土拉弗朗西斯氏菌PCR—EIA检测技术的研究

目的：建立操作简便、结果客观的微孔板杂交－酶联显色检测土拉弗朗西斯拉菌ＰＣＲ产物的技术。方法；将ＰＣＲ产物或产物的克隆作为捕获探针包被聚乙烯微孔板，ＰＣＲ引物５‘末端生物素标记，扩增后用作探针杂交，通过比较影响微孔板杂交的包被，杂交和显色等因素，建立ＰＣＲ－ＥＩＡ技术。结果：通过比较包被缓冲液发现镁离子及其离子强度是影响ＤＮＡ包被的重要；包被的ＤＮＡ以线型质粒较佳，每孔包被３００ｎｇ左右的ＤＮＡ包     

嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究

根据嗜肺军团菌基因组ＤＮＡ的种特异性ＤＮＡ片段序列，合成一对引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。经琼脂糖凝胶电泳、ＥＢ染色结果表明，一条８７０ｂｐ的核苷酸区带为嗜肺军团菌１～１４血清型菌株所共有。ＰＣＲ检测水中军团菌，其敏感性为３５０ｃｆｕ／ｍｌ，而用同位素标记探针、斑点杂交法检测，其敏感性为４３ｃｆｕ／ｍｌ。ＰＣＲ检测人工感染嗜肺军团菌的豚鼠组织标本，阳性率为８３．３％，而细菌分离培养的阳性率仅为２６．６％。在现场调查中，用ＰＣＲ法初步验证了一起由Ｌｐ１０引起的军团菌病爆发。上述结果表明，ＰＣＲ法能快速、敏感、特异性检测嗜肺军团菌感染。     

幽门螺杆菌感染的细菌学培养、PCR检测及ELISA法诊断的比较研究

对２０８例在北京天坛医院做骨镜检查的胃病患者，采集胃粘膜活检标本，进行幽门螺杆菌培养，阳性率为１８．７５％；用胃粘膜组织作病理切片，经基姆沙染色镜检，有３８．９４％检出幽门螺杆菌；提取组织中幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ做多聚酶链反应（ＰＣＲ），幽门螺杆菌检测阳性单为４３．２７％。此三种检测方法结合使用，幽门螺杆菌检测阳性率达６１．０６％。同时，采集病人的静脉血，用ＥＬＩＳＡ法测定血清中抗幽门螺杆菌尿毒酶抗体（ＩｇＧ），抗体检测阳性率为６０．１０％，幽门螺杆菌检测阳性的病人（培养或病理切片或ＰＣＲ检测），抗体检测阳性事为７２．４４％，幽门螺杆菌检测阴性的病人．血清抗体检测阳性率为１６．０５％，两者之间的差别具有显著性（Ｐ＜０．００１）．     

太原地区妇女儿童淋球菌感染调查及基因快速诊断

改进并建立快速检测淋球菌基因的聚合酶链反应，同时用涂片染色筛查和培养法作鉴定比较，对太原地区１９８６￣１９９５年妇女儿童淋球菌感染状况作调查分析，对９２０４例妇女儿童生殖道感染者作直接涂片染色检菌，阳性率为２６．５％，其中１２２０例同时用培养与ＰＣＲ法检测，阳性率为１２．４％和２１．０％，用ＰＣＲ直接检测临床标本ＮＧ－ＤＮＡ，具有简便，快速、敏感特异之优点。     

随机引物多聚酶链反应对细菌分型的价值及影响因素探讨

随机引物多聚酶链反应对细菌分型的价值及影响因素探讨高瞻，ＫａｔｈｙＪａｃｋｓｏｎ，ＤａｖｉｄＥ．Ｌｅｓｌｉｅ’踌机引物多聚酶链反应（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡＰＣＲ，简称ＲＡＰＤＰＣＲ）是在对所扩增基因一无所知的情况...     

聚合酶链反应诊断小儿支原体肺炎及其意义

笔者用聚合酶链反应技术对７０例小儿支原体肺炎鼻咽分泌物中肺炎支原体ＤＮＡ进行检测，采用快速制备ＤＮＡ模板的方法，简化了ＰＣＲ实验过程，结果５３例阳性，阳性率７５．７％，而用支原体培养方法，阳性率仅５３．８％（Ｐ〈０．０５），差异有显著性，对其中１３例ＰＣＲ阳性患者经红霉素静脉滴注治疗１０～１４天后，复测ＰＣＲ，８例转阴性，５例仍为阳性，该方法既保持了ＰＣＲ的酶感性和特异必，又简化过程，能够检测到相     

用套式PCR检测b型流感嗜血杆菌

为快速 ，准确地诊断ｂ型流感嗜血杆菌感染，用Ｈｉｂ英膜型特异ＤＮＡ３条引物与氨基甲酸酯杀虫剂复配套式ＰＣＲ扩增Ｈｉｂ，并用Ｈｉａ、ｃ－ｆ英膜标准菌及４种其它细菌对作对照。     

多聚酶链反应在阿米巴病流行病学研究中的应用

用两对引物扩增（ＰＣＲ）溶组织内阿米巴带囊者粪便中的ＤＮＡ，以鉴别感染虫株的致病性，致病和非致病性ＰＣＲ均为阳性者１人（３．１％），仅一项阳性者分别为６人（１８．８％）和２５人（７８．１％）。７例致病性ＰＣＲ阳性者中，６人有腹泻症状（ＯＲ＝３１．５）。各种对照标本均呈ＰＣＲ阴性反应。以ＰＣＲ法对一小样本人群进行阿米巴病调查，致病和非致病虫株的感染率均为１０％。结果表明，在阿米巴病流行病学调查中，可     

泉州地区肝炎患者TTV感染状况调查

「目的」了解泉州地区各型肝炎患者ＴＴＶ感染情况。「方法」设计特异性引物采用巢式ＰＣＲ方法对５７例肝炎患者及２０例健康献血员的血清标本进行ＴＴＶＤＮＡ检测。「结果」肝炎患者ＴＴＶＤＮＡ阳性率为１５．８％,其中乙型肝炎（或重叠丁型肝炎）患者ＴＴＶＤＮＡ阳性率为２５．０％（６／２４）,非Ａ－Ｇ型肝炎患者ＴＴＶＤＮＡ阳性率为１３．６４％（３／２２）,甲、戊型肝炎患者未检出;健康献血员为３５．０％。ＴＴＶＤ     

聚合酶链反应技术诊断念球菌的进展

多聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测无菌源（血液、脑脊液、腹腔液）标本诊断念球菌病方面发展迅速。本文简述了念球菌的引物设计、破壁和ＤＮＡ提取技术，ＰＣＲ及其产物检测方法，ＰＣＲ的注意事项等方面的研究进展。     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

快速鉴定幽门螺杆菌与宿主基因型的方法学研究

目的探索采用焦磷酸测序技术进行幽门螺杆菌(Hp)鉴定与耐药以及宿主胃癌易感相关基因多态性分析的可行性,为临床提供一种快速的分析手段和诊疗依据。方法提取60例胃黏膜活检标本DNA(Hp阳性、阴性各30例),PCR扩增Hp 16S rDNA,23S rDNA以及人白细胞介素1B(IL-1B)基因特异性片段,对3个片段同时进行焦磷酸测序分析。结果 30例Hp阳性标本16S rDNA测序结果一致,均为5-′CGCGCAATCAGCGT-CAGTAATG-3′,该序列可作为标志性序列来鉴定Hp;对Hp阳性标本23S rDNA 2142及2143位点的多态性分析发现2142A→G突变,该突变通常会导致Hp对克拉霉素的耐药;对60例标本IL-1B基因-31和-511位点的多态性检测表明,-31位点有两种基因型,其中A/G基因型占80.0%,G/G 20.0%;-511位点有3种基因型,其中T/C基因型占60.0%,T/T基因型占26.7%,C/C基因型占13.3%。结论运用焦磷酸测序技术进行Hp鉴定、耐药性分析以及宿主胃癌易感性分析,具有准确、快速、操作方便、通量高等优势;除了胃黏膜活检标本,该方法亦可应用于其他标本如粪便、唾液、胃液等的Hp检测,同时可推广至其他菌种的鉴定和耐药分析,在弥补甚至替代传统的病原菌检测方面具有广阔的应用前景。     

用分子生物学技术诊断巴尔通体感染

目的 应用聚合酶链反应(PCR)技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者。方法 根据16S～23S rRNA ITS基因序列较其他属细菌长,而且位于这段基因序列中的tRNA~(Ile)-tRNA~(Ala)基因间隔区具有高度变异性,tRNA~(Ile)和tRNA~(Ala)基因序列在巴尔通体属中完全保守,设计引物;同时应用文献发表的2对引物直接扩增1例临床可疑猫抓病患者全血基因组DNA。将研究设计引物的PCR产物直接测序,并进行序列分析。结果 3对引物扩增全血基因组DNA均获得巴尔通体特异基因片段,根据其中2对引物扩增产物大小与阳性对照不同,可初步确定样本与阳性对照菌株是不同巴尔通体;序列分析结果显示,研究设计引物TIle.455p-TAla.885n扩增产物核苷酸序列与中国云南省巴尔通体-分离株对应位置的序列相一致,同源性100％。结论 应用PCR技术从血液中直接扩增特异基因片段,可以快速检测巴尔通体感染;测序及序列分析结果进一步提供了此种致病巴尔通体在中国南北方均存在的线索。     

A cultured strain of "Helicobacter heilmannii," a human gastric pathogen, identified as H. bizzozeronii: evidence for zoonotic potential of Helicobacter.

We compared the characteristics of a cultured human "Helicobacter heilmannii" isolate with those of other helicobacters found in animals. Phenotypic, protein profile, 16S rDNA sequence, and DNA-DNA hybridization analyses identified the human strain as H. bizzozeronii, a species frequently found in dogs. Thus, H. bizzozeronii may have zoonotic potential.     

3种不同方法对入境旧书中携带蜡样芽孢杆菌的检测分析

目的对一株从美国入境旧书中分离的菌株进行鉴定。方法从旧书表面采集样本分离获得一株菌株,分别采用VITEK生化鉴定、16s rDNA序列分析法及特异性引物PCR 3种方法进行鉴定。结果VITEK生化鉴定判定可能属于蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的一种。16s rDNA通用引物PCR检测结果显示该菌株与芽孢杆属同源性最高达99%。特异性引物PCR检测结果判定为蜡样芽孢杆菌。结论初筛和特异性检测方法相结合,可以有效的对入境货物携带的致病微生物进行鉴定。     

常见致病真菌通用引物PCR检测技术研究

目的 建立常见致病真菌的通用引物PCR检测技术,为研究致病真菌的基因芯片检测技术打下基础.方法 以真菌的5.8S rRAN基因和28S rRAN基因为靶基因,利用其保守序列设计用于常见致病真菌检测的PCR通用引物,并观察检测方法的特异性及敏感性.结果 建立的常见致病真菌通用引物PCR检测方法可有效检测白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等20个种属的致病真菌,敏感性为15 pg/ml DNA,实际应用效果与标准菌株检测结果一致.结论 本研究建立的通用引物PCR可以用于常见致病真菌的检测.

Abstract：

Objective To develop the detection method of common fungal pathogens by general primer PCR.Methods The primers were designed from the target genes of 5.8S rDNA and 28S rDNA of fungi,and the specificity and sensitivity were observed.Results The general primer PCR can be used to detected C.albicans,C.parapsilosis,C.krusei,C.glabrata,C.tropicalis,C.neoformans,A.fumigatus,A.flavus,A.nidulans,A.niger,C.carrionii,P.verrucosa,Sschenckii,F.pedrosoi,T.rubrum,T.mentagrophytes,M.gypseum,M.canis,E.floccosum,M.racemosus,the sensitivity was 15 pg/ml of DNA.Conclusion The general primer PCR can be used to detect common fungal pathogens.     

腹泻标本中肺炎克雷伯菌的分离鉴定和16S rDNA系统进化分析

目的 探讨腹泻标本中肺炎克雷伯菌属亚种的分类和鉴定.方法 腹泻标本使用麦康凯和SS培养基划线培养,挑取可疑菌落分纯后使用细菌生化鉴定仪鉴定到亚种;提取菌株的全基因组DNA,以克雷伯菌16S rDNA引物PCR扩增菌株的1500 bp 16S rDNA序列,扩增产物进行测序,测序结果 经截取后,使用Blastn程序在GenBank库中搜索16S rDNA序列的相似性匹配;用PHYLIP程序建立分离菌株及GenBank库中16S rDNA序列的进化发生树并进行分析.结果 113份腹泻标本中,经生化鉴定有25株(分离率22.2%)肺炎克雷伯菌株,其中,肺炎亚种21株(分离率18.6%)、鼻炎亚种4株,未分离到鼻硬结哑种.这些标本中未分离到常见腹泻病原菌.生化鉴定的肺炎亚种菌株均对青霉素G耐药,而对多黏菌素敏感,对呋喃坦叮、头孢噻吩、卡那霉素和妥布霉素有部分耐药.菌株的16S rDNA序列在GenBank库中搜索发现,生化鉴定为鼻炎哑种的4株菌株与沙门菌等肠道致病菌株有最大相似性匹配;16S rDNA序列系统进化树将生化鉴定的肺炎亚种聚为一群,但不能将肺炎克雷伯菌属的3个亚种完全区分开来.结论 16S rDNA序列进化分析在肺炎克雷伯菌的鉴定和分类中有一定意义.     

基于16S和23S rDNA基因芯片检测和鉴定七种临床常见病原菌

目的 以细菌16S rDNA和23S rDNA基因为靶序列建立可检测临床七种常见病原菌寡核苷酸芯片系统.方法 采用双重PCR扩增标本中靶细菌16S和23S rDNA基因片段.构建能同时检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7、副溶血性弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌和志贺菌的寡核苷酸芯片,并考核芯片的检测特异性、灵敏度和重复性.采用所建立的寡核苷酸芯片检测81例腹泻患者粪便样本.结果 双重PCR可同时扩增上述七种病原菌的16S和23SrDNA基因靶序列.所研制的寡核苷酸芯片检测灵敏度可达103 cfu/ml,非靶细菌无阳性结果 ,不同批间和批内芯片的变异系数为3.89%～5.81%.寡核苷酸芯片检测粪便样本的阳性率为39.5%(32/81),与常规细菌学检查法检测结果 的符合率达到96.3%(78/81),菌种鉴定结果 符合率为96.8%(31132).结论 研究建立的寡核苷酸芯片法在检测七种病原菌时具有简便、快速、准确、高通量等优点,适合于临床样本检测及流行病学现场调查.     

Specific detection of Coxiella burnetii through partial amplification of 23S rDNA

A previously published sequence of the 23S rRNA gene of Coxiella burnetii has been reported to contain an intervening sequence of 444 base pairs (bp). The sequence information on the intervening sequence and the 23S rRNA gene was exploited to develop a specific PCR-based assay for C. burnetii. A primer set was designed that amplified a 477-bp fragment encompassing part of the intervening sequence and part of the 23S rDNA. From all of nine C. burnetii strains tested, a fragment of the expected size was amplified. As predicted from the published sequence, restriction endonuclease digestion of the PCR product from the Coxiella strains with RsaI produced two distinct fragments approximately 210- and 270-bp in size. The PCR-based method showed a detection limit of 10² bacteria as determined by visualization of the amplicon on an agarose gel. When experimentally infected blood was analyzed, the detection limit was 10³ bacteria. No visible amplicons were observed when 41 bacterial strains, representing 29 species other than C. burnetii, were tested. The presence of the DNA in all bacterial samples was confirmed by amplification of a 350-bp fragment of the 16S rDNA using two universal primers. The described method proved to be specific for C. burnetii and may become a rapid and sensitive diagnostic assay for C. burnetii. The results also demonstrate that the intervening sequence within the 23S rRNA gene is generally found among isolates of C. burnetii.     

人感染2型猪链球菌快速多重PCR检测方法的建立

目的：用多重PCR从临床标本中同时检测猪链2型特异性及5个毒力相关基因，建立SS2实验室快速诊断及应急检测的核酸鉴定方法。方法：根据已报告的引物序列设计并合成8对引物（含1对内对照引物），经过PCR反应条件的优化与组合，采用同一PCR反应条件与循环程序，直接从临床标本或培养物中同时一次性扩增属特异性（tuf）、种特异性（16S rRNA）、荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、细胞外蛋白因子（ef）、溶血素（sly）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等基因；并对方法的特异性和敏感性进行评估。结果：运用所建立的方法可直接从临床疑似猪链感染患者的脑脊液、血液、双相培养液和血培养物中一次性扩增出上述8对引物的目的基因，并经基因序列分析、细菌分离培养和生化鉴定进一步证实。其敏感性为78cfu（克隆形成单位）。结论：所建立的方法具有敏感、特异、快速、简便的特点，可应用于SS2感染应急检测、流行病学监测和实验室快速诊断。