DFU对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察选择性环氧合酶-2抑制剂DFU对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖和侵袭能力的影响及其对Ang-2基因表达的调控.方法 体外培养骨肉瘤细胞株MG-63,免疫荧光法检测Ang-2在MG-63细胞中的表达,应用噻唑蓝(MTT)比色法和形态学检测研究不同浓度DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用,Boyden小室体外侵袭实验检测其对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响,RT-PCR法分析DFU对骨肉瘤细胞株MG-63中Ang-2基因表达的影响.结果 免疫荧光染色结果显示Ang-2在骨肉瘤细胞株MG-63中呈阳性染色,MTT法和形态学检测提示DFU可抑制骨肉瘤细胞株MG-63的增殖,并具有剂量依赖性,在DFU浓度为200 μmol/L时,对细胞生长有明显的抑制作用.Boyden小室体外侵袭实验显示DFU可降低骨肉瘤细胞的侵袭能力,在DFU浓度为200 μmol/L时,作用最显著.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析显示经DFU作用后的骨肉瘤细胞株MG-63表达Ang-2较用药前明显下降.结论 DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的增殖有抑制作用,其可能通过抑制Ang-2的表达,降低其侵袭能力.     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

肿瘤转移相关基因MTA1与鼻咽癌细胞浸润和转移的关系

目的:鼻咽癌是高转移和高侵袭性肿瘤,而且对现行的治疗方法有抵抗性.肿瘤转移相关基因MTA1是新近发现的肿瘤转移相关基因.本实验MTA1基因在人鼻咽癌细胞高低转移株5-8F和6-10B的表达水平以及低转移细胞株转染MTA1全长基因后侵袭能力的改变,探讨MTA1表达与鼻咽癌侵袭转移的相关性.方法:两株细胞株中的MTA1表达通过半定量的RT-PCR进行检测,用细胞侵袭实验及细胞增值实验评价两株细胞株离体的增值及侵袭能力,并检测低转移株(6-10B)转染MTA1CDNA后MTA1的表达及侵袭能力的变化.结果:高转移株5-8F中的MTA1的表达明显高于低转移株6-10B呈正相关,而且低转移株6-10B转染MTA1后其MTA1的表达及侵袭能力明显增加.结论:在鼻咽癌细胞中MTA1同肿瘤的侵袭转移能力呈明显相关性,MTA1可以作为研究鼻咽癌转移及治疗的候选基因.     

反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响

目的: 构建人组织蛋白酶L (cathepsinL, CATL) 基因的正、反义真核表达载体, 观察其转染后对人骨肉瘤细胞MG-63侵袭特性的影响。方法: 用基因重组技术构建人组织蛋白酶L正、反义真核表达载体, 转染人骨肉瘤细胞MG-63, RT-PCR和Westernblot检测CATL的mRNA和蛋白质的表达水平, 并对转染前后骨肉瘤细胞的侵袭能力进行检测。结果: 正、反义真核表达载体成功构建并转染入MG-63细胞中。反义载体转染后的细胞CATL的mRNA和蛋白质的表达水平下降, 体外侵袭实验表明细胞的侵袭力下降。结论: 反义CATL基因的转染使骨肉瘤细胞CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力下降。     

p27^kipl高表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭转移的影响

目的探讨外源性人p27kip1的高表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭能力的影响.方法利用携带人p27kip1基因的腺病毒(Ad-p27kip1)体外转染人前列腺癌PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测PC-3转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化.以Ad-X-gal病毒作为对照.结果 RT-PCR、Western印迹法检测转染Ad-p27kip1后PC-3细胞的p27kip1-mRNA(320bp)、p27蛋白(27×103)表达阳性,转染后对PC-3细胞的生长有抑制作用,出现明显的G0-G1期阻滞,早期细胞凋亡率有所增加,与对照组比较差异有显著性,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制.结论重组腺病毒介导的人p27kip1基因在体外对前列腺癌细胞系PC-3的细胞增殖和侵袭力有明显抑制作用,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具.     

RGDS-GG-KLAKLAKK多肽对人骨肉瘤细胞黏附迁移和侵袭力的影响

目的 研究多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对体外培养人骨肉瘤细胞MG-63黏附迁移和侵袭力的影响,并探讨其作用机制.方法 将不同浓度(0、25、50、75、100μmoL/L)的多肽RGDSGG-KLAKLAKK与MG-63细胞混合培养,用比色法测量多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞黏附力的抑制作用,通过transwell小室侵袭模型检测多肽对MG-63细胞侵袭力的影响.观测多肽对骨肉瘤细胞自发肺转移模型抗肿瘤转移的影响.结果 MG-63骨肉瘤细胞对纤维连接蛋白(Fn)的黏附被多肽GDS-GG-KLAKLAKK对明显抑制(P<0.05).25、50、75、100 μmol/L的多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞侵袭力的抑制率分别为(18.3±2.9)%、(28.5±4.8)%、(40.4±5.6)%和(66.7±7.8)%,对比空白对照组(0μmol/L多肽)差异有统计学意义(P<0.05).多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63骨肉瘤细胞浸润能力有明显抑制作用.MG-63骨肉瘤细胞接种于裸鼠后给予多肽RGDS-GG-KLAKLAKK治疗,与对照组比较,有明显的肺重减轻、肺转移灶减少(P<0.05).结论 多肽RGDS-GG-KLAKLAKK能够抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外黏附、侵袭和转移.     

组织蛋白酶L反义基因转染对高转移人骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的构建人组织蛋白酶L（CATL）基因的正、反义真核表达载体。观察反义CATL核酸转染后对高转移人骨肉瘤细胞体内、外侵袭特性的抑制效应。方法采用RT-PCR的方法,从人骨肉瘤组织中扩增出1001bp的CATL全长cDNA片段,以BamHⅠ及XbaⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。对重组质粒进行限制性内切酶酶切分析及DNA序列测定。应用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒导入高转移人骨肉瘤细胞中,观察转染后细胞的生长、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤及自发转移能力等指标的变化。结果正、反义真核表达载体成功构建并转染入高转移人骨肉瘤细胞中。基因转染对细胞的体外生长无明显影响。反义载体转染后细胞的体外侵袭能力和裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制。结论反义CATL基因可显著抑制骨肉瘤细胞的体内、外侵袭力。     

p27kip1高表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭转移的影响

目的　探讨外源性人p2 7kip1的高表达对前列腺癌PC 3细胞增殖和侵袭能力的影响。方法　利用携带人p2 7kip1基因的腺病毒 (Ad p2 7kip1)体外转染人前列腺癌PC 3细胞 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达 ,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测PC 3转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化。以Ad X gal病毒作为对照。 结果　RT PCR、Western印迹法检测转染Ad p2 7kip1后PC 3细胞的p2 7kip1 mRNA(3 2 0bp)、p2 7蛋白 (2 7× 10 3 )表达阳性 ,转染后对PC 3细胞的生长有抑制作用 ,出现明显的G0 G1期阻滞 ,早期细胞凋亡率有所增加 ,与对照组比较差异有显著性 ,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制。结论　重组腺病毒介导的人 p2 7kip1基因在体外对前列腺癌细胞系PC 3的细胞增殖和侵袭力有明显抑制作用 ,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具。     

组织因子基因siRNA对胃癌侵袭力的影响

目的：探讨应用RNA 干扰技术抑制胃癌细胞组织因子(TF) 基因表达对胃癌侵袭能力的影响。 方法：构建pSUPER /TF-siRNA重组载体, 并将其转染入胃癌细胞SGC-7901中;RT-PCR和Western blot检测转染前后TF的表达水平;应用Boyden小室检测对胃癌细胞的侵袭能力。 结果：双酶切鉴定重组载体构建成功。RT-PCR和Western blot检测显示pSUPER /TF-siRNA1重组载体明显抑制SGC-7901细胞TF基因的表达(P<0.05)。Boyden小室体外侵袭实验证实, 转染pSUPER/TF-siRNA1 质粒的SGC-7901穿膜细胞均数较其他无干扰组的细胞均数明显减少(P<0.05)。 结论：以TF 基因作为靶点应用RNA 干扰技术抑制其表达可降低胃癌细胞体外侵袭移能力, 故其有望成为胃癌治疗的一个新靶点。     

人抑癌基因PTEN对前列腺癌细胞系生物学行为的影响

目的　探讨外源性人抑癌基因PTEN表达对前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5细胞增殖和侵袭转移能力的影响。　方法　利用携带人PTEN基因的可调控性腺病毒 (Ad PTEN ) ,体外转染人前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5,RT PCR、Westernblot检测目的基因不同水平的表达 ,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测LNCaP、DU 14 5转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化。　结果　转染Ad PTEN后LNCaP、DU 14 5细胞的PTEN表达由阴性转为阳性 ,转染后对LNCaP、DU 14 5细胞生长有抑制作用 ,阻滞于G0 ～G1期 ,早期细胞凋亡率增加 ,LNCaP细胞 (6.89± 0 .51) % ;DU14 5细胞 (5.44± 1.13 ) % ,与对照组相比差异有显著性 ,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制。 　结论　重组腺病毒介导的人PTEN基因在体外对前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5的细胞增殖和体外侵袭力有明显抑制作用 ,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具     

肺癌抑癌基因-1对人骨肉瘤细胞株MG63的侵袭和转移抑制效应研究

目的观察肺癌抑癌基因-1（TSLC1）稳定转染至骨肉瘤细胞株后对其侵袭、转移及裸鼠皮下成瘤能力的影响。方法采用稳定表达TSLC1基因的人骨肉瘤细胞株M8T为研究对象,转染空载体的细胞系M8P设为对照组,MG63细胞株为空白组;Transwell法检测三组细胞株的体外侵袭和迁移能力;将细胞制成1×107细胞悬液,于裸鼠尾静脉注射,第4周开始处死裸鼠,肉眼及镜下观察肺部转移灶形成情况,肺组织石蜡包埋切片HE染色检测。将0.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬2×107细胞皮下注射5周龄裸鼠,皮下肿瘤生长情况1周检测1次。结果 M8T细胞株体外侵袭细胞数目为（25.86±2.12）,迁移的细胞数目为（37.55±3.46）;其裸鼠皮下成瘤形成时间：于注射后第4周开始生长,较对照组和空白组细胞株成瘤时间晚,体积显著减小,体内肺转移形成时间为注射后第9周,肺部转移灶发生率为40%。结论 TSLC1基因可明显抑制人骨肉瘤细胞的侵袭和转移及皮下成瘤能力。     

SOX5对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 观察Y染色体上的性别决定区相关高迁移率族盒蛋白-5(sex determining region Y-box protein 5,SOX5)对骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭能力的影响,探讨其在骨肉瘤发病和转移中的作用.方法 本研究为前瞻性研究,通过脂质体介导的基因转染技术将SOX5的三个不同的siRNA(siSOX5-1、siSOX5-2和siSOX5-3)瞬时转染骨肉瘤细胞MG63,转染后48 h检测SOX5的mRNA和蛋白表达,从中挑选出干扰效果最明显的siRNA.进而采用博伊登室实验方法分别对干扰前后的骨肉瘤细胞MG63进行体外细胞迁移和侵袭测定,采用免疫印迹(Western blot)检测迁移和侵袭相关蛋白[基质金属蛋白酶(matrix metallproteinase,MMP)-2、MMP-9、Twist1和Snail1)]的表达水平.结果 3条针对人的siRNA(siSOX5-1、siSOX5-2、siSOX5-3)均能够降低SOX5 mRNA及蛋白水平表达,其中siSOX5-3干扰效果最明显.siSOX5-3干扰组的迁移细胞数为(52±5)较对照组的(107±9)显著减少(P<0.05),siSOX5-3干扰组的侵袭细胞数为(27±4)较对照组的(71±2)显著减少(P<0.05).Western blot结果显示siSOX5-3干扰组的侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9、Twist1和Snail1)的表达均较对照组显著降低(P<0.05).结论SOX5 RNA干扰能显著降低骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力,SOX5能促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭.     

Gemcitabine inhibits viability, growth, and metastasis of osteosarcoma cell lines.

Gemcitabine (dFdCyd) is an analog of cytosine arabinoside with anti-tumor activity in several human cancers. However, the efficacy of this compound in osteosarcoma has not been fully elucidated. Here we assessed the anti-tumor activity of gemcitabine using osteosarcome cell lines. In 9 human osteosarcoma cell lines (G292, HOS, MG63, NY, SaOS, HuO, HuO-3N1, HuO9, HuO9-N2), gemcitabine at the doses of >100 nM showed significant cytotoxicity. In HOS and MG63 cell lines, gemcitabine inhibited DNA synthesis as determined by IdU labeling assay and induced apoptosis as determined by DNA fragmentation assay and May-Giemsa staining. In C3H mice inoculated s.c. with a murine osteosarcoma cell line, LM8, treatment of the mice with gemcitabine showed reduced size of the primary tumor associated with increased apoptotic cells and a virtual absence of metastatic lesions in the lung. Gemcitabine thus had anti-tumor activity on osteosarcoma cell lines both in vitro and in vivo. The result would provide a cellular basis for application of gemcitabine to patients with osteosarcoma.     

Maspin:新的潜在的骨肉瘤转移抑制基因

目的 通过对肿瘤基因组数据整体分析寻找骨肉瘤转移相关基因,初步分析其与骨肉瘤转移的关系.方法 联合分析肿瘤组织DNA拷贝数目的 变化及肿瘤转移细胞模型中表达差异基因数据,筛选骨肉瘤转移相关基因,通过RT-PCR、Westen blot及免疫组化检测该基因在不同骨肉瘤细胞系、正常成骨细胞、骨肉瘤及正常骨组织临床标本中的表达,并结合临床随访分析其与骨肉瘤患者预后的关系.结果 NCBI数据库显示18q常出现DNA拷贝数目变化和杂合性缺失.基因芯片结果 显示高转移MG63-A1细胞系与MG63wt相比142个基因表达差异在4倍以上,而在18q21区域其中一个新的肿瘤转移抑制基因Maspin在高转移MG63-A1细胞系中表达明显下降.RT-PCR、Westen blot检测证实基因芯片结果 准确,并发现Maspin在正常成骨细胞高表达,在SAOS2、143B中表达缺失.免疫组化检测显示在27例骨肉瘤临床标本中,33.3%(9/27例)的标本Maspin表达为阳性,其余为阴性;在正常骨组织中Maspin表达强阳性.Maspin表达与骨肉瘤患者预后呈正相关(P=0.032).结论 Maspin的表达随着骨肉瘤细胞系转移能力的增加而出现缺失,在骨肉瘤标本中Maspin表达与患者预后呈正相关,预示着其可能成为阻遏骨肉瘤转移的新靶点.     

热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

目的观察热疗联合特异性siRNA沉默趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)对骨肉瘤增殖和侵袭的影响。方法培养人骨肉瘤细胞株MG 63至对数生长期,接种于6孔板中,分为三组,空白组细胞不进行任何处理常规培养,control siRNA组以control siRNA转染细胞,CXCR4 siRNA组以CXCR4 siRNA转染细胞,采用Western blot检测各组CXCR4的表达变化,评估CXCR4 siRNA转染效能。细胞及体内实验设置control siRNA组(对照组)、热疗联合CXCR4 siRNA组(联合组)、CXCR4 siRNA组(沉默组)和热疗组,以CXCR4 siRNA转染沉默组和联合组的细胞,control siRNA转染对照组细胞,热疗组和联合组进行热疗处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)和Western blot检测各组细胞CXCR4的表达变化。CCK 8法和Transwell侵袭实验检测转染后MG 63细胞的增殖能力和侵袭能力变化。流式细胞技术检测转染后MG 63细胞的周期变化。体外裸鼠成瘤实验和肿瘤生长曲线观察转染后MG 63细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长情况。结果CXCR4 siRNA可以有效沉默MG 63细胞中CXCR4蛋白的表达。热疗联合CXCR4 siRNA有效沉默MG 63细胞中CXCR4的表达并能抑制MG 63细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期于G0/G1期(P均<0.05)。体内实验结果显示,从第14天起,联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组的瘤重也低于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论热疗联合特异性沉默CXCR4抑制骨肉瘤的增殖和侵袭,可作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。     

顺铂诱导人成骨肉瘤耐药细胞系的建立及生物学特性研究

目的：建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63／R并观察其生物学特性。方法：以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63／R。MTF法检测药物敏感性：光镜、透射电镜观察MG63、MG63／R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P—pg、bcl-2、p53蛋白表达。结果：经顺铂186d的诱导建立了MG63／R,MG63／R对顺铂的耐药指数为83．557,对阿霉素、长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63／R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63／R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63／R细胞P—pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,p53表达则明显降低。结论：本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系（MG63／R）,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模犁。     

趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法Real-time PCR 检测人骨肉瘤细胞株 HOS-8603、U2OS 和 MG-63 中 CXCR4 mRNA 的表达情况;构建、鉴定pcDNA3/CXCR4 重组质粒并将其转染到 HOS-8603 细胞中（PCDNA3/CXCR4 组）,同时制备转染 pcDNA3 空质粒的阴性对照组（pcDNA3组）。MTT检测细胞增殖情况,穿膜小室重组细胞基底膜迁移实验检测细胞迁移情况。结果 HOS-8603细胞中CXCR4 mRNA相对表达含量低于U2OS、MG-63细胞（P 〈0.05）。转染后24、48h,pcDNA3/CXCR4 组 CXCR4 mRNA 表达量是 pcDNA3 组的 96 倍和 124 倍（P 〈0.05）。与 pcDNA3 组比较,转染后24、48、72 h,pcDNA3/CXCR4组细胞增殖率和发生迁移的细胞数明显增加（P 〈0.05）。结论 CXCR4的表达可能是促进骨肉瘤细胞增殖和迁移的重要因素。     

过表达FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究

［摘要］ 目的 探讨FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT?PCR）的方法检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞U2OS、MNNG/HOS中FOXO1的mRNA表达水平。利用pcDNA3.1?FOXO1重组质粒建立FOXO1过表达的细胞模型,空载质粒（pcDNA3.1?vector）作为对照,qRT?PCR和蛋白质印迹法（Western blot）验证转染效率。确定成功过表达FOXO1基因后利用Cell Counting Kit?8（CCK?8）实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力（吸光度值）,Transwell实验体外检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力,并采用qRT?PCR和western blot的方法检测基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化。结果 人骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS中FOXO1的mRNA的表达水平显著低于人成骨细胞hFOB 1.19（P<0.05）,且骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1的表达水平较低。重组质粒pcDNA3.1?FOXO1转染后,骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1表达水平显著升高。与对照组（pcDNA3.1?vector）比较,U2OS?FOXO1过表达组的细胞的增殖能力降低（P<0.05）,侵袭迁移和迁移能力降低,MMP9较对照组表达水平明显降低（P<0.05）。结论 骨肉瘤细胞中FOXO1表达水平明显低于正常成骨细胞。过表达FOXO1可能通过下调MMP9抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。