成人骨髓基质成骨细胞体外培养及鉴定

目的：观察成人骨髓基质成骨细胞(Bone Marrow Stromal Osteoblasts，BMSO)在体外的培养条件，为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定实验基础。方法：抽取成年男性髂骨骨髓5ml，离心分离出骨髓基质细胞，DMEM条件培养基培养，并诱导其向成骨细胞分化。观察原代及传代细胞的生长特性和生长曲线，测定培养细胞分裂指数和贴壁率。第2代细胞持续培养20天，观察钙化结节形成情况。结果：成人骨髓基质细胞可以诱导生成BMSO。第2代细胞持续培养20天，可以观察到钙化结节。生成的BMSO生长至第7代，性状稳定，生长曲线与第二代相似；第5天分裂指数最高，为87．1％；传代后12小时贴壁率最高。结论：成人骨髓基质成骨细胞在体外培养条件下，早期生长性状稳定，增殖速度快，适应性强，成骨作用确切，可作为骨组织工程学的种子细胞。     

右归饮含药血清对人骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的影响

目的：观察右归饮对体外人骨髓分化成骨细胞的影响。方法：将右归饮含药血清加入人骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞的培养体系,采用细胞形态学观察、MTT法及细胞内ALP含量检测反映其促进成骨的功能。结果：形态学观察及椰法表明,右归饮对成骨细胞的增殖起促进作用,钙结节染色及细胞内ALP含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用（P〈0．05）。结论：右归饮对人骨髓基质干细胞诱导分化的成骨细胞的成骨起促进作用。     

兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃支架的相容性

目的：探讨应用兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃复合培养构建组织工程化人工骨的可行性。方法：将体外分离培养的兔骨髓基质细胞，经向成骨方向诱导分化后，与生物活性玻璃进行联合立体培养，通过扫描电镜观察骨髓基质细胞在生物活性玻璃上的生长情况。结果：骨髓基质细胞可在体外增殖和向成骨方向分化，并且可在生物活性玻璃上黏附和铺展。结论：骨髓基质细胞与生物活性玻璃复合培养可构建具有活细胞成分的组织工程化人工骨。     

复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响

目的研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响。方法采用全骨髓差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞;取P3代细胞,分实验组和对照组,用流式细胞仪测定细胞表面标志物鉴定细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线。显微镜下观察两组的细胞形态和组织化学染色的钙化结节;速率法测定碱性磷酸酶(ALP)活性和RT-PCR检测骨髓间充质干细胞诱导分化过程中骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达来鉴定成骨作用。结果体外培养的细胞表达表面标志;复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞内ALP活性增高并形成明显钙结节;PCR结果显示复叶耳蕨总黄酮上调骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达。结论 20μg/mL复叶耳蕨总黄酮可促进大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为成骨样细胞。     

羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响

目的探讨羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(Marrow Stroma Cells,MSCs)的影响。方法用MTT法检测MSCs的增殖;PNPP偶氮法检测MSCs碱性磷酸酶(ALP)的活性;细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%,1.25%,2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用(P<0.01);在含羊胎素原液的2.5%及5% 成骨诱导剂时,ALP的活性明显高于诱导剂对照组(P<0.05),而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组,ALP的活性明显高于空白对照组及诱导剂对照组(P<0.001);细胞ALP染色呈强阳性,加药组颜色明显深于对照组和诱导剂对照组。结论羊胎素对体外培养的SD大鼠MSCs的增殖和向成骨细胞分化具有明显的促进作用。     

骨康方对大鼠MSCs体外向成骨细胞分化和ALP的影响

目的:观察骨康方对大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)体外增殖并向成骨细胞分化和其对碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。方法:用流式细胞仪鉴定第3代MSCs表面抗原,采用不同浓度的含骨康方药血清联合诱导剂对大鼠MSCs定向诱导分化,观察MSCs诱导前后形态学变化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线,检测ALP活性。结果:CD34表达为阴性,CD44表达为阳性。原代MSCs及诱导后形态正常。细胞生长曲线示各组MSCs数量均随时间延长增加,联合使用高、中浓度骨康方药加诱导剂可显著提高MSCs增殖,并向成骨细胞增殖。联合使用高、中、低不同浓度骨康方药加诱导剂均可显著提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性。结论:骨康方能促进大鼠体外MSCs增殖,并向成骨细胞分化。且能提高成骨细胞的ALP活性,从而增强其成骨能力。     

壮骨颗粒含药血清对兔骨髓基质干细胞体外增殖及分化的影响

研究壮骨颗粒含药血清对骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响。方法:采用体外细胞培养技术,采用壮骨颗粒对细胞进行体外诱导培养,并设置空白血清对照组,进行MTT、免疫组织化学染色及ALP测定,观察壮骨颗粒对骨髓基质细胞的诱导作用。结果:在促细胞增殖方面:实验组作用显著(P<0.01),在第3d开始增殖,第6d达到平台期;而对照组对数增殖期明显延长(P<0.01);在促细胞分化方面:壮骨颗粒血清组在2d、3d、5dALP活性水平高于对照组(P<0.01)。常规形态学观察,壮骨颗粒组诱导的细胞在形态上类似于成骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有骨细胞表型。结论:壮骨颗粒组应用可促进细胞增殖,并诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓成骨活性下降的研究

目的：观察激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化为成骨细胞的改变。方法：取激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓，建立人骨髓间充质细胞诱导分化成骨细胞的培养体系，采用观察细胞学形态、MTT法、细胞内ALP含量检测及矿化结节形成，并与正常组进行比较。结果：与正常组相比，MTT测定细胞增殖、矿化结节染色及细胞内ALP含量测定表明激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化成骨细胞的能力及活性下降（P〈0．01）。结论：激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞的增殖能力和活性下降。     

壮骨颗粒含药血清对兔骨髓基质干细胞体外增殖及分化影响

目的:研究壮骨颗粒含药血清对骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响。方法:采用体外细胞培养技术,用壮骨颗粒对细胞进行体外诱导培养建立实验组,并设置空白血清对照组,进行MTT、免疫组织化学染色及ALP测定,观察壮骨颗粒对骨髓基质细胞的诱导作用。结果:在促细胞增殖方面,实验组作用最显著(P<0.01),在第3天开始增殖,第6天达到平台期,而对照组对数增殖期明显延长(P<0.01);在促细胞分化方面,常规形态学观察,壮骨颗粒组诱导的细胞在形态上类似于成骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有骨细胞表型。结论:壮骨颗粒可促进细胞增殖,并诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

联合应用rhBMP-2与bFGF对兔骨髓基质细胞表达VEGF及其成骨潜能的影响

目的：观察兔骨髓基质细胞经rhBMP-2与bFGF刺激后,其VEGF因子表达及成骨潜能的变化。方法：取兔双侧股骨骨髓基质细胞,采用骨髓基质细胞体外培养技术,单独或联合以rhBMP-2、bFGF刺激细胞。细胞培养5d后,进行细胞形态（HE染色）、增殖情况（细胞记数法与MTT法）、碱性磷酸酶（改良钙钴法染色）、成骨结节（图像分析）、VEGF阳性细胞率（免疫组化染色）等项目的检测。结果：①联合应用rhBMP-2、bFGF在细胞记数、ALP活性、矿化面积百分率、VEGF阳性细胞率4个检测项目上优于单独应用rhBMP-2或bFGF,差别有统计学意义。②分开联合应用rhBMP-2、bFGF优于同时应用rhBMP-2或bFGF。结论：合理的联合使用rhBMP-2和bFGE,不仅可促进骨髓基质细胞的快速增殖及向成骨细胞转化,还可促进促血管内皮细胞增生的重要介质VEGF的表达。此项技术可应用于骨组织工程,促进工程化骨在体内的存活。     

淫羊藿苷对骨髓间充质成骨性活性强于金雀异黄酮

目的:比较研究金雀异黄酮与淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞(rats bone marrow stromal cell,rBMSC)成骨性分化的影响.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质细胞,筛选最佳的药物浓度;采用终浓度为1×10-5mol·L-1的金雀异黄酮和淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞进行干预;在药物干预后的第3,6,9,12,15天后测定碱性磷酸酶活性(alkaline pbosphatase,ALP)和3,6,9,12,15 d测定钙含量;第12天进行钙化结节茜素红染色;在药物干预后第12,24,48,72,96 h Real-time RT-PCR检测OXS,Runx-2,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP-2)和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平.结果:浓度为1 ×10-5 mol·L-1金雀异黄酮和淫羊藿苷可提高ALP活性最高,增加Ca含量,调节骨代谢活性Runx-2,OXS,BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平,淫羊藿苷比金雀异黄酮的成骨性作用更强一些.结论:在促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化作用方面淫羊藿苷较强于金雀异黄酮.     

龟板对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响

目的探讨益肾中药龟板对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外向成骨分化的影响.方法使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSCs的成骨变化.应用形态学、碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa 染色、骨钙素测定等方法观察细胞成骨活性.结果形态学表明,MSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞外观.龟板组碱性磷酸酶、钙化结节、骨钙素明显升高,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05).结论 MSCs受龟板诱导高效地向成骨细胞分化,可以为体内骨组织工程提供种子细胞.     

菟丝子总黄酮对成骨细胞骨代谢的影响

目的:探讨菟丝子总黄酮(TFCC)对体外培养大鼠成骨细胞骨代谢的影响。方法:取新生SD大鼠的颅盖骨,采用改良的组织块法培养成骨细胞。应用MTT法、对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP),放射免疫法及ELISA法分别测定TFCC0.01,0.1,1,10,100μg.L-1对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(BGP)含量及Ⅰ型胶原(COL-I)分泌的影响。结果:TFCC在48 h和72 h能显著促进成骨细胞增殖并提高ALP活性;48 h时TFCC可促进细胞上清液中BGP和COL-I的分泌。结论:TFCC能够明显促进大鼠成骨细胞的增殖与分化,并通过提高COL-I的分泌影响骨代谢。     

红曲对大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的影响

目的:研究中药红曲对骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的影响。方法:取SD大鼠60只,随机分为空白对照组,红曲低、中、高剂量组,普拉固组和倍美力组,分别予以蒸馏水、红曲水提液、普拉固水溶液、倍美力水溶液胃灌,10天后,制备含药血清;将从4-5周SD大鼠取材制备的骨髓基质细胞培养于含药血清培养液中,应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色等方法观察红曲对骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、碱性磷酸酶表达及矿化结节形成的影响。结果:含红曲血清明显增加了骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、碱性磷酸酶的表达水平及矿化结节的形成(P<0.05或P<0.01)。结论:体外成功培养了骨髓基质细胞和成骨细胞;证实了含红曲血清可以呈剂量依赖性地促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、矿化。     

补肾益精中药调控体外培养成骨细胞IGF-Ⅰ分泌与表达的研究

目的 观察补肾益精中药对体外培养成骨细胞类胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)分泌和表达的影响,探讨补肾益精中药调节骨重建的作用机理.方法 采用连续酶消化法培养大鼠颅盖骨成骨细胞,观察补肾益精药物血清对成骨细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节数目以及成骨细胞不同分化时期IGF-Ⅰ分泌和mRNA表达的影响.结果 与对照组比较,补肾益精中药能明显增加成骨细胞增殖率,提高成骨细胞ALP分泌量,增加矿化结节数;中药组IGF-Ⅰ的分泌在第7d、第21d时与对照组比较无差异,但在第14d时IGF-Ⅰ的分泌量明显高于对照组,同时其成骨细胞IGF-Ⅰ mRNA表达下调.结论 补肾益精中药可能通过调控细胞因子IGF-Ⅰ的表达与分泌发挥促进骨形成的作用.     

补肾益精中药调控体外培养成骨细胞IGF-I分泌与表达的研究

目的观察补肾益精中药对体外培养成骨细胞类胰岛素样生长因子I(IGF-I)分泌和表达的影响,探讨补肾益精中药调节骨重建的作用机理。方法采用连续酶消化法培养大鼠颅盖骨成骨细胞,观察补肾益精药物血清对成骨细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节数目以及成骨细胞不同分化时期IGF-I分泌和mRNA表达的影响。结果与对照组比较,补肾益精中药能明显增加成骨细胞增殖率,提高成骨细胞ALP分泌量,增加矿化结节数;中药组IGF-I的分泌在第7d、第21d时与对照组比较无差异,但在第14d时IGF-I的分泌量明显高于对照组,同时其成骨细胞IGF-I mRNA表达下调。结论补肾益精中药可能通过调控细胞因子IGF-I的表达与分泌发挥促进骨形成的作用。     

龙牡壮骨颗粒对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化的影响

目的:研究龙牡壮骨颗粒对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响。方法:以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为药物筛选的体外模型;采用终浓度分别为1,5,10,25,50μg/ml的龙牡壮骨颗粒溶液干预,MTT法检测细胞增殖率;同时检测药物作用不同时间后的碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色和Von Kossa钙化染色检测不同浓度药物对细胞钙化的影响。结果:龙牡壮骨颗粒溶液在5⁵0μg/ml范围内培养24和48 h可显著促进小鼠成骨细胞增殖;龙牡壮骨颗粒溶液在550μg/ml范围内培养24和48 h可显著促进小鼠成骨细胞增殖;龙牡壮骨颗粒溶液在5⁵0μg/ml范围内培养48和72 h显著提高MC3T3-E1细胞ALP活性。龙牡壮骨颗粒浓度为10μg/ml和50μg/ml时,茜素红染色钙化结节显著增多,药物浓度在1050μg/ml范围内培养48和72 h显著提高MC3T3-E1细胞ALP活性。龙牡壮骨颗粒浓度为10μg/ml和50μg/ml时,茜素红染色钙化结节显著增多,药物浓度在10⁵0μg/ml范围内,Von Kossa染色钙化结节显著增多。结论:龙牡壮骨颗粒可提高MC3T3-E1增殖、分化及矿化的能力。     

陶瓷化骨对成人骨髓基质干细胞分化的影响

目的:观察陶瓷化骨时成人骨髓基质干细胞生长和分化的影响.方法:体外分离培养成人骨髓基质干细胞,将第二代细胞以陶瓷化骨为载体进行培养,利用倒置显微镜、碱性磷酸酶细胞化学染色、碱性磷酸酶活性检测等条件,了解陶瓷化骨对成人骨髓基质干细胞生物学行为的影响.结果:体外连续培养6d,倒置显微镜下可见成人骨髓基质干细胞与陶瓷化骨相容性好,材料周边细胞生长密集,并有向陶瓷化骨趋化迁移现象,3周后形成矿化结节.碱性磷酸酶染色呈阳性、碱性磷酸酶活性检测有明显的细胞分泌量.结论:体外培养条件下,陶瓷化骨可诱导成人骨髓基质干细胞向成骨和骨质细胞分化.     

红芪多糖对骨髓间充质干细胞和成骨细胞的影响

目的研究3种新型红芪多糖(HPS-1、HPS-2、HPS-3)对大鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs和颅骨成骨细胞ROBs成骨性分化的影响。方法采用MTT法检测rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖;采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测rBMSCs细胞和ROBs细胞的ALP活性;采用茜素红染法检测rBMSCs和ROBs细胞矿化结节的形成情况。结果HPS-1(20、50μg/mL)作用48 h显著促进rBMSCs细胞增殖(P<0.05、0.01),HPS-1(20μg/mL)作用48 h显著促进ROBs细胞增殖(P<0.01);HPS-2和HPS-3对2种细胞的增殖无促进作用。HPS-1(50、100μg/mL)显著升高rBMSCs细胞的ALP活性(P<0.01),HPS-1(10、20、50μg/mL)显著升高ROBs细胞的ALP活性(P<0.05、0.01);HPS-3(50μg/mL)显著升高rBMSCs细胞的ALP活性(P<0.05),HPS-2对2种细胞ALP活性没有促进作用。HPS-1显著增加rBMSCs和ROBs细胞中钙化结节面积和数量(P<0.01),HPS-2和HPS-3对rBMSCs和ROBs细胞钙化结节的形成没有促进作用。结论HPS-1可增强rBMSCs和ROBs细胞ALP活性和成骨相关因子表达,并显著促进rBMSCs和ROBs细胞分化、矿化。     

淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究

目的观察淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用特点。方法 (1)采用机械分离及全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,氨基安替吡啉测酚法检测不同浓度的淫羊藿苷在第3、6、9、12、15、18、21天对细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响,采用茜素红染色法检测各浓度组BMSCs矿化情况,观察不同浓度的淫羊藿苷促BMSCs骨向分化的作用。(2)将BMSCs细胞分为空白对照组、成骨诱导组及淫羊藿苷组(0.5μg/m L),在培养第7、14、21天检测各组细胞上清ALP活性,并于第14及21天分别检测各组细胞ALP阳性染色率与矿化结节数,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测3个不同时间点各组细胞中核心结合蛋白因子(Runt-related transcripition factor-2,Runx2)及骨钙素(Osteocalcin)mRNA的表达水平。结果 (1)0.05~5.0μg/m L淫羊藿苷均可明显提高细胞上清液中ALP活性,其中0.2~2.0μg/m L浓度组细胞结节数亦明显增加(P0.01)。(2)淫羊藿苷促BMSCs骨向分化时,Runx2 mRNA表达水平及ALP活性均先升后降;Osteocalcin mRNA表达水平则持续上升(P0.01);与成骨诱导组比较,作用14天后,淫羊藿苷组ALP活性及ALP阳性染色率均明显提高(P0.05,P0.01)。结论淫羊藿苷通过上调Runx2基因的表达,促使BMSCs向成骨细胞分化,并通过增加细胞ALP分泌及Osteocalcin基因的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟。