辐射联合外源性野生型p53基因对不同p53状态的黑色素瘤细胞系的生物学效应

目的研究辐射结合腺病毒（Ad CMV）载体介导的p53基因转导对不同p53状态的人黑色素瘤细胞系基因转移效率、凋亡和辐射敏感性的影响。方法用复制缺陷的重组腺病毒载体（AdCMV-p53）介导入p53基因转导1Gy X射线预照射的黑色素瘤细胞系A375（wt p53）和WM983a（mu p53），RT-PCR检测mRNA水平，流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况，Tunel法检测细胞凋亡，克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照。结果1Gy X射线照射可较高地增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率，转导的外源性野生型p53可在两种细胞中高效表达，并诱导细胞周期G1期阻滞；单纯转导p53对A375（wt p53）细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应，但可部分诱导WM983a（mu p53）细胞凋亡；而转导p53基因48h后给予X射线辐射，两种细胞的克隆存活率较其对照组均明显减低，外源性p53基因对WM983a（mu p53）细胞的辐射增敏作用较A375（wt p53）细胞明显。结论外源性野生型p53基因过表达可增加黑色素瘤细胞系A375和WM983a的辐射敏感性，但对WM983a细胞系的辐射增敏作用高于A375细胞系。表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的候选基因。     

METTL3对肝内胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨m6A甲基转化酶样蛋白3(METTL3)对肝内胆管癌细胞系QBC939和RBE细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,以及可能的分子机制.方法 通过嘌呤霉素筛选的方法将携带METTL3基因的重组质粒转染肝内胆管癌细胞系QBC939和RBE,得到稳定过表达METTL3的肝内胆管癌细胞系;采用小干扰RNA(siRNA)瞬时敲低肝内胆管癌细胞系中的METTL3;采用Western印迹检测肝内胆管癌细胞系中METTL3蛋白的表达水平,验证过表达和敲低METTL3的效果;采用细胞增殖实验(CCK-8法)检测METTL3对肝内胆管癌细胞系增殖能力的影响,Transwell法验证METTL3对肝内胆管癌细胞系迁移和侵袭能力;采用Western印迹检测过表达或敲低METTL3后p-ERK蛋白的表达水平,Log-rank检验比较METTL3高表达组和低表达组胆管癌患者的生存期差异.结果 过表达METTL3可显著促进QBC939和RBE细胞的增殖、迁移及侵袭能力,而敲低METTL3显著抑制QBC939和RBE细胞的增殖、迁移及侵袭能力.过表达METTL3促进磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)的蛋白表达水平,而敲低METTL3则抑制p-ERK的蛋白表达水平.METTL3在肝内胆管癌组织中上调表达,且其高表达与胆管癌患者的不良预后可能相关.结论 METTL3通过促进肝内胆管癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力而发挥癌基因的功能.     

腺病毒介导凋亡素基因转染对人胆管癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响

目的:初步探讨在凋亡素基因转染引发人胆管癌细胞凋亡的同时对Bcl-2蛋白的影响。方法:采用含凋亡素基因的重组腺癌毒感染人胆管癌细胞株QBC939,通过光镜、荧光观察其凋亡情况,在感染后7d收集细胞,采用Western-blot检测其Bcl-2蛋白情况。结果:含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC9397d后其Bcl-2蛋白的表达较空病毒组和空白对照组明显降低。结论:凋亡素基因在诱导人胆管癌细胞凋亡时会导致Bcl-2蛋白的降低,可能有助于凋亡素的作用。     

重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的作用及辐射敏感性的影响

目的 探讨重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及其辐射增敏性。方法 利用四氮唑盐(MTT)比色法分析重组人p53腺病毒注射液、放射治疗以及两者联合应用对人淋巴瘤细胞Raji 和Daudi的抑制作用;通过蛋白质的Western印迹分析法(Western blotting)分析淋巴瘤细胞内P53蛋白的表达;应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴瘤细胞内p53基因的mRNA表达。结果 MTT结果显示重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞具有一定的抑制作用,但抑制作用不显著,Raji 及Daudi 细胞最大剂量的抑制率分别为27.5%±4.1%和28.1%±1.6%,也未见明显的辐射增敏效应。Western blotting和RT-PCR结果表明,外源性P53蛋白和p53基因的mRNA均有所表达,但未见高效表达和明显的辐射增敏性。结论 重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及辐射增敏性不显著。     

p53腺病毒重组体转染对p53缺失肿瘤细胞辐射敏感性的影响

目的观察p53腺病毒重组体（AdCMV-p53）转染对p53缺失肿瘤细胞辐射敏感性的影响。方法用腺病毒重组体（AdCMV—p53／GFP）转染经0、0．25、0．5、1．0、1．5、2．0Gyγ射线辐射的H1299（nullp53）和PC-3（nullp53）细胞，用流式细胞分析法检测外源性p53表达，用克隆形成法检测肿瘤细胞增殖能力。结果辐射联合AdCMV-p53转染组p53阳性细胞所占比例均明显高于单纯辐射组、单纯AdCMV—p53转染组和辐射联合AdCMV—GFP转染组同种细胞p53阳性率（P〈0．05）；AdCMV—p53转染不仅明显提高肿瘤细胞辐射敏感性，而且与肿瘤细胞组织来源有关。结论p53腺病毒重组体转染对p53基因缺失肿瘤细胞低剂量辐射敏感性的增强作用与肿瘤细胞来源的组织器官和细胞类型有关。     

腺病毒介导p53基因转染增加人胃癌细胞的放射敏感性

目的评价腺病毒介导p53基因(Adp53)转染对人胃癌细胞的凋亡效应和放射增敏作用。方法以重组腺病毒介导p53基因感染4种不同p53状况的人胃癌细胞，用免疫组织化学法和Western blot法检测P53蛋白在胃癌细胞中的表达；用细胞集落形成法检测细胞存活率；用TUNEL法检测细胞凋亡。胃癌细胞感染Adp53后照射4Gy，用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡；胃癌细胞种植肿瘤内注射Adp53后照射6Gy，以肿瘤相对体积增长曲线观察肿瘤抑制情况。结果1：100效靶比(MOI)Adp53产生细胞高转染率，以及p53基因在4种胃癌细胞中均高表达，并产生G2/M期阻滞、凋亡增加和细胞增殖抑制。如果以凋亡评价放射效应，Adp53转染对4Gy照射4种细胞的凋亡率比值为：W细胞3．0，M细胞3．6，neo细胞2．2，823细胞2．5。体内实验结果显示，Adp53对w细胞肿瘤6Gy照射的抑瘤率比值为1．41，而对M细胞肿瘤为1．91。结论腺病毒介导p53基因转染产生细胞凋亡并提高人胃癌细胞的放射敏感性，这种作用不依赖于细胞内在的p53状况。     

p16基因转染对胰腺癌细胞生长及辐射敏感性的研究

目的 探索p16基因转染对胰腺癌细胞生长辐射敏感性的作用。方法 将外源野生型p16基因连接到pCDNA3.1^＋载体构建pCDNA3.16＋ -p16重组质粒,利用Lipofectamine^TM介导转染胰腺癌JF305细胞,筛选阳性克隆。照射后,RT-PCR检测p16基因表达,Western blot检测蛋白表达;用MTT法测定细胞生长曲线和肿瘤细胞杀伤率。结果 转染p16基因的JF305细胞有外源p16基因的整合及表达,生长速度明显减少,对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胰腺癌细胞恶性增殖,提高胰腺癌细胞对辐射的敏感性。     

胆管癌细胞层粘连蛋白受体表达下调对蛋白水解酶MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响

研究层粘连蛋白受体（laminin receptor,LNR)反义寡核苷酸硫代修饰片段（AS－OD）对人胆管癌QBC939细胞MMP－2，MMP－9基因表达的调节，应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法分析12μmol/L浓度的LNR AS－OD在作用72h后对QBC939细胞MMP－2，MMP－9，mRNA表达水平的影响，结果显示，LNR AS－OD能明显抑制人胆管癌细胞表达MMP－2，MMP－9的作用，与正常对照组相比，其MMP－2，MMP－9 mRNA相对丰度分别下降了33．2％，和23．9％（P＜0．05），研究表明，LNR AS－OD是胆管癌细胞表达MMP－2和MMP－9基因的调节剂，能抑制胆管癌细胞MMP－2，MMP－9基因的表达，本研究为预防和治疗胆管癌的侵袭和转移提供了新的途径和方法。     

KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体的影响

目的研究KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体(LNR)表达的影响。方法体外培养人胆管癌QBC939细胞,分为两组:转染空载体pIRES2-EGFP对照组和转染重组真核载体pIRES2-EGFP-KAI1实验组。采用脂质体转染法分别将空载体和重组真核载体转染到QBC939细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。通过RT-PCR、Western blotting和细胞免疫组化法,分别检测KAI1、LNR的mRNA及蛋白表达水平。结果实验组的KAI1 mRNA、蛋白表达量(分别为0.49±0.071、.06±0.05)均显著高于对照组(分别为0.22±0.02、0.59±0.02,P<0.01);实验组的LNR mRNA、蛋白表达量(分别为0.38±0.04、0.29±0.03)均显著低于对照组(分别为0.73±0.05、0.68±0.02,P<0.05)。与对照组比较,实验组KAI1蛋白在胞质的着色明显增强、LNR着色减弱。结论体外胆管癌QBC939细胞过表达KAI1可导致LNR mRNA和蛋白表达下调。     

p16基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的：探讨p16抑癌基因对涎腺腺样囊性癌（SACC）细胞系增殖的影响。方法：通过脂质体介导的基因转染方法，将p16基因导入涎腺腺样囊性癌细胞系，观察转染组、空载体组和未转染组细胞的生长情况。结果：转染p16基因的细胞系，其细胞生长速度，DNA合成，细胞增殖能力均下降，而未转染组则有相反结果。结论：p16基因能抑制涎腺腺样囊性癌细胞系的增殖。     

照射后不同p53基因状态胃癌细胞的G1期阻滞和凋亡

目的　评价抑癌基因ｐ５３（ 野生型ｐ５３） 对照射后人胃癌细胞系（ＢＧＣ８２３） 的Ｇ１ 期阻滞和凋亡的控制作用。方法　３ 种具有不同ｐ５３ 状态的人胃癌细胞系,即转染人野生型ｐ５３ 基因的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞、转染人突变型ｐ５３ 基因的ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 细胞和转染无ｐ５３ 基因的空载质粒的ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞,用流式细胞计分析细胞,４Ｇｙ 照射后０、８ 和２４ 小时后各细胞时相分布和凋亡的反应。结果　照射４Ｇｙ 后８ 小时和２４ 小时后的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞出现强烈的Ｇ１ 期阻滞（分别占原细胞总数的６７－９％ 和６１－１ ％） ,而ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 、ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞几乎没有Ｇ１ 期阻滞;照射４Ｇｙ 后８ 小时和２４ 小时后的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞出现明显的预示凋亡的亚Ｇ１ 峰,凋亡细胞比例分别达１３－０ ％ 和１５－３ ％ ;而ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 和ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞几乎没有出现亚Ｇ１ 峰和凋亡细胞比例都为零。结论　野生型ｐ５３ 基因具有促进照射后肿瘤细胞的Ｇ１ 期阻滞和凋亡作用,而ｐ５３ 变异和缺失则减低了肿瘤细胞对放射线的反应。     

HCMV的IE2介导野生型p53基因促凋亡作用的研究

选择野生型P53缺失型的Jurkat细胞系，首先将wt-p53-pLXSN稳定转染入Jurkat细胞（Jurkat-wt-p53),再分别或联合转染TE1，TE2基因，并利用流式细胞仪分析。结果显示，转染了IE2基因的Jurkat-wt-p53细胞在瞬时转染24h后出现光镜下可见的细胞凋亡改变，此时取样进行流式细胞仪测定细胞周期分布状况，可见转染了IE2基因的Jurkat-wt-p53细胞周期分布较其他各组发生了明显的 变化，G1期和S期细胞分布减少，而G2期细胞增多，细胞阻滞于G2／M期，并且出现了细胞凋亡亚二倍体峰,引起细胞凋亡。研究表明，在Jurkat 细胞中HCMV的IE2基因可介导野生型P53基因的促凋亡作用。     

外源性野生型p53基因对不同p53功能状态的人肺腺癌细胞株的放射增敏作用

目的 观察外源性野生型p53基因(wtp53)对人肺腺癌细胞株的放射增敏作用,比较不同p53基因状态对照射的影响。 方法 免疫组织化学法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP法)筛选p53基因状态不同的两种人肺腺癌细胞系A549及GLC-82,用腺病毒介导wtp53 (Ad-p53)转染后分别给予0、2和4 Gy照射,测定集落形成率,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡。结果 A549细胞的p53基因正常,而GLC-82细胞的p53基因第7外显子突变,转染后wtp53在两种细胞内均成功表达。Ad-p53对A549及GLC-82细胞抑制率分别为55%和88%,对GLC-82抑制作用较强(P<0.01)。转染Ad-p53后照射,两种细胞集落形成率较对照组明显下降(P<0.001)。流式细胞仪分析Ad-p53使G₁期细胞比例增加和凋亡指数增高,Ad-p53＋照射组最为明显(P<0.001)。结论 Ad-wtp53可以抑制人肺腺癌细胞株的生长,增加其放射敏感性,其放射增敏作用并不依赖于细胞内源性p53基因的状态。     

外源性p53对不同LET辐射诱导人黑色素瘤细胞系A375死亡途径的影响

目的 观察外源性P53蛋白对不同传能线密度(LET)射线辐照诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的影响,并探讨其可能的机制。方法 人黑色素瘤细胞系A375(wild-type p53)经携带人野生型p53基因的腺病毒载体(AdCMV-p53)感染后分别给予X射线和碳离子束照射,采用克隆形成法测定细胞辐射敏感性,Hoechst 33258和吖啶橙-溴化乙锭双染荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死。结果1高LET辐照时,A375细胞和转导人野生型p53基因的A375细胞(A375/p53)的辐射敏感性没有明显差异;2虽然辐射诱导细胞凋亡比例的增加依赖于LET升高,但是无论高LET或低LET,外源性P53蛋白均可有效诱导细胞凋亡。3高LET辐照时,A375细胞的坏死细胞明显高于A375/p53细胞。结论 尽管高LET辐射对A375和A375/p53细胞的存活无明显影响,但是对细胞凋亡的诱导却部分依赖于P53蛋白的功能,P53蛋白可能在调节细胞死亡类型中发挥重要作用。这对临床应用高LET辐射联合p53基因治疗恶性黑色素瘤有一定参考意义。     

Apoptosis of murine melanoma cells induced by heavy-ion radiation combined with Tp53 gene transfer

PURPOSE: To investigate the effect of exogenous wild type p53 (Tp53) on murine melanoma B16 cell apoptosis induced by carbon-ion beam (C-beam) irradiation. MATERIALS AND METHODS: The murine cell line B16, which has wild-type Tp53 gene status was studied, as well as B16 cells transfected with an adenoviral vector containing the wild-type Tp53 gene (B16/Tp53). Cells were irradiated with C-beam and assayed for cell survival (colony-forming assay), cellular morphology (acridine orange assay), the frequency of apoptotic cells (fluorescence microscopy) and protein expression (Western blot analysis). RESULTS: The radiosensitivity of B16/Tp53 cells was significantly higher than that of B16 cells. In contrast with Tp53 transfer alone, the combination of C-beam with Tp53 transfer induced a higher proportion of apoptotic cells and micronuclei. After C-beam irradiation, there was no significant increased expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 and Tp53 in B16/Tp53 cells compared to B16 cells, but a decreased expression of murine double minute-2 (Mdm2) was observed. CONCLUSION: The results of this study suggest the potential application of C-beam combined with Tp53 in the treatment of melanoma in human patients.     

Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。