人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

Taqman—MGB荧光定量PCR测定饮用水中大肠菌群

目的建立饮用水中大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法。方法以大肠菌群lacZ基因为靶基因,建立Taqman—MGB探针荧光定量PCR定量方法测定饮用水中大肠菌群,并进行方法学评价。结果25山荧光定量PCR反应体系中Mg3＋为5．0mmol／L,dNTPs0．2mmol／L,引物0．2μmol／L,探针0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶2．0U,加入样品模板5μl。检测方法的特异性、重复性好,灵敏度高,可检出单个拷贝大肠菌群模板。结论所建立荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异检测饮用水中大肠菌群。     

荧光定量PCR检测细胞代谢综合征相关基因表达的优化

目的优化MRSG mRNA表达的Taqman荧光定量PCR检测反应体系并进行系统评价。方法设计荧光PCR适用的引物和探针,从模板、引物、探针、镁离子浓度等方面优化荧光定量PCR检测反应体系,评价优化系统的特异性和稳定性。结果确定系统的模板取样量为2μl,引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,Mg~（2＋）浓度为4mM,建立了稳定的MRSG mRNA表达的Taqman荧光PCR检测方法。结论优化后的MRSG mRNA荧光PCR检测方法特异性和稳定性较好。     

无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

目的：探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性（SNP）的实用性．方法：采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型．以其-597G〉A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg^2＋浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化．并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证．结果：结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg^2＋浓度为2．5mmol／L,不对称PCR引物比例为0．1／0．5umol／L,模板浓度为10ng／10uL的两步法不对称PCR．该体系对100例样本进行IL-6基因～597G〉A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致．结论：无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法．     

ACACB基因rs2268388多态性检测的实验条件

［摘要］目的　建立一种快速、准确、特异的定量检测ACACB基因rs2268388多态性的方法．方法　针对ACACB基因序列设计引物和Taqman探针,探索实时荧光定量PCR技术检测ACACB基因rs2268388多态性的最佳条件,设立不同浓度,并检测其灵敏度和特异性．结果　 PCR反应预变性时间为10 min,退火、延伸时间为1 min时扩增产物效果理想． Taqman实时荧光定量PCR探针及引物浓度 0.5 μL （ 0.2 μM）,TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL ,dH2O 2.5 μL总体系为10 μL时扩增产物效果理想并节约了实验费用,检测特异性良好．结论　优化Taqman探针法的实验条件能够灵敏、特异、稳定地对ACACB基因rs2268388多态性进行定量检测,并有效节约了实验成本.     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法,并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立SV5实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL,灵敏度为6．8copy／μL,批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％,批间CV为1．52％-12．38％,而且方法特异性好;在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。     

TaqManPCR快速检测食品中空肠弯曲菌

目的：利用荧光定量PCR技术,建立食品中空肠弯曲菌污染的快速检测方法。方法：以空肠弯曲菌的hipO基因为靶序列,设计引物和探针,优化引物、探针浓度比和Mg2＋浓度,对反应体系进行评价。并初步应用于样品的检测。结果：所建反应体系特异性、敏感性和稳定性良好。定量检测低限15efu／ml。结论：建立了适用于食品中空肠弯曲菌污染快速检测的荧光定量PCR方法。     

HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立基于Taq Man探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法。方法收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和Taq Man探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型。结果实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型。这一结果与基因测序方法结论完全一致。结论基于Taq Man探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值。     

地佐环平对边缘叶癫痫发作大鼠海马P-糖蛋白表达的影响

目的 观察兴奋性谷氨酸受体（NMDA受体）拮抗剂地佐环平（MK801）对边缘叶癫痫大鼠发作后P-糖蛋白（P—gp）表达的影响,探讨NMDA受体是否能对癫痫发作后P—gp表达进行调控。方法 制备氯化锂．匹罗卡品癫痫发作大鼠模型,60只大鼠,随机分为6组：对照组、癫痫发作终止后0、3、6、24和72h组,用实时荧光定量RT-PCR检测癫痫大鼠发作终止后不同时程海马组织P—gp mRNA的表达。另取60只大鼠随机分为对照组、癫痫持续状态发作模型（SE）组、MK801干预组,各组均分为发作终止后6h和24h时间点。用实时荧光定量RT—PCR检测癫痫发作终止后6h大鼠海马P-gp mRNA的表达,用免疫组化检测大鼠癫痫发作终止后24h海马组织P—gp蛋白的表达。结果 癫痫发作终止后72h内的所有动物海马组织多药耐药基因1a（mdr1a）的表达均显著高于对照组,SE终止即刻其表达显著升高[5．6（2．9）×10^5 mRNA拷贝数／40ng总RNA,P〈0．05],SE终止后3h时其表达进一步升高[7．6（6．3）×10^5,P〈0．01],此后至SE终止后72h,mdrla mRNA的表达一直维持在该水平;mdr1b的表达在边缘叶发作动物呈一过性增高,发作终止后3、6h[分别为（3．3±0．4）×10^4和（3．6±1．0）×10^4,为对照组的2．2、2．4倍]均明显高于对照组（P〈0．01）。另外,在发作终止后6h时,MK801组mdr1a[（4．3±0．8）×10^5]和mdr1b[（2．0±0．7）×10^4]基因表达明显低于SE组（P〈0．01）;发作终止24h时,MK801组P—gp[（26．6±5．0）个微血管／400倍视野]蛋白表达也明显低于SE组[（39．0±4．1）个微血管／400倍视野,P〈0．01]。结论 NMDA受体拮抗剂MK801下调癫痫大鼠发作后P-gp的过度表达,提示NMDA受体可能参与癫痫发作过程中P—gp表达的调控,有效抑制NMDA受体的过度活化可能有助于防止癫痫发作后P—gp的过度表达。     

甲基莲心碱联合mdr 1shRNA对K562/A02 细胞mdr 1/P gp表达的影响

目的：探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr 1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr 1/ P gp表达的影响。 方法：采用MTT方法比较Nef,mdr 1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT PCR和Western印迹法检测mdr 1/P gp的表达。 结果：Nef与mdr 1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr 1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr 1/P gp表达的抑制作用强于单独处理组（P＜0.01）。 结论：甲基莲心碱能增强mdr 1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr 1/P gp表达的抑制作用,逆转mdr 1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。     

急性白血病患者多重耐药基因检测的临床意义

目的 :结合临床化疗效果探讨白血病多重耐药 ( mdr)的诊断方法。方法 :采用流式细胞术检测白血病细胞内药物浓度和原位杂交技术检测白血病 mdr基因的表达。结果 :1 2例难治及复发患者柔红霉素 ( DNR)的平均浓度为 ( 4 4.80± 7.74) %,而 1 0例初治完全缓解患者 DNR的浓度为( 80 .0 1± 2 .1 0 ) %,两组比较差异有显著性 ( P<0 .0 1 ) ,且 1 2例难治及复发患者 mdr1基因表达结果除 4名阴性外 ,其他均为阳性 ,而 1 0例初治完全缓解患者 mdr1基因表达均为阴性。结论 :两种检测方法联合检测白血病 mdr,能初步筛选急性白血病 mdr的类型 ,对临床化疗方案选择具有指导意义     

Reversal of Multi-Drug Resistance by Vector-Based-ShRNA-Mdr1 In Vitro and In Vivo

In order to investigate the effects of vector-based hairpin small interference RNA (shRNA) on the reversal of multi-drug resistance (mdr) of A2780/Taxol cells, a novel vector pEGFP-H1/mdr1 containing mdr1-shRNA targeting at position 2943-2963 of mdr1 was designed and synthesized.Subsequently, A2780/Taxol cells were transfected with pEGFP-H1/mdrl, and the expression of mdr1 mRNA and P-gp was detected by using RT-PCR and Western blot respectively. MTT was used to measure the 50% inhibition concentration (1C50) of Taxol to A2780/Taxol cells. The results showed that at the 24th and 48th h after transfection, the expression of mdr1 mRNA was decreased to (52.1±1.0)% and (0.01+1.7)%, and that of P-gp decreased to (88.3±2.1)% and 0%, respectively. At the 48th h after transfection, the relative reversal rate of A2780/Taxol cells to Taxol was 69.54%. In vivo, the nude mice xenografts were injected with pEGFP-H1/mdrl, and then administrated Taxol.The tumor volume in pEGFP-H1/mdr1-transfected group was significantly reduced as compared with that in blank control group or pEGFP-H1-transfected group (807.20±103.16 vs 1563.78±210.54 or 1480.78±241.24 mm3, both P<0.01). These results suggested that transfection of pEGFP-H1/mdr1 could efficiently down-regulate the expression of mdr1 mRNA and P-gp in A2780/Taxol cells, and effectively restore the sensitivity of A2780/Taxol cells to Taxol both in vitro and in vivo.     

Reversal of multi-drug resistance by vector-based-ShRNA-Mdr1 <Emphasis Type="Italic">In Vitro</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">In Vivo</Emphasis>

In order to investigate the effects of vector-based hairpin small interference RNA （shRNA） on the reversal of multi-drug resistance （mdr） of A2780/Taxol cells, a novel vector pEGFP-HI/mdrl containing mdrl-shRNA targeting at position 2943-2963 of mdrl was designed and synthesized. Subsequently, A2780/Taxol cells were transfected with pEGFP-H1/rndrl, and the expression ofmdrl mRNA and P-gp was detected by using RT-PCR and Western blot respectively. MTT was used to measure the 50% inhibition concentration （IC50） of Taxol to A2780/Taxol cells. The results showed that at the 24th and 48th h after transfection, the expression of mdrl mRNA was decreased to （52.1±1.0）% and （0.01±1.7）%, and that of P-gp decreased to （88.3±2.1）% and 0%, respectively. At the 48th h after transfection, the relative reversal rate of A2780/Taxol cells to Taxol was 69.54%. In vivo, the nude mice xenografts were injected with pEGFP-H1/mdrl, and then administrated Taxol. The tumor volume in pEGFP-H1/mdrl-transfected group was significantly reduced as compared with that in blank control group or pEGFP-Hl-transfected group （807.20±103.16 vs 1563.78±210.54 or 1480.78±241.24 mm^3, both P〈0.01）. These results suggested that transfection of pEGFP-HI/mdrl could efficiently down-regulate the expression of mdrl mRNA and P-gp in A2780/Taxol cells, and effectively restore the sensitivity of A2780/Taxol ceils to Taxol both in vitro and in vivo.     

青蒿琥酯对胃癌耐药细胞SGC7901/mdr1阿霉素耐药性的影响

目的以胃癌细胞SGC7901为对照,观察青蒿琥酯(Art)对胃癌耐药细胞SGC7901/mdr1的阿霉素耐药性的影响。方法四甲基偶氮唑蓝法检测Art耐药逆转性,将培养的SGC7901和SGC7901/mdr1细胞加入不同浓度的Art,确定Art逆转SGC7901/mdr1细胞阿霉素耐药性的浓度;加入不同终浓度的阿霉素并不断调整,直至对SGC7901/mdr1和SGC7901细胞的抑制范围均涵盖50%的抑制率,确定阿霉素的实验浓度;2种细胞均加入确定好的不同浓度阿霉素,SGC7901细胞设为亲本对照组,SGC7901/mdr1细胞分为2组,加入确定耐药逆转Art浓度的设为实验组,不加Art的设为Art阴性对照组,判断Art对耐药细胞SGC7901/mdr1的耐药逆转效果。结果 Art对SGC7901和SGC7901/mdr1细胞均有生长抑制作用,不同浓度Art之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);Art对SGC7901/mdr1的50%抑制浓度高于SGC7901细胞(P<0.05);Art对SGC7901/mdr1和SGC7901细胞20%抑制浓度的差异无统计学意义(P>0.05),取二者的平均值110 mg·L-1作为Art对SGC7901/mdr1细胞的耐药逆转浓度。涵盖SGC7901/mdr1和SGC7901细胞50%抑制率的阿霉素质量浓度为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1。SGC7901/mdr1细胞实验组、Art阴性对照组和亲本对照组的细胞生长抑制率随阿霉素浓度的不断增加而增高,不同浓度阿霉素之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);阿霉素对实验组细胞的50%抑制浓度低于Art阴性对照组(P<0.05),与亲本对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Art对耐药细胞SGC7901/mdr1的耐药逆转倍数约为2.31倍,相对逆转率约为83.00%。结论 Art对SGC7901/mdr1有生长抑制作用;Art可以逆转耐药细胞SGC7901/mdr1对阿霉素的耐药性。     

Expression of the human multidrug resistance gene mdr1 in leukemic cells and its application in studying P-glycoprotein antagonists

Objective To explore the role of endothelin (ET) in the pathogenesis of exercise-induced asthma (EIA), we investigated the effects of ET(B) receptor antagonists, ET-1 (11-21)fragment and N-cis-2,6-dimethylpi-peridinocardonyl-L-γ-methylleucyl-D-1-methoxycarbonyl tryptophanyl-D-norleucine (BQ788) on broncho-constriction elicited by isocapnic hyperpnea in guinea pigs. Methods Eighteen pathogen-free Hartley guinea pigs were randomly divided into three groups. A: normal saline (NS) inhalation control group (n=6), B: BQ788 group (n=6), and C: ET-1(11-21) fragment group (n=6). Guinea pigs were anesthetized with pentobarbital sodium. After measuring the basal value of lung resistance (R[L]) and dynamic compliance of the respiratory system (Cdyn), NS (0.96 ml), BQ788 (9 nmol) and ET-1(11-21)fragment (9 nmol) were inhaled. A rodent respirator with a dry 5%CO(2)-95%O(2) mixture at room temperature provided mechanical ventilation (V[T] 8 ml/animal, 100 breaths/min) for 5 min. R[L] and Cdyn of the 3 groups were measured again after isocapnic hyperpnea challenge. Results In the control group, isocapnic hyperpnea of dry gas elicited a marked increase in R[L] and decrease in Cdyn. R[L] and Cdyn of the guinea pigs from BQ788 group and ET-1(11-21)fragment group did not change significantly. Conclusion It was demonstrated that selective ET(B) receptor antagonists, ET-1(11-21) fragment and BQ788, inhibited the bronchoconstriction induced by isocapnic hyperpnea in guinea pigs. The data showed that ETs are potent constrictors of guinea pig airway smooth muscle via a direct effect on ET receptors. It was suggested that ET receptor antagonists, especially ET(B) receptor antagonist, might be beneficial in preventing EIA.     

Chemoprotection of transfer of multidrug resistance gene into human hematopoietic progenitor cell

Ｍｏｓｔｏｆｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃｍａｌｉｇｎａｎｃｅｓａｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔｈｅｍａｉｎｄｏｓｅ ｒｅｌａｔｅｄｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｍａｎｙｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｒｕｇｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｔｈｉｓｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｕｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎａｌｓｕｐｐｏｒｔ,ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ,ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｃｕｅ ,ａ…