粒细胞巨噬细胞刺激因子对大鼠创面哺乳动物西罗莫司靶蛋白信号通路的作用

目的 了解应用粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)对大鼠创面愈合的影响及对哺乳动物西罗莫司(雷帕霉素)靶蛋白(mTOR)信号通路的作用. 方法 将50只SD大鼠按照随机数字表法分为治疗组和对照组,每组25只,于其背部制作约2 cm×2 cm全层皮肤缺损创面.治疗组大鼠创面外涂重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子( rhGM-CSF)凝胶,10 μg/cm2,rhGM-CSF实际作用量为1×10-4 μg/cm2;对照组创面涂抹不含任何药物的凝胶基质,10 μg/cm2.2组每日给药1次直至创面愈合.于致伤后1、3、5、7、14 d,每组每时相点处死5只大鼠:(1)观察并计算创面愈合率.(2)于前4个时相点取创面组织标本,行HE染色观察组织病理学改变,ELISA法检测GM-CSF含量,蛋白质印迹法检测GM-CSF、CD31及mTOR信号通路相关分子P70S6K、磷酸化(p-)P70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1、mTOR、p-mTOR表达量.对数据行t检验. 结果 (1)伤后1d,2组大鼠创面愈合率接近(t=0.307,P＞0.05);伤后3～ 14 d,治疗组创面愈合率明显高于对照组(t值为2.704～ 4.030,P ＜0.05或P ＜0.01).(2)HE染色可见,与对照组同时相点相比,治疗组创面肉芽组织及微血管数量明显增多,创缘角化上皮细胞增殖明显.(3)ELISA法和蛋白质印迹检测结果显示,2组大鼠创面GM-CSF含量及蛋白表达量均在伤后3d达到峰值,对照组分别为(720.9±0.9)pg/mL、2.45±0.10,治疗组分别为(910.5±1.3)pg/mL、2 80±0.48.治疗组各时相点GM-CSF含量均明显高于对照组(t值为105.743～298.971,P值均为0.000),治疗组伤后1、5、7 d GM-CSF蛋白表达量明显高于对照组(t值为4.070～5.275,P值均小于0.01).(4)治疗组伤后1、3、7d创面组织中CD31表达量均明显高于对照组(t值为7.237～26.401,P值均小于0.01).(5)治疗组伤后各时相点创面组织中mTOR和p-mTOR表达量均高于对照组(t值为2.921 ～23.143,P ＜0.05或P＜0.01).治疗组P70S6K表达量伤后3、5、7d高于对照组(t值为2.950～5.275,P＜0 05或P＜0.01),p-P70S6K表达量于伤后1、3、7d高于对照组(t值为3.307 ～22.793,P＜0.05或P＜0.01).治疗组伤后1、3、5 d 4E-BP1表达量均明显低于对照组(t值为2.449～6.431,P＜0.05或P＜0.01),p-4E-BP1表达量于伤后1、3、7 d高于对照组(t值为5.522～11.613,P值均小于0.01). 结论 GM-CSF能促进大鼠创面组织mTOR蛋白及其下游信号分子P70S6K、4E-BP1的磷酸化,从而激活mTOR信号通路,促进创面愈合.     

血管内皮生长因子在电烧伤大鼠血清及创面组织中的表达变化

目的 观察电烧伤大鼠血清和创面组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化,探讨其在电烧伤病变中的作用机制. 方法 按随机数字表法将64只SD大鼠分为正常对照组(8只)和电烧伤组(56只).于伤后6h和1、3、7、14、21、28 d,每时相点处死8只电烧伤组大鼠,留取创面肌肉组织和血清样本.HE染色观察创面组织病理学改变,双抗体夹心ELISA法检测血清VEGF含量,蛋白质印迹法检测创面VEGF蛋白的表达量,免疫组织化学法检测创面VEGF的表达定位,计算微血管密度(MVD)值.对MVD值与VEGF表达强度行相关性分析.取未经任何处理的正常对照组大鼠腿部腹侧肌肉组织及血清进行上述指标检测.对数据进行单因素方差分析与Spearman等级相关分析,两两比较LSD-t检验. 结果 (1)电烧伤组大鼠伤后6h及1d,创面组织肌纤维断裂,大量炎性细胞浸润,组织水肿明显;伤后3d有新生血管生成;7d时肉芽组织及新生血管数量明显增多.(2)电烧伤组大鼠伤后6h及1、14 d,血清VEGF含量分别为(43±11)、(44±11)、(74±27) pg/mL,明显高于正常对照组的(15±9)pg/mL(t值为4.001～5.724,P值均小于0.01).(3)与正常对照组肌肉组织VEGF蛋白表达量(0.21±0.09)比较,电烧伤组各时相点大鼠创面组织VEGF蛋白表达量均升高,伤后7d达峰值,为0.63±0.13(t =4.965,P＜0.05).(4)电烧伤组早期炎性细胞VEGF表达强阳性,后期以新生血管内皮细胞阳性表达为主.(5)电烧伤组伤后3、7、14、21、28 d,创面组织MVD值和VEGF表达强度呈显著正相关(rs=0.834,P＜0.01). 结论 电烧伤后不同阶段,VEGF在大鼠创面组织及血清中的表达各不相同,其改变与伤后体液渗出及创面愈合过程密切相关.     

P物质与表皮干细胞联用对糖尿病大鼠创面愈合与神经再生的影响

目的 观察感觉神经肽P物质与表皮干细胞(ESC)联合应用对糖尿病大鼠创面愈合与神经再生的作用. 方法 分离培养SD大鼠ESC(经鉴定),接种于羊膜滋养层上构建羊膜-ESC备用.选择48只糖尿病模型大鼠,每只背部制作4个全层皮肤缺损创面.按随机抽签法将此192个创面分为ESC+P物质组、ESC组、P物质组、对照组,每组48个创面.ESC+P物质组和ESC组创面均移植羊膜-ESC,P物质组、对照组创面移植羊膜.移植后,ESC+P物质组、P物质组在创周及创面中央注射1×10-7 mol/L的P物质250μL,ESC组、对照组在创周及创面中央注射PBS 250μL作对照,各组每日注射2次,连用4d.于大鼠伤后4、7、10、14、17、23 d,观察并计算创面愈合率(每时相点8个创面),HE染色观察创面组织结构改变.伤后4、7、10 d,行Masson染色观察创面组织总胶原分布,免疫组织化学染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积量.伤后14、23 d,用免疫组织化学染色法观察创面组织中蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)及P物质阳性神经纤维分布情况.对数据行单因素方差分析和t检验. 结果(1)ESC+P物质组伤后14 d创面愈合率达100.0％,明显早于ESC组、P物质组、对照组完全愈合时间(伤后17、17、23 d).HE染色显示ESC+P物质组创面愈合质量明显优于其余3组.(2)伤后10 d,ESC+P物质组与P物质组创面组织中胶原着色深、面积广;其余2组胶原染色较浅、面积较小.随着伤后时间推移,各组创面Ⅰ型胶原沉积量逐渐升高,Ⅲ型胶原沉积量逐渐下降.伤后4、7、10 d,ESC+P物质组Ⅰ型胶原沉积量明显高于ESC组(t值分别为32.72、118.21、26.71,P值均小于0.01)和对照组(t值分别为44.37、22 76、30.32,P值均小于0.01);ESC+P物质组与P物质组水平相对接近.伤后4、7、10d,ESC+P物质组创面Ⅲ型胶原沉积量明显高于ESC组(t值分别为32.27、28 68、14.51,P值均小于0.01)和对照组(t值分别为35 68、22.52、22 24,P值均小于0.01).(3)ESC +P物质组与P物质组创面组织中有大量PGP 9.5和P物质阳性神经纤维再生,创面深层部分神经纤维末梢向表皮延伸.ESC组、对照组仅见创面深层有少量PGP 9.5和P物质阳性神经纤维,且未向表皮延伸.伤后14、23 d,ESC+P物质组创面PGP 9.5阳性神经纤维面积占(3.86±0.25)％、(7 03±0.28)％,明显高于ESC组[(1.48±0.30)％、(3.01±0 43)％,t值分别为23 95、30 27,P值均小于0.01]和对照组[(1 46±0 23)％、(2.84±0.29)％,t值分别为27.35、40.32,P值均小于0.01].伤后14、23 d,ESC+P物质组创面P物质阳性神经纤维面积占(2.01±0 14)％、(1.19±0 11)％,明显高于ESC组[(0.85±0 17)％、(1.34±0 21)％,t值分别为20.50、2.60,P＜0.05或P＜0.01]和对照组[(0.74 ±0.15)％、( 1.30 ±0.17)％,t值分别为23 98、2.41,P＜0.05或P＜0.01]. 结论 感觉神经肽P物质和ESC联合应用,可以有效促进糖尿病大鼠创面愈合与神经再生.     

基底刚度对成纤维细胞生物学行为的影响

目的 了解基底刚度对Fb增殖、迁移和整合素β1表达的影响. 方法 将Fb接种于刚度为(16.2±0.5)、(19.8±1.1)、(200.1±2.6)kPa的硅胶基底上.进行如下检测.(1)分别连续培养5 d或6d,进行细胞计数、噻唑蓝法检测细胞增殖活性(吸光度值表示).(2)培养3d,检测细胞周期,计算增殖指数(PI).(3)划痕实验后培养0(当日)、1、2、3 d,测定Fb迁移率.(4)培养2 d,流式荧光法检测细胞中整合素β1表达.对部分数据进行单因素方差分析. 结果 (1)细胞计数、噻唑蓝法检测均显示,Fb增殖速度及活性均随着硅胶基底刚度的增强而增加.细胞周期检测显示:在刚度为(16.2±0.5)、(19.8±1.1)(200.1±2.6)kPa的硅胶基底上,细胞的PI分别为24.8％、27.4％、32.4％.(2)培养2d,在刚度分别为(19.8±1)、(200.1±2.6) kPa的硅胶基底表面上,Fb迁移率分别为(91.4±5.1)％(100.0±1.3)％,均明显高于刚度为(16.2±0.5)kPa硅胶基底表面的Fb迁移率[(55.8±6.8)％,F值分别为3.5、4.0,P值均小于0.01].(3)刚度为(16.2±0.5)kPa硅胶基底表面的Fb中整合素β1表达率最低,仅43.2％；刚度为(200.1±2.6)kPa硅胶基底表面的Fb中整合素β1表达率最高(81.3％]. 结论 基底刚度对Fb在创面愈合和瘢痕形成过程中的增殖迁移有较大影响,这一效应与其调控Fb整合素β1表达作用相关.     

膨体聚四氟乙烯覆盖创面的实验研究

目的 了解高分子材料膨体聚四氟乙烯(ePTFE)作为创面覆盖材料的可行性.方法 将45只SD大鼠背部制成全层皮肤至筋膜层损伤创面后分为:自体移植组,创面行自体皮片回植;异体移植组,以15只Wistar大鼠为供皮鼠,将皮片移植于SD大鼠创面;实验组,在创面上覆盖ePTFE.每组15只SD大鼠.肉眼观察各组大鼠创面愈合情况.于术后3、7、14 d切取各组大鼠创面组织标本行HE染色,光学显微镜下观察组织切片中巨噬细胞、Fb、淋巴细胞数量.免疫组织化学法检测γ干扰素(IFN-γ)和IL-2表达水平.结果 自体移植组、实验组大鼠创面愈合良好,未见红肿及感染征象;异体移植组大鼠术后8 d出现排斥反应,表皮有不同程度的变性坏死,创缘红肿.各时相点异体移植组镜下可见巨噬细胞、Fb、淋巴细胞数量均高于实验组和自体移植组(P＜0.01).免疫组织化学染色可见,术后7 d异体移植组IFN-γ和IL-2表达的平均灰度值分别为129±7、113.7±2.7,均明显低于自体移植组(189±6、180.3±3.7,P＜0.01)和实验组(144±8、137.3±1.9,P＜0.01).结论 ePTFE可引起较小的炎性反应及异物反应,置于受损创面上未见不良反应,可以将其作为创面覆盖材料.     

没药提取物对人成纤维细胞增殖与胶原mRNA表达影响的实验研究

目的 观察没药提取物对人皮肤Fb生物学特性的影响,探讨其促进创面愈合的可能机制. 方法 从人正常包皮组织中分离并培养Fb,取第3～5代细胞用于实验.(1)将Fb接种至96孔板,按随机数字表法分为对照组,1×10-4、1 ×10-3、1×10-2、1 ×10-1、1、10、1×102 g/L没药水提取物组以及上述7种浓度的没药醇提取物组.对照组用含体积分数0.25％小牛血清的DMEM培养液(简称低浓度血清培养液)培养,各浓度没药水及没药醇提取物组分别用含相应终浓度2种没药提取物的低浓度血清培养液培养.培养48 h,用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定各组Fb增殖活性(以吸光度值表示).(2)将Fb分别接种于培养瓶和培养皿中,均按随机数字表法分为2组:1 g/L没药水提取物组,用含终浓度1 g/L没药水提取物的低浓度血清培养液培养;对照组,采用低浓度血清培养液培养.培养72 h,分别采用流式细胞仪、实时荧光定量PCR法检测Fb周期与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达.对数据进行LSD-t检验. 结果 (1)各组细胞均呈长梭形生长,1 g/L没药水提取物组细胞融合较对照组更显著.1×10-3、1×10-2、1×10-1、1、10 g/L没药水提取物组Fb吸光度值分别为0.378±0.032、0.402±0.007、0.390±0.038、0.453±0.036、0.390±0.037,均高于对照组的0.332±0.044,t值分别为2.24、2.93、2.69、5.73、2.71,P值均小于0.05.1×10-4、1×102 g/L没药水提取物组吸光度值分别为0.312±0.048、0.154±0.009,前者与对照组比较,差异无统计学意义(t=2.84,P＞0.05);后者显著低于对照组(t =7.17,P＜0.05).1×10-3、1 ×10-1、1、10、1×102 g/L没药醇提取物组Fb吸光度值显著低于对照组(t值为2.30～24.79,P值均小于0.05).(2)1 g/L没药水提取物组G0/G1期细胞百分比为(74.3±6.3)％,明显少于对照组的(82.2±7.9)％,t=6.77,P＜0.05;S期及G2/M期细胞百分比分别为(16.6±3.4)％、(9.1±1.6)％,明显多于对照组的(13.3±2.3)％、(4.5±0.8)％,t值分别为7.53、6.34,P值均小于0.051 g/L没药水提取物组Fb中Ⅰ型胶原mRNA相对表达量(0.89±0.08)与对照组(1.00±0.06)比较,差异无统计学意义(t =1.17,P＞0.05);Ⅲ型胶原mRNA相对表达量(1.38±0.12)显著高于对照组(1.00±0.05,t=3.81,P＜0.01). 结论 没药水提取物能显著促进Fb增殖,加快Fb细胞周期进程,上调Fb中Ⅲ型胶原mRNA表达,可能与其促进创面愈合的机制相关.     

急性放射性皮肤溃疡中血小板源性生长因子及其受体的表达

目的观察不同创面血小板源性生长因子(PDGF)A及其受体(PDGFR)α的动态表达,探讨急性放射性皮肤溃疡难愈合的机制。方法应用γ射线单次照射Wistar大鼠,制作急性放射性皮肤溃疡模型(照射组,55只),以皮肤全层切割伤模型大鼠作为创伤对照(创伤组,55只),另取5只正常大鼠作为对照组。采用免疫组织化学及原位逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,观察不同时相点各组大鼠创面内PDGF-A、PDGFR-α和PDGF-AmRNA的表达。结果对照组大鼠皮肤中PDGF-A及PDGFR-α表达为阴性;创伤组大鼠炎症反应期及肉芽组织期(伤后3~9d)PDGF-A的积分吸光度(IA)值为20.0±1.6、28.3±1.0;照射组炎症反应期及肉芽组织期(伤后14~28d)其PDGF-A的IA值各为14.0±1.2、20.3±1.2,PDGF-A及PDGFR-α和PDGF-AmRNA的表达较创伤组明显减弱,至瘢痕形成期(伤后55d)时表达进一步减弱。结论急性放射性皮肤溃疡内PDGF-A及PDGFR-α的表达减弱,可能是创面难愈合的机制之一。     

早期负压封闭引流治疗深Ⅱ度烧伤创面的临床疗效评价

目的 前瞻性评价早期VSD治疗深Ⅱ度烧伤创面的临床疗效,为其临床应用提供依据.方法 选择笔者单位2009年5月-2010年3月收治的双下肢烧伤后3 h内入院、总面积小于10%且各下肢深Ⅱ度面积大于1%TBSA的患者22例.依照部位对称、深度相同、面积相近等同体对照原则,将每例患者创面分为VSD治疗组(应用VSD治疗)与对照组(应用10 g/L磺胺嘧啶银霜换药).观察2组患者创面的水分蒸发量、肿胀程度、细菌定植情况、疼痛程度、愈合时间及愈合质量并进行比较分析.数据行t检验与秩和检验.结果 21例患者完成试验,均在伤后4 h内完成创面处理.VSD治疗组正常皮肤及覆盖敷料前创面的水分蒸发量与对照组相近(t值分别为1.310、-0.911,P值均大于0.05);创面覆盖敷料2 h后,敷料表面的水分蒸发量[(44.3±3.9)mL·h-1·m-2]明显少于对照组[(66.1±6.4)mL·h-1·m-2,t=-11.39,P<0.01].伤后3、7 d,VSD治疗组大腿周径较伤后5 h分别增加了(3.48±0.35)、(2.51±0.21)cm,明显小于对照组的(8.02±0.41)、(3.99±0.32)cm(t值分别为4.110、3.569,P值均小于0.01).2组创面入院时及伤后10 d细菌培养阳性率组间比较,差异均无统计学意义(Z值分别为-0.894、0.000,P值均大于0.05);2组伤后10 d细菌培养阳性率均较各组入院时显著降低(Z值分别为-3.220、-3.870,P值均小于0.01).VSD治疗组创面伤后10 d的pH值(7.12±0.06)呈现弱酸性,对照组(7.41±0.13)则为中性.VSD治疗组伤后1、3、7 d创面疼痛程度轻于对照组(t值分别为-16.132、-21.230、-16.453,P值均小于0.01).2组创面愈合时间比较,差异无统计学意义(t=1.186,P>0.05).伤后2、3个月VSD治疗组创面愈合质量评价为佳(100.00%、100.00%),明显优于对照组(19.05%、85.71%,Z值分别为-11.638、-3.870,P值均小于0.01).结论 早期VSD治疗不能使深Ⅱ度烧伤创面愈合时间提前,但能显著提高其愈合质量,是处理深Ⅱ度烧伤创面的有效方法之一,值得临床关注与进一步研究.     

盐酸普萘洛尔乳膏对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机制研究

目的探讨局部外用盐酸普萘洛尔乳膏对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其可能机制。方法取8周龄雌性自发性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠18只,随机分为实验组及对照组(n=9)。于两组小鼠背部左、右侧各制备直径为0.6 cm的圆形全层皮肤缺损创面,实验组及对照组创面分别涂抹含或不含盐酸普萘洛尔的乳膏,术后2、5、7、10、14、17 d重复涂抹1次。术后2、5、7、10、14、17、21 d,观察创面愈合情况,计算创面愈合率;取材行HE染色、Masson染色、甲苯胺蓝染色,观察创面再上皮化、胶原纤维、肥大细胞情况,Western blot检测创面组织中IL-1β和促血管生成素2(angiogenin 2,Ang2)蛋白的表达。结果两组创面均逐渐愈合,但实验组创面愈合速度快于对照组,除术后21 d外,其余各时间点实验组创面愈合率均高于对照组,比较差异有统计学意义(P0.05)。组织学观察示,与对照组相比,实验组创面再上皮化加快,创面内肥大细胞分布较少。Western blot检测示除术后10 d外,其余各时间点实验组IL-1β蛋白相对表达量均低于对照组;术后各时间点实验组Ang2蛋白相对表达量均低于对照组。结论局部外用盐酸普萘洛尔乳膏可促进自发性糖尿病小鼠创面愈合,可能与其减少炎性反应、稳定血管及促进表皮细胞增殖等有关。     

猪内脏膜生物敷料促进兔皮肤创面愈合的实验研究

目的 观察一种用猪内脏膜制成的新型生物敷料对兔皮肤创面愈合的影响.方法 制做兔背全层创伤模型,分成实验组和对照组,创面分别外用新型生物敷料及无菌凡士林敷料.伤后3、5、7、10、14、17、21 d观察两组创面愈合情况和创面愈合率;并分别取创面组织进行病理组织学、羟脯氨酸含量测定及成纤维细胞周期分析等检查,评估创面的修复质量,进行观察比较.两组数据的比较采用t检验,两组间组织病理结构评价采用秩和检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 实验组术后7、10、14、17、21 d创面愈合率分别比对照组高,差异具有统计学意义(P＜0.05);术后第14天进行两组间组织病理等级评价,发现实验组在组织结构、表皮层、基底细胞层及真皮层评价中等级占+++的百分比分别比对照组高.两组之间对比采用秩和检验,差异具有统计学意义(P＜0.05);实验组与对照组平均愈合时间分别为(12.36±2.03)d、(16.82±2.12)d,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组在3、5、7、10、14、17及21 d时,组织羟脯氨酸的含量分别比对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05);创面组织成纤维细胞细胞周期分析结果显示:实验组每时相S期细胞百分比均高于对照组.结论 用猪内脏膜制成的新型生物敷料可加速皮肤创面上皮化过程,使伤口愈合时间提前.可提高皮肤创面愈合质量,促进胶原生成的作用.     

油酸对人正常和瘢痕成纤维细胞增殖和分泌炎症介质的影响

目的 探讨油酸对人正常Fb和瘢痕Fb增殖和分泌炎症介质的影响. 方法 体外培养人正常Fb和瘢痕Fb,分别按照随机数字表法分为7组(各组样本数为8):空白对照组,除常规成分外培养液中不再添加其他物质;乙醇对照组,培养液中加入终浓度为体积分数2％无水乙醇;不同浓度油酸组,即0.25、0.50、1.00、2.00以及4.00 mmol/L油酸组,培养液中分别加入相应终浓度的油酸(以含体积分数2％无水乙醇培养液配制).采用锥虫蓝染色法观察各组细胞培养1～5d的生长情况.于倒置相差显微镜和透射电镜下观察2种细胞2个对照组、1.00 mmol/L油酸组细胞培养2d的细胞结构,采用流式细胞仪检测2种细胞2个对照组及1.00 mmol/L油酸组细胞培养2d的细胞周期.噻唑蓝法检测各组细胞培养2d的增殖情况.取各组细胞培养2d时的培养上清液,采用改良Griess法测定NO含量,ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8含量.对数据进行多因素方差分析及重复测量设计的方差分析. 结果 (1)正常Fb和瘢痕Fb的空白对照组与乙醇对照组比较,各指标均无明显差别.(2)培养2～5d,正常Fb和瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞数量均低于对应的2个对照组(F值分别为13.773、11.344,P值均小于0.01).(3)培养2d,正常Fb和瘢痕Fb1.00 mmol/L油酸组细胞数量明显减少,部分细胞开始堆积、变圆易脱落;细胞膜不完整,线粒体空泡变性,核固缩,胞内可见脂滴.(4)正常Fb 1.00 mmol/L油酸组的G0/G1期和G2/M期细胞百分比[(93.56±9.98)％、(2.01士0.75)％]显著高于空白对照组[(84.23±10.96)％、(0.37±0.16)％],F值分别为3.026、34.751,P＜0.05或P＜0.01;S期细胞百分比为(4.42 ±0.87)％,明显低于空白对照组的(16.06±1.74)％,F=136.120,P＜0.01.瘢痕Fb 1.00 mmol/L油酸组G0/G1期和G2/M期细胞百分比分别为(93.86±13.90)％、(1.89±0.66)％,显著高于空白对照组[(83.88±10.42)％、(0.41±0.17)％],F值分别为3.529、32.710,P＜0.05或P＜0.01;S期细胞百分比为(3.87±0.63)％,明显低于空白对照组的(15.89±2.02)％,F=116.508,P＜0.01.(5)正常Fb和瘢痕Fb 0.50 ～4.00 mmol/L油酸组细胞增殖率显著低于对应的2个对照组(F值分别为215.945、194.555,P＜0.05或P＜0.01).(6)正常Fb各浓度油酸组细胞分泌NO水平明显高于2个对照组(F=30.240,P＜0.05或P＜0.01);瘢痕Fb 1.00～ 4.00 mmol/L油酸组细胞分泌NO水平明显高于2个对照组(F=12.495,P＜0.01).正常Fb和瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞分泌TNF-α、IL-6水平明显高于对应的2个对照组(F TNF-α值分别为6.911、3.818,FIL-6值分别为16.939、11.600,P ＜0.05或P＜0.01).正常Fb和瘢痕Fb各浓度油酸组细胞分泌IL-1β水平显著高于对应的2个对照组(F值分别为25.117、9.137,P值均小于0.01).正常Fb 1.00～4.00 mmol/L油酸组细胞分泌IL-8水平明显高于2个对照组(F=2.717,P＜0.05或P＜0.01),瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞分泌的IL-8水平明显高于2个对照组(F=3.338,P＜0.05).正常Fb和瘢痕Fb相同浓度油酸组各炎症因子水平比较无明显差异(F值为0.120 ～3.766,P值均大于0.05). 结论 高浓度油酸虽能抑制瘢痕Fb增殖,但同时也抑制正常Fb增殖,且高浓度油酸能同时促进正常Fb和瘢痕Fb分泌炎症介质,从而导致过度、持续的炎症反应,不利于创面愈合.     

血竭素高氯酸盐对成纤维细胞增殖与成纤维细胞生长因子mRNA表达的影响

目的 观察血竭素高氯酸盐(Dp)对人皮肤成纤维细胞(Fb)生物学特性的影响,探讨其促进创而愈合的机制.方法 分离培养人正常Fb,将Dp以不同浓度(0.063、0.125、0.250、0.625、1.250、2.500 mg/L)分别加入培养液,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测Dp在不同浓度以及不同时间点对体外培养的Fb增殖作用的影响.通过流式细胞仪,实时荧光定量聚合酶链式反应( real-time PCR)分别检测最适浓度培养条件下Fb的细胞周期变化以及成纤维细胞生长因子(FGF) mRNA的合成表达.结果 Dp在0.625～1.250 mg/L浓度范围内,其吸光度值(0.237±0.012、0.243±0.017)均高于对照组(0.208±0.011)差异有统计学意义(t值分别为2.11、2.23,P＜0.05),此浓度范围可促进Fb增殖,且呈剂量依赖性,在浓度为1.250 mg/L时(A值0.243±0.017),促增殖作用最为显著(t =2.23,P＜0.01),流式细胞仪结果显示,在浓度为1.250 mg/L时,Dp可明显促进Fb通过G1/S及S/G2期限制点,S期及G2/M期细胞与对照组比较明显增多,G0/G1期细胞与对照组比较明显减少(t值分别为4.32、7.53、3.27,P＜0.05).细胞因子mRNA表达测定中,1.250 mg/L Dp组与对照组比较表达明显上调,差异亦有统计学意义(=1.48,p＜0.05).结论 Dp能显著促进Fb增殖,加快Fb周期进程,同时可促进FGF的mRNA表达,可能与血竭促进创面愈合的机制有关.     

褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌转化生长因子β1的影响及其机制

目的 研究褪黑激素对增生性瘢痕Fb分泌TGF-β1的影响及机制. 方法 采用组织块法分离培养人增生性瘢痕Fb,按随机数字表法将细胞分为褪黑激素组、褪黑激素+Luzindole(褪黑激素受体拮抗剂)组、Luzindole组和对照组(仅以细胞培养液培养),前3组每孔细胞分别添加相应物质与细胞培养液培养,褪黑激素终浓度为1×10-3 mmol/L、Luzindole终浓度为1 mmol/L.每组10个复孔.培养24 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1含量,实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1、Smad 7和Rho激酶(ROCK) mRNA表达.对数据进行单因素方差分析或LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验,组间比较采用Nemneyi法. 结果 褪黑激素组Fb上清液中TGF-β1含量为(2.8±2.4) pg/mL,低于褪黑激素+Luzindole组的(23.9±2.7)pg/mL、对照组的(28.9±2.0) pg/mL和Luzindole组的(24.9 ±2.8)pg/mL(F=94.58,P＜0.05).褪黑激素组细胞TGF-β1 mRNA表达量为11.9±1.2,明显低于其他组(F=20.79,P＜0.05)；褪黑激素+Luzindole组TGF-β1mRNA表达量(14.9±1.8)与对照组(17.2±0.6)比较差异无统计学意义(t=0.806,P＞0.05).褪黑激素组Fb Smad 7 mRNA表达量(0.076±0.080)明显高于对照组(0.023±0.024)、褪黑激素+Luzindole组(0.026 ±0.026)、Luzindole组(0.037±0.021),x 2=9.567,P＜0.05.褪黑激素组ROCK mRNA的表达量明显低于对照组(0.002 30±0.002 70)、褪黑激素+Luzindole组(0.001 30±0.001 20)和Luzindole组(0.001 10 ±0.001 20),x 2=9.420,P＜0.05. 结论 褪黑激素可通过与受体结合,上调瘢痕Fb中Smad 7表达、下调ROCK表达,从而抑制增生性瘢痕Fb表达TGF-β1.     

几丁糖/海藻酸敷料对海水浸泡创面作用的实验研究

目的 观察几丁糖(chitosan,CTS)/海藻酸(alginate,ALG)敷料对大鼠海水浸泡创面的作用.方法 取健康SD大鼠25只,体重250～300 g,于脊柱两侧切取直径1.8 cm圆形创面,制作皮肤创面模型,左侧为实验组,右侧为对照组.将创面浸泡于预先配置的人工海水1 h后,实验组采用CTS/ALG敷料外敷创面,对照组用无菌纱布外敷.行大体观察并记录创面愈合时间;术后3、5、7、10、12 d切取包括创面在内的2 cm×2 cm皮肤标本,行HE染色和免疫组织化学Envision法染色,观察创面组织学改变及EGF受体(EGF receptor,EGFR)、bFGF表达情况.结果 实验组创面炎性反应轻,结痂收缩较快;对照组创面结痂收缩较慢.实验组创面完全愈合时间为(11.68±0.57)d,对照组为(12.51±0.54)d,比较差异有统计学意义(P＜0.05).实验组自术后3 d开始出现肉芽组织增生及细胞浸润,胶原组织增生,创面皱缩及上皮化,至术后10 d胶原组织已排列整齐,上皮化过程基本完成,可见皮肤附件出现,术后12 d完全愈合;对照组相应时间点细胞浸润出现晚,且出现肉芽组织伴溃疡,上皮化过程较晚.免疫组织化学观察示实验组术后3、5 dbFGF在血管内皮细胞和间质纤维母细胞内高表达,EGFR在血管内皮细胞内高表达,术后7、10、12 d呈低表达;对照组术后相应时间点bFGF及EGFR呈低表达和无表达.结论 CTS/ALG对海水浸泡创面具有促进愈合作用,但其机制仍有待进一步深入研究.     

美宝湿润烧伤膏治疗乳腺脓肿的疗效观察

目的:观察美宝湿润烧伤膏对乳腺脓肿切排术后创面愈合是否有促进作用.方法:选择乳腺脓肿切排术后病人47例,随机分为实验组(25例)和对照组(22例),实验组采用美宝湿润烧伤膏(MEBO)换药,对照组采用常规方法换药,观察伤口愈合情况.结果:实验组和对照组愈合天数分别为24.3±9.2d和37.6±14.5d(P＜0.05),换药次数分别为10.5±4.0和17.5±5.0(P＜0.05).结论:美宝湿润烧伤膏对乳腺脓肿切排术后创面愈合有明显促进作用.     

血小板源性生长因子BB对大鼠肌腱愈合和肌腱粘连的影响

目的 了解血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)基因转染大鼠肌腱细胞对肌腱愈合及肌腱粘连的影响. 方法 将90只SD大鼠制成跟腱损伤模型,按随机数字表法分为3组,每组30只:实验组,肌腱断端注射20μL转染PDGF-BB基因的大鼠肌腱细胞(1×108个/mL);对照组,肌腱断端注射20μL未行转染的大鼠肌腱细胞(1×108个/mL);空白对照组,不做任何处理.6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱,管型石膏固定1周.通过基因测序及RT-PCR鉴定转染PDGF-BB基因的大鼠肌腱细胞.分别于术后3 d和1、2、4、8周取各组大鼠肌腱组织样本,行大体、组织学观察以及生物力学检测,对比各组肌腱粘连度、组织中Fb数量与胶原纤维含量、肌腱最大抗拉力及最大滑动距离、组织中PDGF-BB的浓度.对数据行t检验. 结果(1)转染的肌腱细胞经RT-PCR以及基因测序证实在体外稳定表达PDGF-BB mRNA.(2)各组大鼠术后3 d肌腱均出现较明显肿胀及炎性细胞浸润,实验组改变较其他组明显轻微;随后各组情况均逐渐好转.术后4、8周肌腱粘连度分级组间比较未见明显差异.(3)实验组Fb数在术后2、4、8周显著低于对照组和空白对照组(t值分别为2.94、4.26、5.76和4.00、3.83、6.12,P＜0.05或P＜0.01).(4)实验组术后4周胶原纤维含量为(43±6)%,较对照组[(55±8)%]与空白对照组[(61±8)%]显著下降(t值分别为2.94和4.41,P＜0.05或P＜0.01).(5)术后4、8周实验组肌腱最大滑动距离为(3.25±0.33)、(3.65±0.21)mm,显著高于对照组的(2.29±0.40)、(2.21±0.37)mm和空白对照组的(2.01±0.23)、(1.89±0.24)mm(t值分别为4.53、8.29和7.55、13.52,P值均小于0.01),但其肌腱最大抗拉力与另2组比较差异无统计学意义(t值分别为0.41、0.41和0.77、0.72,P值均大于0.05).(6)术后3 d和2、4周,实验组肌腱组织中PDGF-BB浓度为(12.95±1.36)、(8.32±0.94)、(9.10±1.06)ng/mL,均显著高于对照组的(1.13±0.21)、(2.07±0.48)、(3.85±0.39)ng/mL(t值分别为21.04、14.50、11.39,P值均小于0.01). 结论 转染PDGF-BB基因肌腱细胞有促进肌腱内源性愈合、减轻肌腱粘连的作用.     

蛆虫分泌物对糖尿病大鼠溃疡组织bFGF和结缔组织生长因子表达的影响及抗茵作用研究

目的 探讨蛆虫分泌物对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠溃疡组织bFGF和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响及预防细菌感染的作用.方法 取3月龄雄性SD大鼠40只,体重300～350 g,制备DM大鼠溃疡创面模型.随机分为2组(n=20),实验组创面涂以丝光绿蝇蛆虫的分泌物,对照组不予处理.术后1～21 d观察创面大体情况,7、14、21 d分别记录两组溃疡面积;术后14 d取两组溃疡组织,制备组织切片,行HE染色观察;3、7、14 d取溃疡表面分泌物行常规细菌培养,检测细菌感染情况;术后7、14、21 d用免疫组织化学法处理切片,显微镜下对bFGF、CTGF阳性表达细胞进行计数分析.结果 实验组创面清洁,新鲜肉芽生长,无脓性分泌物,愈合情况良好,无金色葡萄球菌感染;对照组创面渗出、糜烂严重,创面不断加大加深,愈合情况不良,金色葡萄球菌感染率为60%.术后7、14、21 d实验组溃疡面积分别为(1.83±0.23)、(0.39±0.08)cm2和0,对照组分别为(2.18±0.67)、(3.57±0.53)、(3.94±0.67)cm2;两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).14 d组织学观察示实验组上皮组织新生,创缘炎性坏死物减少,纤维瘢痕形成;对照组大量炎性细胞浸润,坏死组织较多.术后7、14 d,实验组bFGF阳性表达数分别为23.76±3.34、52.76±4.84,对照组为18.88±2.16、46.04±4.00;实验组CTGF阳性表达数分别为18.76±3.24、46.52±4.07,对照组为12.52±3.03、40.52±3.96;两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)21 d,两组bFGF及CTGF阳性表达数差异无统计学意义(P＞0.05).结论 蛆虫分泌物能提高DM溃疡组织bFGF、CTGF的表达,有效促进创面愈合,预防组织细菌感染.     

深Ⅱ度烧伤创面伤后24小时内削痂的安全性和促进愈合的临床观察

目的探讨深Ⅱ度烧伤创面伤后24h内削痂的安全性和临床疗效.方法12例有削痂手术指征并在伤后24h内实施削痂术的深Ⅱ度烧伤患者为实验组,并选14例条件相似并按常规在伤后4～6d行削痂术的深Ⅱ度烧伤患者作为对照组.结果两组病人在休克期补液量、休克期休克征象发生上无显著差别,而实验组创面愈合天数为(19.08±5.31)d,较对照组(29.36±7.03)d明显减少(P＜0.01),同时实验组的休克期尿量明显增多,回吸收期的体温、心率较对照组明显改善.结论深Ⅱ度烧伤创面伤后24h内削痂是安全的,并能缩短创面平均愈合天数.     

硼酸换药对糖尿病小鼠创面愈合的促进作用及其对mRNA表达的影响

目的探究4%硼酸溶液换药对糖尿病小鼠创面愈合的促进作用及其对创面mRNA表达的影响。方法雄性8周龄C57BL/6J小鼠30只,随机分为糖尿病组与对照组,每组各15只,糖尿病小鼠模型用链脲佐菌素诱导制作。在小鼠背部制作3个同等大小的全层皮肤创面后,每日1次分别以生理盐水(A处理法)、4%硼酸溶液(B处理法)和0.5%碘伏+3%过氧化氢溶液(C处理法)对创面换药,记录创面愈合率,创面结痂和感染情况,在伤后3d、7d、14d断颈处死小鼠后取创面组织,进行组织总RNA提取和实时荧光定量PCR,检测创面转化生长因子β1(TGF-β1)、I型胶原蛋白mRNA的表达。结果糖尿病组B处理法各时相点创面愈合率显著高于A、C处理法(均P0.05)。14d时糖尿病组硼酸处理法TGF-β1mRNA表达显著高于对照组的硼酸处理组(P0.01)。结论硼酸的弱酸性能刺激创面TGF-β1活化,促进创面愈合。     

半导体激光局部照射对SD大鼠缺血皮瓣愈合时ICAM-1和MCP-1表达的影响

目的 观察半导体激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣创面愈合时组织中炎症反应因子细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的表达,探讨其促进缺血皮瓣愈合的机制。方法 在20只雄性SD大鼠背部两侧对称各制备2个皮瓣,蒂位于尾侧,长6 cm,宽1 cm,2个皮瓣间距离2 cm。实验侧(实验组)皮瓣术后行半导体激光照射,每天1次,连续照射数天直至取材,同时遮挡对照侧(对照组)。采用自身对照法比较实验组和对照组的创面愈合情况和皮瓣存活面积,分别于术后4、7、10、14 d取皮瓣中段组织进行病理学染色,分析制备的大鼠皮瓣血管形成情况和炎症反应因子ICAM-1和MCP-1的表达。结果 皮瓣远端发生明显的缺血坏死。术后7 d,实验组和对照组的皮瓣存活率分别为(84.6±10.8)%和(79.8±11.3)%,实验组皮瓣存活率明显高于对照组(n=5,t=7.299,P=0.002)。术后4、7、10、14 d实验组微血管密度分别为(74.160±25.968)、(115.937±17.827)、(87.330±21.383)、(69.644±12.126)个/mm~2,均明显高于对照组(33.460±8.310)个/mm~2(t=3.089,P=0.037)、(36.685±7.693)个/mm~2(t=11.741,P=0.000)、(43.474±7.400)个/mm~2(t=4.185,P=0.014)、37.104±8.721(t=5.218,P=0.006)。术后4 d实验组炎症因子ICAM-1的表达量0.063±0.015明显高于对照组0.045±0.017(t=8.430,P=0.001);术后7 d实验组炎症因子ICAM-1和MCP-1的表达量分别为0.022±0.008、0.041±0.008,均明显低于对照组0.042±0.015(t=4.309,P=0.013)、0.065±0.007(t=6.731,P=0.003)。结论 半导体激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣能调节创面愈合时炎症因子ICAM-1和MCP-1的表达,是促进缺血皮瓣愈合的重要机制之一。