RIPK1和RIPK3介导的坏死性凋亡在脑梗死中的研究进展

<正>随着研究的不断深入,人们发现了坏死性凋亡这种特殊的细胞死亡方式,受体相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)和RIPK3是介导坏死性凋亡最为关键的细胞内信号因子,当死亡受体与配体结合时,形成RIPK1/RIPK3/混合谱系激酶域样蛋白(mixedlineage kinase domainlike protein,MLKL)复合物介导细胞发生坏死性凋亡,导致炎症反应的产生。多项研究表明坏死性凋亡参与脑卒中、     

RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用

目的探索受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)的下游信号通路。方法向实验组SH-SY5Y细胞内转染pCMV6-RIPK3质粒上调细胞内RIPK3的表达水平,对照组细胞转染相应的空载质粒。通过Western blot检测细胞内RIPK3的表达水平。3-(4,5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl),MTT]实验获得2组细胞增殖曲线确定外源性RIPK3在细胞内具有的生物学活性。通过RNAseq检测2组细胞基因转录差异,并在生物通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA)数据库中进行数据分析,获得RIPK3的下游信号通路及其中的关键分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。采用微滴式数字化PCR(droplet digital PCR,ddPCR)对mTOR转录水平的差异进行验证。结果质粒DNA整合到细胞基因组内,Western blot提示外源性RIPK3在实验组细胞内稳定表达,MTT结果证明其在细胞内能够抑制细胞增殖。RNAseq及IPA分析结果提示过表达RIPK3能够导致mTOR转录水平发生上调,并对其下游的基因,包括固醇反应结合蛋白(sterol-response binding proteins,SREBPs)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70ribosomal S6protein kinases,S6K)、真核生物起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins,4E-BPs)和ULK(unc-51-like kinase)激酶复合体的转录具有明显的调节作用。ddPCR实验结果中mTOR表达改变趋势与RNAseq基本一致。结论 RIPK3能够调控mTOR及其下游信号通路中SREBPs、S6K、4E-BPs和ULK基因转录水平,进而在神经系统生长发育和疾病进展中发挥重要作用。     

RIPK1调控LPS诱导的星形胶质细胞神经炎症的作用机制

目的 探究坏死性凋亡抑制剂（necrostatin-1, Nec-1）抑制受体相互作用激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的星形胶质细胞神经炎症模型的作用。方法 采用星形胶质细胞（MA细胞）,随机分为4组：Control组、LPS组、Nec-1组及Nec-1+LPS组。使用RIPK1抑制剂Nec-1(50μM预处理30 min,共处理24 h)作为给药手段,使用LPS(0.1μg/mL处理24 h)刺激小鼠星形胶质细胞系（MA细胞）构建神经炎症细胞模型。使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT]检测细胞活力,以确定LPS的安全浓度;利用免疫印迹（western blotting）法检测RIPK1的表达,以确定LPS和Nec-1的最终工作浓度;使用实时荧光定量PCR(realtime quan...     

程序性坏死信号通路与炎症发生关系的研究进展

细胞程序性坏死(necroptosis)是一种新型的细胞死亡方式。不同于传统的凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)两种模式,程序性坏死是受体相互作用蛋白激酶(receptorinteractionproteinkinase,RIP)介导的caspase非依赖的细胞坏死。目前研究较为完整的是由凋亡诱导剂TNF-α和FasL诱导坏死并通过死亡受体(deathreceptors,DRs)发生的信号通路。最新的实验中证实程序性坏死在多种炎症性疾病中发挥着重要作用。这种细胞死亡模式的发现使得对坏死过程进行操控成为可能,为生命科学的研究和疾病的治疗提供新的突破口。本文现就程序性坏死的信号通路和造成的相关炎症反应进行总结综述。     

程序性坏死在肺部疾病中作用的研究进展

程序性坏死是由死亡受体介导的不依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的细胞死亡方式,与细胞凋亡不同,其具有坏死细胞的形态学特征。程序性坏死受自噬、细胞器和蛋白质转换调节,在心肌梗死、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、炎性肠病和老年痴呆等多种临床疾病的病理生理中起重要作用。在肺部疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺癌、肺部炎症和哮喘等)的发病过程中程序性坏死也起重要作用,其参与调控肺部疾病的发生发展。但程序性坏死与其他程序性细胞死亡的关系尚未阐明,未来需进一步研究。     

受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)调控人结肠癌HT-29细胞程序性坏死的分子机制

 目的  研究受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)在人结肠HT-29细胞程序性坏死过程中的作用,并探讨E3泛素连接酶三重结构域包含蛋白16 (tripartite domain containing protein 16,Trim16)对其作用的潜在调控机制。方法  用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)建立HT-29细胞的程序性坏死模型,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对凋亡、坏死细胞数目的影响。分别用Western blot和qRT-PCR检测RIPK1在细胞程序性坏死中的表达。构建稳定表达Flag标记的RIPK1的HT-29细胞株,采用Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现与RIPK1有相互作用的新蛋白。应用Ni-NTA pulldown试验检测筛选出的E3泛素连接酶对RIPK1泛素化的调控。结果  TNFα能够成功诱导HT-29细胞程序性坏死。HT-29细胞在TNFα和半胱天蛋白酶抑制剂z-VAD处理后,表现出RIPK1、RIPK3、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)表达水平显著增加,并伴随着炎性因子白介素1α(IL1α)和白介素6(IL6)水平明显升高。Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现一个与RIPK1有相互作用的E3泛素连接酶Trim16,体外实验表明Trim16可以增强RIPK1的泛素化程度,其可能调节RIPK1在程序性坏死过程中的作用。结论  RIPK1在TNFα和z-VAD诱导人结肠癌HT-29细胞的程序性坏死过程中起重要作用,E3泛素连接酶Trim16对此过程可能有重要调控作用。     

程序性坏死在非酒精性脂肪性肝病发病中的研究进展

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)已逐渐取代乙型病毒性肝炎(viral hepatitis B, HBV)成为进展性肝病的主要病因。但NAFLD的发病机制涉及多种理论研究,目前尚无定论。程序性坏死(necroptosis)是细胞生理活动中关键的一环,在NAFLD的进展中具有举重若轻的作用。因此本文就程序性坏死的发生、调控及与NAFLD的作用进行概述,为NAFLD的治疗方案提供新的思路。     

程序性坏死：缺血再灌注损伤中的新靶点

程序性坏死是新发现的一种细胞死亡方式,在凋亡通路抑制条件下,死亡受体与配体结合可调控非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的程序性细胞死亡,具备典型的坏死样形态学特征,可触发显著的炎症反应。含死亡域的受体相互作用蛋白激酶1/3在程序性坏死的调节中发挥特异性激酶作用,且可被坏死性抑制剂特异性抑制。程序性坏死在缺血再灌注损伤中的重要作用备受关注,研究已发现其在心、肾、脑组织及视网膜等缺血再灌注损伤中可作为细胞死亡的主要形式。     

RIP1在肝癌组织中的表达意义及其对细胞侵袭、迁移的影响

探讨受体相互作用蛋白激酶-1(RIP1)在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并探索其对肝癌细胞侵袭和迁移的分子调控机制。收集肝癌和癌旁组织,免疫组化检测RIP1蛋白的表达,筛选高表达RIP1的肝癌细胞系。对肝癌细胞系进行RIP1沉默处理并设置阴性对照。采用western blot及RT-PCR法检测RIP1的表达量;Tranwell观察细胞侵袭能力;细胞划痕观察细胞迁移能力。结果显示, 48例肝癌组织中,22例存在RIP1蛋白阳性表达,阳性率为45.83%,其中,强阳性患者为15例,中等及弱阳性7例,该研究中有6例复发患者。RIP1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05),高表达RIP1患者的总生存率和无复发生存率显著低于低表达RIP1的患者(均P＜0.05)。抑制RIP1基因后其相对表达量、细胞侵袭、迁移能力均下降(P＜0.05)。RIP1在肝癌中存在高表达,可能参与肝癌细胞侵袭与迁移过程。     

受体酪氨酸蛋白激酶的研究

酪氨酸蛋白激酶是细胞信号转导的主要信号酶之一，对细胞的生长、发育与功能调控起着重要的作用。受体型酪氨酸蛋白激酶是细胞内段具有酪氨酸激酶活性跨膜结构的酶蛋白受体，其胞外区与生长因子配体结合，然后激活胞内段的酶活性区启动信号转导，参与细胞的生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成。主要介绍受体型酪氨酸蛋白激酶的结构、分类及其信号转导途径。     

半枝莲总黄酮调控RIP1/RIP3通路减轻急性脑梗死缺血再灌注大鼠大脑皮层神经元的损伤

目的:分析半枝莲总黄酮通过调控受体相互作用蛋白激酶-1(receptor interaction protein kinase-1,RIP1)/受体相互作用蛋白激酶-3(receptor interaction protein kinase-3,RIP3)通路减轻急性脑梗死缺血再灌注大鼠大脑皮层神经元损伤的机制。方法:从48只SPF级SD大鼠中随机挑出40只建立大鼠中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,剩余8只记为阴性对照组。将MCAO建模成功的大鼠随机分为模型组,阳性对照组,半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组。阳性对照组以30 mg·kg~(-1)尼莫地平溶于2 mL生理盐水中灌胃;半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组分别使用200 mg·kg~(-1)、100 mg·kg~(-1)、50 mg·kg~(-1)半枝莲总黄酮溶于2 mL生理盐水中灌胃;模型组和阴性对照组使用2 mL生理盐水灌胃,每天1次,连续给药10 d。给药前后分别使用Longa评分标准对大鼠神经功能进行评分;治疗前后分别通过酶联免疫吸附实验检测血清白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6水平。断头法处死大鼠后,取模型大鼠大脑皮层梗死部位组织和阴性对照组大鼠大脑皮层相同部位组织,通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法观察大脑皮层神经细胞凋亡情况;采用HE染色观察大脑皮层组织病理变化;使用RT-qPCR检测大脑皮层组织中RIP1、RIP3和MLKL mRNA相对表达量;通过蛋白免疫印记法检测大脑皮层组织RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达量及p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL水平。结果:神经功能评分比较显示:模型组,阳性对照组和半枝莲总黄酮不同剂量组均低于治疗前(P0.05)。给药后,模型组高于阴性对照组(P0.05),阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组低于模型组(P0.05),半枝莲总黄酮高剂量组和中剂量组低于阳性对照组和半枝莲总黄酮低剂量组(P0.05),半枝莲总黄酮高剂量组低于半枝莲总黄酮中剂量组(P0.05)。大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平显示:模型组给药后以上指标高于给药前(P0.05),阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组给药后均低于给药前(P0.05);给药后,模型组高于阴性对照组(P 0. 05),阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组低于模型组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量和中剂量组低于阳性对照组和半枝莲总黄酮低剂量组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量组低于半枝莲总黄酮中剂量组(P 0. 05)。脑神经细胞凋亡TUNEL染色结果显示:阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组均低于模型组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组均低于阳性对照组和半枝莲总黄酮低剂量组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量组低于半枝莲总黄酮中剂量组(P 0. 05)。HE染色结果显示:模型组大脑皮层组织出现严重水肿,空泡样变,阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组均减轻,其中半枝莲总黄酮高剂量组病变程度最轻; RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达量各组间比较,差异无统计学意义(P 0. 05)。RIP1、RIP3和MLKL m RNA相对表达量和p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL水平结果显示:阳性对照组和半枝莲总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组均低于模型组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量组和中剂量组低于阳性对照组和半枝莲总黄酮低剂量组(P 0. 05),半枝莲总黄酮高剂量组低于半枝莲总黄酮中剂量组(P 0. 05)。结论:半枝莲总黄酮能降低急性脑梗死缺血再灌注大鼠大脑皮层神经功能损伤,减轻炎性反应,减轻神经元损伤,推测其作用机制与下调RIP1、RIP3和MLKL m RNA表达,降低p-RIP1、pRIP3、p-MLKL水平,抑制RIP1/RIP3通路对细胞程序性凋亡的调控有关。     

受体相互作用蛋白3在大鼠皮质神经元坏死性凋亡信号通路中的作用

目的 探讨坏死性凋亡信号通路中受体相瓦作用蛋白3(RIP3)的胞内定位以及其在该信号通路中的作用,并进一步研究RIP3核移位是否与受体相互作用蛋白1(RIPI)存在相关性.方法 SD大鼠原代皮质神经元细胞培养12d,zVAD预处理30min.(1)肿瘤坏死因子(TNFα)处理小同时间点,western blot检测胞质、胞核中RIP3蛋白水平,结合免疫荧光观察RIP3的胞内定位.(2)应用Nec-1及慢病毒干扰RIP1,检测胞浆和胞核中RIP3的蛋白水平变化以及相应的RIP1表达水平的变化,并检测各组培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量变化.结果 (1)在坏死性凋亡信号通路中,随着TNF作用时间的延长,RIP3蛋白含量逐渐增加,胞质中蛋白含量在8h达高峰,随后下降,同时胞核中蛋白水平在12h出现核转位的高峰(胞浆分另0为0.45 ±0.03,0.41±0.02,0.73 ±0.03,0.90±0.01,1.15±0.04,1.30±0.02,0.99±0.03,0.63±0.03;胞核分别为0.07±0.02,0.26±0.02,0.57±0.02,0.68 ±0.02,0.80 ±0.01,0.92±0.02,1.28±0.03,0.87±0.02),差异有显著性(P<0.01).(2)应用Nec-1以及慢病毒干扰RIP1表达后,发生核转位的RIP3减少,且LDH水平较前降低(1.00±0.05,0.39±0.03,0.50±0.03),差异有显著性(P<0.01).结论 正常细胞中RIP3存在于胞质,坏死性凋亡时发生核移位,RIP1是RIP3发生核转位必不可少的相关蛋白,且阻断RIP3核移位可以对抗细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the location of receptor interacting protein 3( RIP3) in Necroptosis and its function in this signal passage, and explore the relationship between receptor interacting protein 1 ( RIP1 ) and RIP3 in nuclear translocation. Methods Primary cerebrocortical neurons were cultured for 12 days,then pre-treated with zVAD-fmk(20μ,mol/L) for half an hour to block apoptosis. ①Extracting nuclear and cytoplasmic protein after neurons were exposed to TNF for different time ,then protein levels of RIP3 were analyzed by western blot and immunofluorescence for qualitative observation;②In the following research,the neurons were treated with Nec-1 and shRlPl ,then the protein level of RIP1 and RIP3 with western blot were analyzed, cell viability were determined by measuring LDH levels. Results ①In signaling pathways of necroptosis, the protein level of RIP3 in cytoplasmic decreased gradually with prolonged TNF exposure, to the corresponding it rolled up in nucleus and a-chieved the peak in 12 hours of TNF treatment ( Cytoplasmic 0. 45 ± 0. 03 ,0. 41 ± 0. 02,0. 73 ± 0. 03 ,0. 90 ± 0.01,1.15 ±0.04,1.30 ±0.02,0.99 ±0.03,0.63 ±0. 03;Nucleus 0. 07 ±0.02,0. 26 ±0.02,0. 57 ±0. 02,0. 68 ± 0.02,0. 80 ± 0.01,0.92 ± 0.02,1.28 ± 0.03,0. 87 ± 0.02) (P < 0.01). ②Blocking the relationship between RIP1 and RIP3 with necrostatin-1 and shRIPl , nuclear translocation of RIP3 decreased and caused a great increase in cell viability( 1.00 ±0.05,0.39 ±0.03,0.50 ±0. 03) (P<0. 01). Conclusion RIP3 mainly locates in cy-tolymph of normal cells,it translocates into nucelus as necroptosis takes place. RIP1 function with RIP3 in nuclear translocation. Block nuclear translocation of RIP3 is a potential way to protect cells.     

程序性坏死在骨关节炎病理机制和治疗中的作用

骨关节炎是一种由多种病因引起的进行性关节疾病,其发病机制尚未明确,目前临床上尚未有根治性的治疗方法。程序性坏死是一种新的细胞程序性死亡方式,是一种高度促炎症的细胞死亡模式。近年研究结果显示,程序性坏死相关因子与骨关节炎的进展密不可分,如损伤相关分子模式促进各类炎症因子的释放,从而募集巨噬细胞,促进骨关节局部炎症;抑制受体相互作用蛋白激酶可减少关节细胞死亡及炎症因子表达,从而减少软骨破坏。本文综述了骨关节炎中程序性坏死的调控机制,以期进一步揭示骨关节炎的发病机制,为骨关节炎的治疗提供潜在作用靶点。     

MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用

目的 于在体水平和离体水平研究MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用。方法 应用MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠和C57 BL/6野生型小鼠,行主动脉缩窄术,于术后4周取材。应用免疫荧光染色,检测心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位。应用Western blot法检测心肌组织中P-NF-κBp65和TNF-α。应用Mnk1 shRNA腺病毒转染技术,降低H9c2细胞中Mnk1的表达,给予血管紧张素Ⅱ刺激48h。应用免疫荧光染色,检测H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位。应用RT-PCR检测H9c2细胞中TNF-α mRNA的表达。结果 在体实验表明,主动脉缩窄术后4周,与野生型小鼠相比,MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位明显增多,TNF-α和P-NF-κBp65的蛋白表达明显增加。离体实验表明,MAPK相互作用蛋白激酶1表达降低的H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位明显增多,TNF-α mRNA的表达明显增加。结论 MAPK相互作用蛋白激酶1基因缺失促进压力负荷诱导的小鼠心肌组织炎症,其表达降低可促进血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞炎症。     

酪氨酸蛋白激酶受体B在人卵泡中的表达及意义

目的 探讨酪氨酸蛋白激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)在人卵泡中的表达及意义。方法 用免疫细胞化学方法检测TrkB在超促排卵妇女壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞、未受精或未成熟卵母细胞中的表达，并用Western免疫印迹方法检测TrkB在壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞中的表达水平。结果 壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞、卵母细胞均有TrkB表达。壁层颗粒细胞表达量高于卵丘颗粒细胞。结论 脑源性神经营养因子在人卵巢可能通过与TrkB结合，参与颗粒细胞功能的完成和卵母细胞发育的调控。     

酪氨酸蛋白激酶EphB2受体及其配体研究进展

肿瘤的发生、发展与细胞信号转导的紊乱有关。酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)途径在促进细胞增殖分化中的作用尤为重要。Eph(Ervthropoietin producing hepatoma cell line，Eph)家族是最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族，由14个基因组成，一些成员主要在脑的发育中表达，一些则在各种组织中广泛表达，参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成，具有重要的生理功能。EphB2是1994年Kiyokawa E等从构建的胃癌组织cDNA库中筛选出来的Eph亚类新基因。目前对EphB2受体及其配体功能的研究方兴未艾。     

血小板衍化生长因子β受体在人冠状动脉组织中的表达

观察血小板衍化生长因子β受体在人冠状劝脉组织中的分布与表达，研究ＰＤＧＦ及其受体在动脉粥样硬化形成过程中的作用机制。方法年龄分别为２１岁，４７岁和６４岁的男性尸检标本，取其ＣＯＡ前降支或左主干，以抗人ＰＤＧＦβ受体多克隆抗体，应用免疫组化方法，观察其组织结构和ＰＤＧＦβ受体的表达。     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

【目的】构建人神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）受体（即酪氨酸蛋白激酶受体C，tyrosine protein kinase C，TrkC）基因重组的腺病毒表达载体。【方法】从人脑组织mRNA中扩增Trkc基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA（Adeno-X viral DNA）体外连接，形成重组腺病毒质粒（pAd-TrkC）。用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒（Adeno-Trkc）。【结果】TrkC基因RT-PCR扩增产物为2478bp。Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子。【结论】应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体，这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础。     

蛋白激酶在阿片受体脱敏中的作用

阿片类镇痛药耐受性在受体水平的变化包括受体下调、内吞和G蛋白脱偶联.在阿片受体的信号转导过程中,蛋白激酶(PKA,PKC,CaMKⅡ,GRK和MAPK)对阿片类镇痛药的耐受性、依赖性及阿片受体与谷氨酸受体之间的相互作用等方面起作用.本文综述了蛋白激酶在阿片受体脱敏中的作用.