分离人肝细胞的超低温保存

探索一种肝细胞超低温冻存的方法。将分离的肝细胞洗涤 ( 50 ｇ 3ｍｉｎ)后 ,用自制配方的肝细胞保存液制成悬浮液 ,置于 - 80℃超低温冰箱内冻存 ,2周后取冻存的肝细胞常规方法复苏 ,锥虫兰染色、计数 ,普通方法接种培养观察 ,以同期分离的细胞接种培养为对照。结果显示 ,采用此法冻存的肝细胞解冻后存活率较高 ,经锥虫兰染色 ,其活率为 ( 95± 1) % ,接种培养的细胞贴壁率为 ( 80± 2 ) % ,白蛋白的合成功能与对照组的白蛋白合成功能无显著差异 ,细胞生长良好。人肝细胞可在 - 80℃超低温条件下保存 ,可望成为贮存肝细胞的有效办法之一。…     

生物人工肝用肝细胞低温保存的现状与进展

大量功能好的肝细胞是生物人工肝支持系统(bio-artificial liver support system,BLASS)的核心,是制约BLASS临床广泛应用的瓶颈.探索出一种实用的肝细胞低温保存方法,建立一个随时可用(ready to use)的肝细胞库是BALSS普遍推广的基础.目前肝细胞低温保存分为4℃或零下非结冰保存和-80℃或-196℃深低温冻存两大类,两大类保存方法各有优缺点.影响肝细胞低温保存的因素很多,如保存(冻存)液、(冻存)保护剂等.有关肝细胞在低温保存过程中死亡的机制尚未完全阐明,但大量研究发现细胞凋亡是除了坏死之外低温保存肝细胞死亡的另一个重要的途径.     

成人脂肪肝整肝肝细胞分离及大量冻存的实验研究

目的建立成人脂肪肝整肝肝细胞的分离以及人肝细胞大量冻存技术,为生物人工肝提供稳定的人肝细胞来源。方法采用胶原酶经肝静脉逆行灌注的方法分离成人重度脂肪肝的整肝肝细胞,并比较常规冻存和程序冻存后肝细胞在细胞活性、贴壁率、LDH漏出量及白蛋白合成能力的差异。结果采用添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)的胶原酶灌注液分离肝细胞的产量为(7.4±0.5)×10~6 cells/g肝组织,活性为(81.4±3.4)%,而未添加NAC组的肝细胞产量为(5.6±0.8)×10~6 cells/g肝组织和活性为(67.3±5.0)%,差异均有统计学意义(P0.05)。分离的人肝细胞采用程序冻存后在细胞活性、贴壁率及白蛋白合成能力方面均相应高于常规冻存组(P0.05),LDH漏出量低于常规冻存组(P0.05)。结论应用添加NAC的胶原酶灌注液经肝静脉逆行灌注可提高脂肪肝整肝肝细胞分离的活性及产量,采用程序冻存的方法可以提高冻存人肝细胞的活性,满足生物人工肝对肝细胞的需要。     

超速玻璃化法冻存小鼠肝细胞球形聚集体的初步研究

现有的肝细胞冻存法是将分散的肝细胞用于冻存.从肝组织消化分离的肝细胞,其细胞完整性和功能都会受影响.有报道用肝细胞球形聚集体培养,效果优于用分散肝细胞培养[1].玻璃化法冻存细胞组织,由于不形成冰晶,对细胞损伤较小,已成功用于冻存胚胎、卵巢、胎肝组织和脑细胞[2-5].本研究将小鼠肝细胞预培养成球形聚集肝细胞,用改进的超速玻璃化法冻存,解冻后与含胶原培养液混合、培养,通过检测培养上清液中ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)浓度判断肝细胞受损漏出情况,检测白蛋白( Alb)浓度判断肝细胞合成功能.对照组用单层贴壁培养分散肝细胞做同样冻存和检测.     

促肝细胞生长素联合不同DMSO浓度冻存小鼠肝细胞的质量研究

目的使用自行配制组方含有促肝细胞生长素联合不同浓度DMSO的冻存液冻存小鼠肝细胞,以探索一种效果较好的冻存液从而改善冻存肝细胞质量。方法以体重20~30 g的昆明小鼠为肝细胞供体,用改良的胶原酶灌注法分离肝细胞,将分离好的肝细胞分别以10%、20%、30%浓度的DMSO联合促肝细胞生长素的冻存液(试验组1、2、3组)和标准冻存液(对照组)进行逐级降温缓慢冻存,置液氮中。2个月后快速复苏肝细胞,观察并测定肝细胞活率、功能和形态学。结果冻存小鼠肝细胞2个月复苏检测,试验1组、2组、3组的肝细胞活率台盼蓝(TB)染色结果为80.18±2.44%、86.20±2.33%、78.50±3.43%,而对照组肝细胞活率TB染色49.71±3.51%,试验组和对照组差异具有统计学意义(P0.05),试验2组与其他试验组比较差异具有统计学意义(P0.05);血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的值,试验1组、2组、3组分别为14.03±2.21 U/L、8.05±1.25 U/L、18.40±3.25 U/L;15.14±3.03 U/L、9.12±1.56 U/L、20.51±3.56 U/L;15.11±2.10 U/L、8.26±1.23 U/L、20.31±3.21 U/L,而对照组分别为24.28±1.96 U/L、25.44±2.06 U/L、26.22±3.23 U/L,两组差异具有统计学意义(P0.05),试验2组与其他试验组比较差异具有统计学意义(P0.05);合成血清白蛋白的值,试验1组、2组、3组为3.24±0.18 g/L、4.12±0.23 g/L、3.01±0.45 g/L,对照组为2.56±0.32 g/L,两组差异具有统计学意义(P0.05),试验2组与其他组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论在本研究中,冻存小鼠肝细胞2个月,促肝细胞生长素联合20%DMSO冻存液较常规冻存液能有效减轻小鼠肝细胞的损伤,发挥良好保护作用。     

新生大鼠肝细胞的分离纯化及冻存条件分析

研究针对当前采用非灌注法消化肝细胞的不足加以改进，同时探索肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。     

用于生物人工肝的大量猪肝细胞低温冻存技术

目的：比较大量猪肝细胞程序冻存与常规冻存的效果。方法采用二步法胶原酶经肝静脉逆行灌注的方法分离猪肝细胞,分离的肝细胞根据冻存方法与冻存袋的不同分5组：a 组,50 mL 冻存袋,程序冻存;b 组,100 mL 冻存袋,程序冻存;c 组,50 mL 冻存袋,常规冻存;d 组,100 mL 冻存袋,常规冻存;e 组,新鲜分离的肝细胞。各冻存组解冻后,比较各组的肝细胞活性、贴壁率、LDH 漏出量及白蛋白合成能力。结果新鲜分离的肝细胞产量为（1．8＆#177;0．4）1010/肝,活性高达（90．5＆#177;1．7）％,培养后贴壁率为（70．5＆#177;8．5）％。采用程序冻存的 a、b 组在肝细胞活性、贴壁率、LDH 漏出量及白蛋白合成能力方面明显优于常规冻存的 c、d 组（P＜0．05）,但与 e 组新鲜分离的肝细胞相比,其解冻后肝细胞的活性、贴壁率及蛋白合成能力均降低（P＜0．05）,LDH 漏出量增加（P＜0．05）。相同冻存方法条件下,50 mL 袋装与100 mL 袋装冻存效果差异无统计学意义（P＞0．05）。结论采用袋装程序冻存法大量冻存猪肝细胞可满足生物人工肝对肝细胞活性及数量的要求。     

低浓度二甲基亚砜冻存外周血造血干细胞的效果

目的:观察外周血造血干细胞(PBSC)用低浓度二甲基亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)在-80℃条件下冷冻保存的效果。方法:49例次患者的PBSC在冻存后3、6个月及1年进行复苏,分别取样进行有核细胞(NC)计数、锥虫蓝拒染率测定、CD34 细胞阳性率分析和粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)检测。结果:PB-SC在-80℃冰箱中冻存3个月和6个月的NC、CD34 细胞、CFU-GM回收率的差异均无统计学意义(均P>0.05),NC活细胞比率差异也无统计学意义(P>0.05)。PBSC冻存1年NC、CD34 细胞、CFU-GM集落回收率及活细胞比率均有显著性下降(均P<0.01)。结论:应用低浓度DMSO在-80℃冻存PBSC3个月和6个月的细胞能得到较好保存,1年后的冻存效果显著下降。     

肝细胞冻存复苏成活率及胆红素代谢活性的实验评价

目的评价成年异种动物肝细胞液氮冻存复苏后对人重型肝炎胆红素的代谢活性,探讨生物人工肝支持系统（EBLSS）使用冻存复苏异种肝细胞的实际价值.方法采用H-E染色镜检肝细胞形态、锥虫兰染色计数肝细胞成活率、细胞培养检测胆红素代谢活性,实验观察液氮中冻存3个月复苏后的成年小白鼠肝细胞形态、存活率和对重型肝炎胆红素代谢活性,并设刚分离的肝细胞作对照组.结果冻存复苏后肝细胞胞质严重丢失,成活率约为30%,重型肝炎的总胆红素、直接胆红素、间接胆红素分别下降8.63%、8.98%、8.06%;新鲜分离肝细胞形态完整,成活率为90%以上,使重型肝炎总胆红素、间接胆红素、直接胆红素分别下降14.09%、12.95%、20.82%（t=8.932,P＜0.01）.结论冻存复苏的异种肝细胞胞质丢失严重,细胞成活率很低,对胆红素代谢活性很弱,不是EBLSS理想的生物材料.     

EB病毒转染冻存全血建立新疆和田长寿老人永生细胞株

目的 改进EB病毒转化冻存全血为人B淋巴母细胞的方法,提高转化效率,克服远距离分散采样造成的实验不便,建立新疆和田维吾尔族长寿老人永生细胞株.方法 采集新鲜肝素抗凝血样,冻存时添加小牛血清和DMSO作为冷冻保护液,复苏后以新鲜制备的EB病毒进行转化,对照组为仅添加10％ DMSO的传统冻存全血法.结果 以改进的冻存全血法成功建立了9株新疆和田维吾尔族长寿老人永生细胞,建系成功率为100％ (9/9),以传统冻存全血法建系成功一例(1/14).HLA基因分型结果在建系前后完全一致.结论 与传统冻存全血法相比,改进后的方法能更有效地转化长寿老人永生细胞株,可为长寿的分子遗传机制研究以及某些细胞生物学性状的检测提供充足的实验材料.     

流式细胞术分析冻存前后脐血CD34+细胞的分布

目的探讨低温冻存对脐血CD34+细胞的影响.方法采用流式细胞仪分析冻存前后脐血CD34+细胞百分率、CD45+细胞和CD34+细胞的荧光强度变化及死细胞群的分布情况.结果冻存后CD34+细胞占CD45+细胞的百分率[(0.84±0.39)%]明显高于冷冻前[(0.51±0.24)%](P<0.01),冻存前后CD34+细胞绝对数无明显变化[(9.372±6.072) ×106/L和(9.246±6.132)×106/L](P>0.05),冻存前后CD34+细胞百分率呈正直线相关(r=0.564, P<0.01).冻存后CD45+细胞荧光强度减弱(P<0.01),CD34+细胞荧光强度无明显变化(P>0.05);中性粒细胞比例下降,淋巴细胞和单核细胞比例增高.死细胞组分中以中性粒细胞为主,占81.52%;活细胞组分中以淋巴细胞为主,占59.44%.结论冻存后CD34+细胞占CD45+细胞的百分率增高,但低温冻存对CD34+细胞绝对数量影响不大.死细胞主要为较成熟的粒细胞,冻存后CD34+细胞的分析需排除死细胞的干扰.     

生物人工肝乳猪肝细胞的聚集培养、冻存及形态、功能观察

目的　为构建生物人工肝进行肝细胞的准备。方法　采用胶原酶半原位灌流法分离单个乳猪肝细胞 ,并对其活力、单层、聚集培养及冻存复苏后培养的白蛋白、尿素合成功能进行检测。结果　采用本方法从每头乳猪中分离到的单个肝细胞数为 ( 3 .1± 1.5 )× 10 10 ,活性超过 95 %。在加入激素和生长因子的培养基中单层培养时 ,肝细胞功能良好 ,可维持 2周左右 ,而在未加入激素和生长因子的培养基中肝细胞虽能存活 1周 ,但功能于 2 4h后即丧失。球形聚集培养可实现肝细胞的大量培养 ,且生物学活性较单层培养显著提高。冻存复苏后肝细胞活力仍超过 90 % ,肝细胞功能与新鲜分离培养的肝细胞功能间无明显差异。结论　采用胶原酶半原位灌注法所得单个乳猪肝细胞基本满足构建生物人工肝对肝细胞数量的要求。聚集培养接种密度大 ,细胞生物学活性高 ,可用于构建生物人工肝。冻存复苏后肝细胞仍功能良好。     

冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中生存状态研究

目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统(BALSS)中的生存状态。方法用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离猪肝细胞,将1×1010猪肝细胞冷冻保存在-196℃液氮中,1个月后复温,将等量冷冻和新鲜猪肝细胞分别培养在BALSS中,比较其形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果冷冻保存的猪肝细胞,复温后存活率较高,在培养于BALSS时其生化功能、利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类似。结论用冻存方法保存猪肝细胞可试用于BALSS系统。     

二甲基亚砜和右旋糖酐对脐血造血细胞的低温保护作用

目的：探讨液氮保存中联合低温保护剂二甲基亚砜和右旋糖酐对造血细胞的保护作用和不同冻存时间对造血细胞活力的影响。方法：通过测定冻存前后总有核细胞数（ＴＮＣ）、细胞活率、造血祖细胞集落生成情况,反映冻存后造血细胞损失情况及增殖能力。结果：４０例脐血冻存后细胞活率平均为９１．５％,ＴＮＣ、粒－巨噬细胞集落形成单位、红系爆增式集落形成单位、混合集落生成单位平均回收率分别为９５．０％、８６．７％、８１．８％、８４．４％。不同保存时间细胞活率,ＴＮＣ、祖细胞回收率差异均无显著性意义（Ｐ〉０．０５）。结论：联合保护剂对造血细胞有良好保护作用,适合于建立脐血库长期低温保存造血细胞。长期冻存造血细胞的效果与冻存时间无密切关系。     

内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性

目的研究冻存对内皮生长晕细胞增殖能力和成血管能力的影响,探讨内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性。方法分离脐血中单个核细胞,采用贴壁培养法培养扩增内皮生长晕细胞,免疫组织化学染色和荧光染色法鉴定其内皮细胞特性。扩增后的细胞采用浓度为650μmol/L(体积比为50mL/L)和1040μmol/L(体积比为80mL/L)二甲基亚砜的培养基冻存至液氮中,24h后复苏并观察冻存细胞的复苏率、复苏后细胞的增殖能力和成血管能力的改变。结果采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性。细胞采用含不同浓度二甲基亚砜(50mL/L和80mL/L)的培养基冻存后,其复苏率差异无统计学意义,细胞的增殖能力在复苏后36h内50mL/L、80mL/L二甲基亚砜组均较未冻存组减弱(P<0.05),72h后三组间比较差异无统计学意义。而复苏后6h内成血管速率较未冻存组减弱(P<0.05),但30h后三组间比较差异无统计学意义。结论内皮生长晕细胞可以进行冻存和复苏。     

人芽囊原虫保存方法的初步研究

目的 观察冻存剂、温度等因素对人芽囊原虫活力的影响，探索理想的人芽囊原虫保存方法。 方法 从患者阳性粪便中分离人芽囊原虫，分装到2 ml无菌冻存管内，分别加入10%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、40%丙三醇（GL）和15%乙二醇（EG）作冻存剂，放置于不同的温度下保存，用台盼蓝染色法和原虫培养法测定细胞的活力和增殖能力。 结果 虫体在室温（18 ℃～20 ℃）下可存活3周，在4 ℃～6 ℃存活不到1周。加入冻存剂后，置－20 ℃和液氮（－196 ℃）下可存活3个月以上。用40% GL作冻存剂，于液氮低温下冻存的虫体保存半年后复苏， 活力仍达41.7%，培养72 h后多见分裂相细胞。 结论 应用40% GL作为冻存剂， 在液氮中低温保存人芽囊原虫效果较佳。 4 ℃不适于保存人芽囊原虫。     

人胚胎关节软骨细胞库的建立

目的：体外建立人胚胎关节软骨细胞冻存、复苏的稳定技术，为软骨组织工程提供大量的、具有软骨细胞生物活性的种子细胞。方法：将传代培养的人胚胎关节软骨细胞用含10%DMSO、50%胎牛血清的IMDM培养液悬浮后，置于-196℃的液氮中长期保存，建立人胚胎关节软骨细胞库。然后将细胞库中的冻存细胞进行复苏培养，观察其生长状况，并测定软骨细胞中DNA及糖醛酸的含量。结果：冻存软骨细胞复苏后仍保持旺盛的增殖与分泌细胞外基质的功能。结论：关节软骨细胞库的建立，可以长期保存培养的软骨细胞。     

体外培养、冻存及复苏对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs).第3代MSCs在10%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮中(-196℃)冻存,6个月后复苏,检测其存活率,观察形态及生长情况,细胞计数试剂-8(CCK-8)检测MSC8的增殖能力、流式细胞仪检测细胞表面标记(CD29、CD34、CD44和CD45)的表达及细胞周期特性.结果:原代MSCs 72 h贴壁,呈梭形,呈集落样生长;传代后,细胞变为形态均一排列有序的成纤维细胞样.冻存MSCs复苏后存活率为86.5%.冻存MSCs与未冻存MSCs比较,增殖能力、细胞表面标记及细胞周期无明显变化.认为密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs,采用液氮冻存大鼠MSCs不改变其增殖能力及生物学特性.     

脐血单个核细胞分离方法的比较研究

目的:探讨脐血单个核细胞的提取、冻存及复苏工艺,实现脐血单个核细胞的长久保存。方法:采集足月妊娠者脐血40~180ml,运用Ficoll密度梯度离心法和AXP脐带血自动分离系统与Ficoll密度梯度离心法两步法分离脐血单个核细胞,采用非程控降温法降温,将细胞保存于-196℃液氮中。比较分析不同分离方法分离人脐血单个核细胞的细胞得率及活力;冷冻保护液配制分2组:无血清培养液+10%DMSO+10%右旋糖酐和自体血浆+10%DMSO+10%右旋糖酐,根据冻存时间进行细胞复苏,分析其冻存前后的细胞活力、单个核细胞回收率、CD34+细胞数和CFU形成能力。结果:Ficoll密度梯度离心后获得的脐血单个核细胞活力为99.70%±0.30%,回收率为54.40%±4.52%;两步法分离脐血单个核细胞活力为99.60%±0.40%,回收率为62.12%±3.78%,2组回收率差异有统计学意义(P0.05)。冻存6、12、24个月后,各时间点单个核细胞无血清培养液组复苏回收率和活力分别为80.75%±4.60%和91.75%±5.42%;自体血浆组复苏回收率和活力分别为81.55%±4.50%和92.65%±4.92%,组间差异无统计学意义。复苏后CD34+细胞占1.25%±0.70%,集落形成总数为(32.10±29.60)/105。结论:两步法分离脐血单个核细胞的回收率高于一步法,两种保护液的保护效果无显著差异。     

细胞培养和液氮冻存弓形虫的研究

弓形虫只能在活的组织细胞内生长,因而以往多采用小鼠传代保存,但方法繁琐。目前采用细胞培养和液氮冻存技术,有利于弓形虫的分离、培养、保存、抗原制备及探索药物对弓形虫作用等方面的研究,为了对其方法进一步探讨,我们对五种细胞培养弓形虫及液氮冻存虫株进行了研究。 材料及方法 1 弓形虫株 1983年从昆明屠宰场取猪肺接