应用实时荧光PCR分析apoE3、4等位基因

目的 建立实时荧光PCR进行apoE单核苷酸多态性(SNP)分析法,快速检测人栽脂蛋白E(apoE)等位基因.方法 以人apoE基因中的Cys112Arg为研究对象,用荧光染料SYBR Green Ⅰ标记PCR产物,通过熔解曲线分析结果,并进行SNP分型.用高保真DNA聚合酶提高SNP测定的特异性;通过DNA测序验证荧光定量PCR对apoE基因Cys112Arg分型结果的准确性.结果 每个样品设立2个检测管,利用下游引物P2和SNP检测引物P33、P44进行定量PCR反应,30份样品各自获得2种等位基因扩增产物的熔解曲线,通过熔解曲线的Tm值判读,在30份样本中,apoE基因型3/3、3/4分别有27例和3例,与PCR-RFLP及DNA测序结果一致.结论 建立的apoE等位基因分型法操作简便,结果准确,适合人外周血apoE等位基因的定性检测.     

实时荧光PCR熔解曲线法快速鉴定嗜肺军团菌

摘要：目的：建立特异、快速、敏感的实时荧光PCR熔解曲线基因分型方法,并探讨该法在鉴定嗜肺军团菌中的应用价值。 方法：根据嗜肺军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物和猝灭FRET探针建立实时荧光PCR熔解曲线方法,优化引物与探针浓度,用15株嗜肺军团菌、30株非嗜肺军团菌及7株其他病原菌标准菌株验证该方法的特异性、敏感性和重复性,用该法检测117例临床痰标本并进行基因测序。 结果：15株不同血清型的嗜肺军团菌Tm值均为57 ℃;7株非嗜肺军团菌Tm值为43 ℃,1株Tm值为45 ℃;其余22株非嗜肺军团菌和7株其他病原菌均无明显Tm值。该方法最低检出限可达0.1 pg/μL。检测117例痰标本发现3株嗜肺军团菌,与PCR基因测序法检测结果一致。 结论：实时荧光PCR熔解曲线法可特异、快速和敏感地检测嗜肺军团菌,适用于临床痰标本的嗜肺军团菌检测。     

高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较

摘要:目的:评价LC Green、Syto 9和Eva Green 3种高分辨熔解（HRM）染料对单核苷酸多态性（SNP）基因分型的能力。 方法:以肿瘤坏死因子（TNF）基因启动子-857 C>T（rs1799724）位点为例,分别用上述3种荧光染料进行PCR-HRM检测,依据特征熔解曲线进行基因分型并测序验证。基因分型能力评价以野生型与纯合突变型PCR产物Tm值之差（△Tm）来表示。 结果:PCR-HRM检测到4种特征熔解曲线,经测序后发现第4条为双突变杂合,包含863C>A（rs1800630）位点。HRM染料LC Green, Syto 9, EVa Green的基因分型能力分别为(0.52±0.030) ℃、(0.51±0.066) ℃和(0.39±0.152) ℃。其中Syto 9野生型(CC)和突变型（TT）的变异系数（CV）均为0.03%,为3种染料中最低。 结论:3种染料均能用于HRM技术进行SNP基因分型,Syto 9和LC Green分辨率优于Eva Green,其中Syto 9易用性最好、Eva Green性价比最高。     

熔解曲线法用于肺癌APC基因甲基化模式的研究

目的 以熔解曲线法测定4株肺癌细胞株和肺癌病人APC基因启动子区的甲基化模式.方法 以脐血淋巴细胞DNA及其转甲基后的DNA经化学修饰、克隆测序的质粒,作为完全非甲基化和完全甲基化标准品.设计通用引物,采用加入荧光染料SYBR Green I的荧光定量PCR法扩增包含21个CpG位点的APC基因启动子区的目的序列,以熔解曲线法通过与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值比较,确定四株肺癌细胞株(NCI-H446,NCI-H460,SPCA1,NCI-H520)在该区段的甲基化模式,并通过克隆测序验证.同时测定两例肺癌患者癌组织中APC基因启动子区甲基化模式.结果 四株肺癌细胞株中,NCI-H446,SPCA1和NCI-H520的Tm值与完全非甲基化标准品的Tm值相同,而NCI-H460的Tm值有两个,分别与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值吻合,并经克隆测序验证.两例肺癌患者癌组织的Tm值位于完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值之间.结论 小细胞肺癌细胞株NCI-H446,肺腺癌细胞株SPCA1和肺鳞癌细胞株NCI-H520的APC基因启动子区为完全未甲基化型,而大细胞肺癌细胞株NCI-H460APC基因启动子区甲基化模式为等位基因杂合型.两例肺癌患者癌组织中的APC基因启动子均为部分甲基化型.熔解曲线法是简单、经济和实用的甲基化模式检测方法.     

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。     

IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化检测方法的探讨

目的 探讨人和小鼠的IG-1R 、PRKCZ基因启动子区DNA甲基化检测的方法.方法 用亚硫酸氢钠处理人外周血白细胞基因组DNA及小鼠骨骼肌组织中DNA标本,以修饰后的DNA为模板,对人和小鼠两个不同基因分别设计合适的引物对启动子区进行Touch-Down PCR扩增,PCR产物进行克隆测序.结果 在利用合适的引物对修饰后DNA模板进行扩增时均能扩增出目的 片段,克隆测序结果显示IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化的胞嘧啶碱基C不变,而非甲基化的胞嘧啶碱基C转变为胸腺嘧啶碱基T.结论 成功的建立了人和小鼠IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化的检测方法,为进一步探讨这两种基因启动子区甲基化与相关疾病的关系奠定基础.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立

目的建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、测序。结果测序结果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基则不改变。结论成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化检测的方法,为探索基因启动子区甲基化与疾病的关系做出了铺垫。     

建立PCR熔解曲线法检测HBV基因型

摘要：目的：建立检测HBV基因型的PCR熔解曲线法,并验证该方法临床应用的可靠性。 方法：依据文献报道的HBV B、C型全基因组序列,分别设计B、C型的特异引物序列,建立HBV基因分型的PCR熔解曲线法。用该法检测186例HBV DNA阳性血清样本,并从中选取51例样本,用商品化的HBV基因分型试剂盒进行检测,用Kappa一致性检验对两法检测结果进行比较。 结果：186例标本中,PCR熔解曲线法检测到B型133例（71.5％）,C型37例（19.9％）,B/C混合型16例（占8.6％）。选取的51例样本中,熔解曲线法与市售试剂盒检测B型符合率100％,C型符合率100％,B/C混合型符合率81.25％,总符合率94.1％（Kappa=0.909,P＜0.05）。 结论：建立的PCR熔解曲线法操作简便,与商品试剂盒的检测结果有较高的符合率,可用于临床上HBV B、C以及B/C混合型的检测。     

乙型肝炎病毒前C区基因变异检测及意义

目的　用PCR产物直接测序法检测乙型肝炎病毒前C区基因变异,以指导临床合理使用抗病毒药物。方法　应用套式聚合酶链反应扩增包括前C区基因在内的DNA片段,采用Sanger双脱氧链末端终止法,在ABIPRISM310型核苷酸序列分析仪上直接测序。结果　对8例临床标本进行测序,检出5例G     

建立检测细胞色素P450酶与紫杉醇代谢相关突变位点的基因芯片分型方法

目的 建立针对与临床抗癌药物紫杉醇代谢相关的细胞色素P450(CYP450)酶基因多态性位点的快速、准确、高通量的基因芯片基因分型方法.方法 选取CYP450酶2C8*3、3A4* 18、3A5*3C等3个与紫杉醇代谢相关突变位点,根据基因库中报道的序列,设计每个基因多态性位点的野生型和突变型探针,在突变位点2侧设计PCR扩增引物,PCR片段长度应＜200 bp,并构建标准质粒.探针在3'端氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3,将探针按一定顺序点样于经醛基化处理的玻片制备成基因芯片.人体血液DNA样本分别通过3对引物扩增后与基因芯片上的探针杂交,通过扫描图像和配套软件对结果进行分析和判断.同时,对50份血液样本进行检测.结果 通过标准质粒杂交结果显示,每个位点对应的1对探针均能将野生型和突变型质粒进行准确地区分,无非特异性杂交信号出现;检测50份血液样本,CYP2C8 * 3位点的突变率为2%,CYP3A4 * 18位点均为野生型,CYP3A5 * 3C位点的突变率为62%.同时,通过测序法进行验证,基因芯片方法与测序方法的结果完全一致.结论 建立的同时检测抗癌药物紫杉醇代谢相关的CYP450酶基因多态性位点CYP2C8*3、CYP3A4 * 18、CYP3A5 * 3C的基因芯片分型方法快速、准确,结果可靠,重复性好,可用于指导紫杉醇患者的个体化用药,并为分析个体患者对于紫杉醇药物体内代谢提供了一个高通量技术平台.     

Multicolor real-time polymerase chain reaction genotyping of six human platelet antigens using displacing probes

BACKGROUND: Several genotyping methods for six clinically relevant human platelet antigens (HPAs) have been reported. A four-color real-time polymerase chain reaction (PCR) method using displacing probes for genotyping of the six HPAs is described. STUDY DESIGN AND METHODS: Primers and four differently fluorophor-labeled displacing probes were designed and synthesized to detect single-nucleotide polymorphisms responsible for each of the HPA-1, -2, -3, -4, -5, and -15 genotypes. Two HPA systems were analyzed in a single PCR procedure. After validation with samples of known genotypes, a total of 150 blood samples from healthy donors were genotyped. The results were compared with PCR with sequence-specific primers (SSP), PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), and/or direct DNA sequencing. The frequencies of each HPA allele were calculated. RESULTS: Unequivocal real-time PCR genotyping results were obtained with minimal manual manipulation and carryover contamination. All 150 blood samples were correctly genotyped as confirmed by PCR-SSP, PCR-RFLP, and/or direct DNA sequencing. The allelic frequencies of HPA-1 through -5 and -15 among the Chinese population in Xiamen were comparable with those previously reported with Chinese living in other territories. For each specimen, genotyping of all six HPA biallelic systems was achieved in three tubes of PCR within 90 minutes and with material cost of no more than $1. CONCLUSION: Genotyping of HPA with real-time PCR using displacing probes is more rapid and reliable compared with PCR-SSP and PCR-RFLP methods and is more affordable than existing real-time PCR-based HPA genotyping assays. Thus, our approach is more suitable for routine HPA analysis and ideal for both urgent clinical testing and high-throughput screening.     

白细胞介素6基因启动子区两个突变位点多态性检测方法的建立

目的建立一种快速检测IL-6基因启动子区-597G／A、-572G／C多态性的双重实时荧光PCR方法。方法采用1对引物，2对荧光标记探针，结合荧光共振能量转移原理和熔点曲线分析技术，检测IL-6基因启动子区-572G／C，-597G／A2个位点多态性。结果用建立的双重实时荧光PCR方法对123名健康查体者进行检测，发现中国汉族人IL-6基因启动子区-572位点有3种基因型，分别为GG，GC，CC型；-597位点仅发现4名为GA型，其余均为GG型，尚未发现从型。结论双重实时荧光PCR法简便快速，与其他方法比较具有准确、经济的特点，适合临床基因快速分型。     

稀有B(A)02亚型标本的血型基因鉴定

目的 对1例ABO定型正反不符[血清学初定为B(A)]的标本进行PCR分型和测序分析,拟阐明其血清学的分子机制.方法 采用试管法进行血清学鉴定;用PCR-SSP方法对标本ABO基因亚型进行初筛,并测序分析标本ABO基因的第6和第7外显子.结果 血清学表现为AxB,且H抗原明显增强,反定与A1细胞和A2细胞皆有反应,初定为B(A)型;PCR-SSP分型定为B(A)02型.测序表明:标本的第6外显子存在261delG突变;第7外显子在B101序列的基础上,出现了B(A)02型700C/G的典型突变.结论 该标本的基因型为B(A)02型与O01型杂合.     

儿童胃黏膜白细胞介素mRNA水平与幽门螺旋杆菌感染的研究

目的分析儿童胃黏膜白细胞介素(IL-1β)水平与幽门螺旋杆菌(H.pylori)及其高毒力亚型感染间的相关性。方法实时定量聚合酶链(real-time PCR)检测H.pylori的保守基因ure以判断H.pylori的感染,高毒力亚型基因vacA s1用real-time PCR检测,用PCR扩增另一高毒力基因cagA羧基端EPIYA基序所在区,然后测序确定其亚型。IL-1βmRNA使用PCR-荧光探针法检测,比较循环CT法分析。结果患儿中无论是低毒力还是高毒力的H.pylori感染都与胃黏膜IL-1βmRNA水平无显著相关性。结论 H.pylori对儿童胃黏膜IL-1β表达的影响作用并不明显,可能还有其他一些环境、遗传因素如IL-1基因簇多态性与H.pylori共同作用调节胃黏膜IL-1β的表达。     

基于16S rRNA的聚合酶链反应技术用于肺部感染患者痰标本中军团菌的检测

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法,检测肺部感染患者痰液中军团菌属特异性16S rRNA基因。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株进行检测,验证该方法的特异性和敏感性。对150例肺部感染患者痰液标本进行检测,阳性者对基因扩增产物测序作验证试验。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属检测结果均为阴性,灵敏度为10 cfu/ml。150例肺部感染患者的痰液标本,经荧光定量PCR法检出军团菌阳性27例,阳性率为18.0%(27/150),经16S rRNA基因测序验证,阳性率为15.0%(22/150),经χ2检验二者差异无统计学意义(χ2=3.2,P﹥0.05),表明其较好的符合性和等效性。结论 realtime PCR法检测患者痰液标本中军团菌,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌感染调查及快速检测。     

一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用

目的：探讨一管式多引物焦磷酸测序技术在人类乳头瘤病毒（HPV ）分型检测中的临床应用价值。方法设计针对7个不同 HPV亚型的高度特异性测序引物,采用一管式多引物测序法,通过半巢式聚合酶链反应（PCR）扩增获得 HPV基因片段,并进行焦磷酸测序分析。结果通过半巢式PCR扩增和一管式多引物焦磷酸测序,成功区分了7种不同的 HPV亚型,且测序结果与PCR-反向点杂交法检测结果的符合率是100％。结论一管式多引物焦磷酸测序技术是一种简便、高效、高通量、高灵敏度、高准确度的HPV分型检测方法,值得推广应用。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.