,本组阳性率有所降低,差异有统计学意义(P<0.01)。IgM抗体检测阳性率1岁内最高,1～3岁和3～7岁组阳性率基本接近,但3组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:仙台病毒在儿科急性呼吸道感染的病原体中占有一定的比例,不可忽视。应对其感染状况进行深入研究。     

双抗体夹心酶联免疫法检测不同样品中的蓖麻毒素

目的应用酶联免疫吸附分析方法（ELISA）检测待测样品中的蓖麻毒素。方法用蛋白G亲和层析柱纯化蓖麻毒素单克隆抗体（4C13,3D74,5E4和5H6）,以3D74及辣根过氧化物酶（HRP）标记的4C13建立的双抗体夹心ELISA对含有蓖麻毒素的多种样品进行检测。结果抗蓖麻毒素的单克隆抗体经亲和层析纯化后具有较高的蛋白纯度,应用HRP标记的4C13与3D74建立双抗体夹心ELISA,对于溶解于磷酸缓冲液中的蓖麻毒素标准品的检测灵敏度可达2．5μg·L^-1;对于土壤、面粉、牛奶、咸菜汁、雪碧、可乐和腐乳汁．中的蓖麻毒素样品检测的灵敏度为2．5-5．0μg·L^-1;与磷酸缓冲液样品相比较,含有相同浓度蓖麻毒素的小鼠和人血清样品ELISA的阳性结果明显减弱．结论双抗体奕心酶联免疫法能够有效用于含有蓖麻毒素样品的检测分析。     

对171例下呼吸道感染患儿的病原学分析

目的:掌握本地区患儿下呼吸道感染的病原体及临床特点以提高治愈率。方法:采用ELISA法做了病毒特异性IgM抗体检测,(流感病毒Flu、呼吸道合胞RSV、腺病毒Adv);肺炎支原体抗体Mp-Ab测定;血EB病毒PCR检测。结果:病毒感染已成为下呼吸道感染的主要病原微生物,年龄越小发病率越高,婴幼儿对于Flu、RSV、Adv和EB病毒普遍易感,随着年龄的增长发病率呈下降趋势;肺炎支原体感染仍以年长儿为主;对于病程较长、病情较重、临床迁延不愈者要注意EB病毒、腺病毒、肺炎支原体感染及耐药菌感染。     

双抗夹心ELISA法快速检测人用狂犬病疫苗的效价

目的：用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法，快速检测人用狂犬病疫苗中的狂犬病毒糖蛋白G的含量，并探讨其替代NIH法的可行性。方法：将疫苗样品用NIH法检定，同时以国家标准品为参考疫苗，用双抗夹心ELISA法检测。结果：用双抗夹心ELISA法测得的IgED50为2．60～2．78；用NIH法测得的IgED50为2．55～2．85。对两种检测方法进行F检验，两种检测方法的灵敏度有显著差异（F=5．76，P〈0．05）；用t检验法对这两种检测方法进行分析，表明两组测定值的差异无统计学意义（t=0．187，P〉0．05）。结论：双抗夹心ELISA法与NIH法测得的IgED50呈正相关性。与NIH法相比，双抗夹心ELISA法具有重复性好、成本低、快速等优点。用双抗夹心ELISA法取代NIH法测狂犬病疫苗效价是可行的。     

天津地区儿童急性呼吸道和消化道感染Saffold病毒的检出和临床流行特征

目的 调查天津地区儿童急性呼吸道和消化道感染中是否存在 Saffold 病毒（SAFV）感染及其流行病学特征。 方法 收集 360 份急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物和 384 份消化道感染患儿粪便标本, 以针对 SAFV 5′-UTR 基因序列设计的特异性引物进行荧光定量 PCR 扩增, 随机取阳性扩增产物进行核苷酸序列测定, 并将所测序列在 GenBank 中进行比对。 计算呼吸道和消化道 SAFV 感染阳性者的阳性率, 不同年龄段及季节的 SAFV 阳性构成比和阳性检出率。 同时考察 SAFV 与其他病毒的混合感染情况。 结果 呼吸道和消化道检测 SAFV 阳性率分别为 11.9%（43/360）和 16.4%（63/384）。 不同性别的呼吸道 SAFV 阳性检出率差异无统计学意义［ 男 、女分别为 11.5% （28/243）和 12.8%（15/117）, χ2=0.13, P > 0.05］, 年龄 6 d～ 12 岁, ＜ 1 岁者占 79.0%（34/43）;消化道检测 SAFV 阳性患儿阳性检出率差异有统计学意义［ 男 、女分别为 13.4%（33/246）和 21.7%（30/138）, χ2=4.47, P＜ 0.05］, 年龄 5 h～ 11 岁。 不同年龄段的呼吸道和消化道 SAFV 阳性检出率差异均无统计学意义。 不同季节呼吸道 SAFV 阳性检出率差异有统计学意义, 以冬季和夏季为主（P＜ 0.01）, 而消化道 SAFV 阳性检出率差异无统计学意义。 呼吸道和消化道 SAFV 与其他病毒混合感染率分别为 7.0%（3/43）和 12.7%（8/63）。 结论 天津地区儿童存在 SAFV 感染, 在急性呼吸道和消化道感染患儿中具有较高的阳性检出率, 且在 1 岁以内患儿中的阳性检出率较高, 应该引起临床重视。     

3041例小儿呼吸道感染血清4种病原特异性IgM抗体检测

目的：探讨深圳地区儿童呼吸道感染肺炎支原体(MP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV）4种病原的感染情况。方法：用EUSA法检测血清上述四种病原特异性IgM抗体。结果：MP、ADV和RSV在深圳地区小儿呼吸道感染性疾病中有较高的检出率。依次MP—IgM(18．51％)、ADV—IgM(13．65％)、RSV—IgM(7.30％)及HV—IgM(3．19％)。随年龄增长4种病原特异性抗体阳性检出率增加。在3—6岁年龄段。喘息性呼吸道感染MP和ADV血清特异性IgM抗体阳性检出率明显高于非喘息性呼吸道感染。下呼吸道感染患儿的交叉感染阳性检出率略高于上呼吸道感染。结论：深圳地区儿童呼吸道感染以MP、ADV占较高比例．常规进行上述四种病原血清特异性IgM抗体检测有助于临床医生合理用药。     

用双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗的效价

目的：用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗中的乙型脑炎病毒包膜蛋白（E）的含量,并探讨其替代蚀斑减少中和试验法的可行性。方法：将疫苗样品用蚀斑减少中和试验法测定,同时选定一批疫苗为参考疫苗,用双抗夹心ELISA法检测。结果：用双抗夹心ELISA法测得的中和指数（TE）为1.595-1.655。用蚀斑减少中和试验法测得的中和指数（TP）为1.367-1.932。经F检测,两种检测方法的灵敏度有极显著差异（F=56.25,P〈0.01）,用t检验法对这两种检测方法进行统计分析,表明两组测定值的差异无统计学意义（t=0.079 3,P〉0.05）。结论：双抗夹心ELISA法与蚀斑减少中和试验法测得的中和指数（T）呈正相关性;与蚀斑减少中和试验法比,双抗夹心ELISA法具有重复性好、成本低、快速等优点。用双抗夹心ELISA法取代蚀斑减少中和试验法测灭活乙型脑炎疫苗效价是可行的。     

反复呼吸道感染对患儿体液免疫功能的影响

目的探讨反复呼吸道感染(RRI)与免疫球蛋白和IgG亚类的关系。方法选取2006年8月至2010年8月符合RRI诊断标准的儿童74例作为RRI组,采用免疫散射比浊法检测血清IgG、IgA、IgM及IgG亚类水平,并与对照组(非RRI的急性呼吸道感染患儿)和正常组进行比较。结果对照组血清IgM水平高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。RRI组血清IgGI、gA水平低于正常组(P<0.05)。RRI组血清IgG2和IgG4水平低于正常组(P<0.05)。对照组血清IgG3水平低于正常组(P<0.05)。结论 RRI普遍存在暂时性体液免疫功能低下;对RRI患儿同时检测血清免疫球蛋白及IgG亚类具有重要意义。     

抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。     

380例呼吸道感染患儿肺炎支原体检测结果分析

目的 分析呼吸道感染患儿肺炎支原体（MP）感染的分布特征,为临床防治提供有效依据。方法 回顾性分析安徽医科大学第一附属医院2017年1~12月收治的呼吸道感染患儿380例临床资料,所有患儿均采用间接免疫荧光法检测了肺炎支原体（MP）IgM,统计分析呼吸道感染患儿MP阳性率及MP感染患儿年龄、性别及季节性分布。结果 380例呼吸道感染患儿中MP-IgM阳性148例,MP阳性率为38.95%;其中女患儿阳性率44.86%高于男患儿31.33%,差异有统计学意义（P<0.05）;MP感染患儿中,学龄前组患儿阳性率最高为58.54%,婴儿组患儿阳性率最低为8.33%,差异有统计学意义（P<0.05）;春夏季MP阳性率高于秋冬季,差异有统计学意义（P<0.05）,其中5月份检出阳性率最高,为58.53%。结论 MP是引起儿童呼吸道感染的重要病原体,呼吸道感染患儿MP感染女性多于男性、以学龄前患儿多见、好发于春夏季。     

小儿反复呼吸道感染与微量元素锌铁的关系

目的探讨小儿反复呼吸道感染与微量元素锌铁含量的临床意义。方法选择我院2009年11月至2010年12月收治的反复呼吸道感染患儿62例,作为观察组,同时选择正常健康体检的患儿63例作为对照组,分别检测两组患儿的Zn、Fe含量的变化情况。结果反复呼吸道感染患儿血清中微量元素锌、铁的含量明显低于健康儿童(P<0.05)。结论血清中微量元素锌、铁含量降低的儿童易反复发生呼吸道感染。     

小儿反复下呼吸道感染的临床病因分析

目的探讨小儿反复下呼吸道感染的致病因素。方法回顾性分析20lO年6月～2012年6月齐鲁石化中心医院反复下呼吸道感染患儿500例的临床资料。结果500例患儿中206例（41．2％）存在基础疾病,其中先天性或获得性呼吸系统解剖异常50例（10．O％）,哮喘40例（8．O％）,呼吸道吸人10例（2．0％）,先天性心脏病16例（3．2％）,免疫缺陷病30例（6．0％）,微量元素缺乏60例（12．0％）;支原体感染125例（25．0％）。结论反复下呼吸道感染患儿多存在基础疾病,最常见的是先天性或获得性呼吸系统解剖异常,其次为哮喘、呼吸道吸入、先天性心脏病及免疫缺陷病;微生物感染主要与肺炎支原体感染有关,需引起重视;有的患儿与微量元素缺乏有关,多见于婴幼儿。     

T7-连接双信号放大技术在儿童肺炎支原体感染检测中的应用

目的 应用T7-连接双信号放大技术监测儿童肺炎支原体感染,探讨其临床应用价值.方法 收集271例急性呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物标本,行T7-连接双信号放大技术检测肺炎支原体RNA,与荧光定量PCR方法比较,分析其灵敏性和特异性.结果 T7-连接双信号放大技术检测时间仅需2～3 h,其灵敏度和可靠性与荧光定量PCR方法相当,但其不需要昂贵的特殊设备,具有实验室前期投入少,线性范围宽,无需内参,直接定量,试剂盒价格便宜等优点.结论 T7-连接双信号放大技术可方便、快速检测肺炎支原体RNA,其检测效能与荧光定量PCR方法相当,适宜临床推广.