去氢甲睾酮单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备去氢甲睾酮(DMT)的单克隆抗体(mAb),为采用免疫法分析食品中该激素的残留提供基础.方法:通过采用碳二亚胺法合成的完全抗原DMT-KLH免疫BALB/c小鼠,经过效价测定,ELISA方法建立,细胞融合、筛选和亚克隆,建立了去氢甲睾酮mAb杂交瘤细胞株,并采用ELISA方法测定mAb纯化后的效价、IC50、交叉反应率和抗体亲和力等参数,以及对猪肉样品中的DMT加标含量进行测定.结果:经过3次亚克隆成功建立1株分泌去氢甲睾酮mAb的杂交瘤细胞株,纯化后抗体的蛋白浓度为0.87 mg/mL,效价为1∶32 000,IC50值为7.57 μg/L,亲和常数为3.09×109L/mol与丙酸睾酮酯、群勃龙的交叉反应率均小于1％,猪肉样品中平均加标回收率为97.73％.结论:成功筛选到分泌DMT mAb的杂交瘤细胞株,并对其产生的mAb的效价、IC50值、特异性、稳定性、IgG亚类和亲和力等特性进行了鉴定,为下一步开展DMT免疫学检测方法研究奠定了基础.     

抗土霉素单克隆抗体的制备及其特性分析

目的:制备抗土霉素(OTC)的单克隆抗体(mAb),对其特异性和竞争ELISA的实用性进行分析。方法:通过碳二亚胺法和羰基二咪唑法分别将OTC与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备mAb,鉴定mAb的特异性并用于竞争ELISA效果分析。结果:获得1株能稳定分泌抗OTC的mAb杂交瘤细胞株,mAb腹水的ELISA效价为3×104,土霉素竞争ELISA检测下限为1mg/L。结论:抗OTC的mAb具有抗原结合特异性,可用于OTC竞争ELISA免疫学检测。     

抗阿莫西林单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

目的: 制备抗阿莫西林小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测动物原性食品中残留的阿莫西林提供基础.方法: 将小分子的阿莫西林交联在大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗阿莫西林mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测单抗与氨苄西林和头孢唑啉的交叉反应.结果: 通过ELISA筛选出5株可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型4株为IgG1/κ,1株为IgG2a/κ.亲和力在2.1×109~4.7×109.这5株mAb与氨苄西林的交叉反应为100%,与头孢唑啉没有交叉反应.结论: 获得5株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗阿莫西林抗体的杂交瘤细胞株,同时因为与氨苄西林的交叉反应为100%,这使得进一步研发动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留的免疫检测技术和产品成为可能.     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体,为建立TRAIL酶联吸附检测方法奠定基础。方法以原核表达系统重组制备的可溶性人sTRAIL作为抗原,利用杂交瘤技术筛选获得抗人TRAIL?mAb杂交瘤细胞株。体内诱生法生产腹水,经间接ELISA方法检测腹水效价,Western?blot鉴定抗体特异性。结果制备获得一株可稳定分泌抗人TRAIL?mAb的杂交瘤细胞株,属IgG2b亚类;腹水效价达1:5×106以上,Western?blot鉴定结果显示可特异性识别人TRAIL,而与TNF-α和Fas-l无明显的交叉反应。结论制备了具有高特异抗原结合特性的TRAIL?mAb。     

抗多菌灵单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的:制备抗多菌灵小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测蘑菇、干菇类中残留的多菌灵提供基础。方法:将小分子的多菌灵交联在大分子载体匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗多菌灵mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测mAb的交叉反应,及初步竞争抑制检测。结果:通过ELISA筛选出7株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型均为IgG1。与同属于苯并咪唑类杀菌剂的苯菌灵和甲基硫菌灵没有交叉反应。竞争抑制检测结果显示MC-3细胞株竞争效果较好。结论:获得1株高特异性、高亲和力、能稳定分泌抗多菌灵抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研发多菌灵残留免疫检测技术和产品奠定基础。     

小鼠抗猪生长抑素单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备生长抑素(SS)单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性进行鉴定。方法用偶联方法制备SS免疫原复合物,用免疫原复合物免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备SS mAb。用间接ELISA检测mAb的亚型及效价,用定量ELISA检测mAb 2E7的含量,用间接ELISA检测mAb的特异性和mAb在体外、体内对SS的中和作用。结果获得两株能稳定分泌SS mAb的杂交瘤细胞株2A5、 2E7,两株抗体的亚型均为IgG1,2A5效价为1∶100 000,2E7效价为1∶1 000 000, 2E7含量为5.4 mg/mL。SS mAb只特异性地和SS纯品及SS免疫原复合物发生免疫反应,不和单纯载体蛋白(牛血清白蛋白)发生免疫反应,也不和其他肽类物质如生长激素、胰岛素、胃泌素发生交叉反应。SS mAb在体外能抑制SS和兔抗SS抗体的免疫反应,注射到体内能中和机体内的SS,从而促进生长激素的分泌。使循环血中生长激素的含量显著增加。结论成功制备了SS mAb,该mAb浓度大、效价高、特异性强,对SS功能具有较强的免疫中和作用。     

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。     

嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydophila)抗独特型单克隆抗体(AId mAb)并进行鉴定.方法:以具有中和作用的抗嗜水气单胞菌 mAb 1G10免疫 BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备嗜水气单胞菌 AId mAb.用 ELISA法对 mAb的效价及其模拟嗜水气单胞菌的特性进行鉴定.结果:获得4株能稳定分泌嗜水气单胞菌 AId mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、 1H10、 3F5、 4G3.经测定杂交瘤细胞腹水 mAb效价为10 -4～10 -5.竞争抑制实验结果表明 4株 AId mAb均能不同程度地抑制嗜水气单胞菌与兔抗嗜水气单胞菌多克隆抗体结合,其中两株 1F9、 1H10具有较强的抑制作用.用作制备抗独特性抗体腹水的小鼠,其血清均能检测与嗜水气单胞菌进行免疫结合的抗体,经 ELISA检测,其效价为 1: 100 ～1: 1 000.结论:成功地制备了产生嗜水气单胞菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株,为制备该菌的抗独特性抗体疫苗奠定了基础.     

人细胞角蛋白19片段单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备人细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)的单克隆抗体(mAb),并对其免疫特性进行鉴定。方法用重组CYFRA21-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取血清效价最高小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出阳性杂交瘤细胞株,进行亚克隆,并鉴定分泌抗体亚型;制备小鼠腹水,用protein G从腹水中纯化出CYFRA21-1的mAb;用间接ELISA测定mAb的效价,Western blot和竞争ELISA对mAb的免疫特性进行检测,竞争ELISA对mAb的临床应用性进行评价。结果获得2G8和12G7两株能稳定分泌人CYFRA21-1mAb的杂交瘤细胞株,其分泌抗体都为轻链为κ的IgG1;两株mAb都能特异识别人血清中的CYFRA21-1,效价分别为1×10-6和5×10-7;检测134份血清样本CYFRA21-1含量的结果与北京源德生物医学工程有限公司CYFRA21-1化学发光法定量检测试剂盒检测结果的相关性分别为y=0.8167x+0.3755(r=0.9772)和y=0.8142x+0.3655(r=0.9770)。结论成功制备两株人CYFRA21-1的特异mAb,为后期人血清CYFRA21-1定量测定试剂盒的完全国产化奠定了良好的基础。     

抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体制备和鉴定及其应用

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)的单克隆抗体(mAb),并对该Hp mAb进行分析鉴定,建立一种检测患者由于Hp感染而在血清中产生Hp抗体的竞争ELISA检测方法。方法用灭活的Hp免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备Hp mAb。我们采用Hp混合蛋白包括毒素相关蛋白A(CagA)、空泡毒素A(VacA)和尿素酶以及灭活的Hp菌体筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA和Western blot等技术对所获得的Hp mAb进行鉴定。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记所筛选的Hp mAb来建立一个可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结果通过大规模的杂交瘤筛选,我们选择了1株将其命名为C3 Hp mAb,其抗体亚型为IgG2a,腹水效价可达1×107。Western blot法、ELISA和质谱检测结果显示,该C3 Hp mAb能特异地识别Hp的尿素酶B亚单位。用这个C3 Hp mAb,我们建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结论成功获得一种可以特异识别Hp尿素酶B亚单位的mAb,建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。     

抗重金属Cr3+单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备重金属Cr3+的单克隆抗体(mAb)并建立间接竞争ELISA法,用于Cr3+的检测。方法:用合成的重金属铬-螯合剂-BSA抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆化和ELISA等技术建立杂交瘤细胞株;腹水型mAb经硫酸铵沉淀纯化后建立间接竞争ELISA法并与9种金属进行交叉实验;水样加标后,进行间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的比较,计算两种方法符合率。结果:获得3株稳定分泌抗重金属Cr3+mAb的杂交瘤细胞株,其中5G12C5株mAb间接ELISA效价>1∶1×105,间接竞争ELISA法检测Cr3+的范围为0.783~50μg/L,最低检测限为1μg/L,与Fe3+存在<10%交叉,而与其他金属无交叉反应;当水样中加标量>1μg/L时,间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的符合率达96.95%。结论:获得效价高、特异性强的重金属Cr3+mAb,初步建立了检测Cr3+的间接竞争ELISA法,该方法检测的灵敏度可达到国家地下Ⅰ类水的检测标准(0.005 mg/L)。     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

副溶血弧菌单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用灭活的副溶血弧菌免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备副溶血弧菌mAb。用间接ELISA法对mAb的效价进行测定。结果:获得4株能稳定分泌副溶血弧菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1E3、5F12、5D8、6H9。经测定杂交瘤细胞腹水mAb效价分别为1×10-4～1×10-7。4株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类分别是:IgG2b,IgG2a,IgG2b,IgG3。交叉反应试验显示,mAb 5D8与弧菌属其他几种细菌均不起反应,特异性强。副溶血弧菌生长抑制及动物保护实验结果表明4株mAb均能不同程度地抑制副溶血弧菌的生长并对动物具有保护作用,其中5F12保护效果最强。结论:成功地制备能稳定分泌副溶血弧菌mAb的杂交瘤细胞株,为建立该病的免疫学诊断及防治的奠定了基础。     

镉离子单克隆抗体的鉴定及竞争ELISA的建立

目的 制备Cd2+单克隆抗体(McAbs,单抗),建立Cd2+ 间接竞争酶免疫学检测方法 (EHSA).方法 利用双功能螯合剂iEDTA将Cd2+分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备免疫抗原和检测抗原.免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术制备抗Cd2+的单抗.鉴定单抗的效价、特异性、亚类及亲和力.以该抗体为基础建立检测镉离子的间接竞争ELISA方法 ,分析该方法 的灵敏度、检测限、工作范围.结果 成功制备出Cd-iEDTA-KLH和Cd-iEDTA-BSA偶联物;筛选出一株稳定分泌抗Cd-iEDTA单抗的杂交瘤细胞株C2G5该细胞株分泌的抗体亚类为IgG1,腹水抗体效价为1×106,相对亲和力结合常数Ka为1.6×109 L/mol.特异性结果 显示,除Hg2+外,该抗体与Ph2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Ca2+、Cu2+等金属离子的交叉反应低.建立了检测镉离子的间接竞争ELISA方法 ,该方法 的检测限为10 ng/mL,IC50为250 ng/mL.结论 建立了镉离子的竞争ELISA检测方法 ,检测限达到无公害水产品的国家标准(100 ng/g).     

抗丁型肝炎病毒mAb的制备及其初步应用

目的 :以基因工程表达丁型肝炎病毒抗原蛋白 (HDAg)为抗原 ,建立分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞系 ,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法 :用Ni NTA技术纯化HDAg免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备mAb。采用ELISA及免疫组化技术进行鉴定。结果 :筛选出 2株能稳定分泌特异性抗 HD的mAb杂交瘤细胞株 (HD1,HD2 ) ,经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体 ,特异性强 ,效价高。应用于ELISA测定患者血清HDAg均呈特异性阳性反应。免疫组化检测肝组织显示 ,针对该mAb的抗原主要分布于细胞核或浆内。结论 :此两株丁肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丁肝抗原具有特异亲和性 ,为丁型肝炎病毒的临床诊断及病理检测提供技术基础     

His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备和鉴定抗His标签单克隆抗体(mAb),初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法.方法:用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株.常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定.结果:His-tag完全抗原偶联成功,经细胞融合、筛选及克隆化,成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株.制备腹水测得腹水效价高于 1:106,且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应,并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果.结论:成功制备了1株His标签mAb,为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具.     

斑点酶免疫渗滤法定量检测雌三醇的实验研究

目的 制备高特异性的抗雌三醇(E3)单克隆抗体(mAb),建立操作简便、敏感、快速适用于基层使用的E3检测方法.方法 采用活化酯法制备偶联物E3-HRP、E3-BSA、3-OVA.应用mAb技术制备抗E3的mAb;以硝酸纤维素膜为固相载体,抗E3 mAb为包被抗体,建立竞争抑制模式的斑点酶免疫渗滤法.结果 筛选出5株可分泌特异性抗E3 mAb的杂交瘤细胞株.mAb效价为1×105～5×105,亲和常数为5.1×108 ～ 5.2×109 L/mol.检测敏感度为2 ng/mL,检测范围2～200 ng/mL.结论 建立了检测速度快、灵敏度高、应用方便的斑点酶免疫渗滤法.     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。     

抗HCV HVR1模拟合成肽单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗-HCV高变区1(HVR1)合成肽单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以固相合成的HCV HVR1合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,免疫8周龄的BALB/c小鼠。采用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备抗-HCV HVR1 mAb。经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后,用相关的试剂盒鉴定小鼠mAb的Ig亚类;经中和抑制后用ELISA法检测mAb的特异性;用间接ELISA法检测mAb腹水的效价及相对亲和常数。结果:获得1株可分泌抗-HCV HVR1合成肽特异性mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11。该株mAb的Ig亚类为IgG3;腹水效价为3.125×10-5;相对亲和常数为1.0×106L/mol。该株mAb与HBsAg、HBeAg、HBcAg、HAAg、牛血清白蛋白、酪蛋白和胸腺5肽均无交叉反应,与HCV HVR1合成肽-牛血清白蛋白出现特异性反应。结论:成功地建立了1株可分泌抗-HCV HVR1 mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11,为进一步的实验研究提供了重要的制剂。