人血管生长因子基因片段的体外重组

目的：以互为模板的ＰＣＲ合成技术及克隆技术体外重组人血管生长因子基因片段并获得ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ－ｈＡｎｇｆ重组体。方法：设计目的基因ｈＡｎｇｆ的上、下游引物。二引物以１８ｂｐ区段互补,二引物的５－端分别具有加入的或利用简并密码设计的酶切位点,以ＰＣＲ合成目的基因前体,经ＥｃｏＲＩ作用,获目的基因。以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ为克隆载体,目的基因插入该载体ＥｃｏＲＩ及ＥｃｏＲＶ之间。克隆后经Ｋｐｍ     

人α1—干扰素基因真核表达载体的构建及其活性

选用与ＨｕＩＦＮ－α１基因及其信号肽相应的引物，采用ＰＣＲ技术，从中国人血白细胞染色体中分离带有信号肽ＩＦＮ－α１基因片段，分别克隆到质粒Ｍ１３ｍｐ１９和Ｍ１３ｍｐ１８中通过序列分析进行鉴定。然后克隆家蚕多角体病毒（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）载体ＰＢＦ５的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ之间，用合成的相应寡核苷酸片段为引物进行双链测序，鉴定为阳性重组转移     

HCVNS5B区序列克隆和重组质粒的构建

选ＨＣＶ２ｂ基因型的ＮＳ５Ｂ区序更合成引的，以ＲＴ－ＰＣＲ从慢性丙肝病人血清中扩增一段４０１ｂｐ的ｃＤＮＡ片断作目的基因，插入ｐＴＤ－Ｔ７的多克隆位点，构建了重组质粒ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ。应用ＥＣＯＲＩ ＢａｍＨＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，酶切片断的分子量与预期相符。用载体序列特异的通用引物进行测序分析证实ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ中克隆基因是ＨＣＶ２ｂ的ＮＳ６Ｂ６序列，且为正方向插入。     

含人脑钠素多拷贝基因原核系列表达载体的构建

根据人脑钠素（ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＮａｔｒｉｕｒｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ，ｈＢＮＰ）的ｃＤＮＡ序列，化学合成四条ＤＮＡ片段，经ＰＣＲ延伸扩增，获得全长ＢＮＰ之ｃＤＮＡ，依ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ位点插入ＰＢＶ２２１表达质粒，构建成ＰＢＶ２２１／ＢＮＰ重组体，依据ｃＤＮＡ片段中ＢｇＩⅡ和ＢａｍＨＩ切点的共同粘性末端，依次构建成ＰＢＶ２２１／２ＢＮＰ，ＰＢＶ２２１／３ＢＮＰ．．．．．．．．．ＰＢＶ２２１／８     

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ酶切，获得人碱性成纤维细胞生长因子基因，将该基因插入原核高效表达载体ＰＢＶ２２０的ＰＬＰＲ启动子下游，获得重组质粒ＰＢＶ－ＦＧＦ，转化大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃诱导使重组子表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、ＭＴＴ活性检测结果表明，该重组菌能够表达具有生物活性的ｈｂＦＧＦ。     

基因工程丙酰螺旋霉素

以碳霉素４＂异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）为探针，从麦迪霉素产生菌基因文库中，经菌落杂交获得阳性菌落ｐＣＮ１０Ｆ５。经分子杂交证明ｐＣＮ１０Ｆ５ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段与ＣａｒＥ基因同源。将ｐＣＮ１０Ｆ５ ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段分别克隆到ｐＩＪ６８０、ｐＷＨＭ３，ｐＷＨＭ６０１质粒载体上，获得重组质粒ｐ６Ｆ５，ｐＷＦ５和ＰＧＦ５。含上述重组质粒的螺旋霉素产生菌克隆菌株均产生与     

胰高血糖素基因的合成、克隆与融合表达

选用Ｅ．ｃｏｌｉ偏爱的密码子，用计算机辅助设计合成了四段寡核苷酸序列，通过二步ＰＣＲ法构建胰高血糖皮素基因，总长１２４ｂｐ，并直接克隆在ｐＵＣ１８质粒中，序列分析证实合成与克隆的胰高血糖素基因序列与设计完全相符，将该基因引入质粒ｐＫＡ，使胰高糖素在ＡｎｓＢ的Ｃ端，实现融合表达，用ＥＬＩＳＡ和ＳＰＲ分别检测表达产物。     

逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶基因转移载体的构建

目的：构建逆转录病毒介导的诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转移载体。方法：应用ＤＮＡ重组和ＰＣＲ扩增技术。结果：通过二步克隆，从质粒ｐＫＳｉＮＯＳ分离编码巨噬细胞ｉＮＯＳ的生长ｃＤＮＡ，亚克隆于中间载体ｐＳＰ７２，调整插入片段二端酶切位点；进而构建含ｉＮＯＳ基因、巨细胞病毒启动子和ｎｅｏ抗生基因的逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸｉＮＯＳ。限制性酶切分析和ＰＣＲ鉴定证实，重组体ｉＮＯＳ插入片段的大小和方向     

GM—CSF工程菌构建及鉴定

采用ＰＣＲ技术，从细胞中克隆粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）并在５′端设计上凝血酶切位点５个组氨酸密码子，起始密码子及ＥＣＯＲＩ酶切点位，在３′端设计上ＢａｍＨＩ酶切位点，将扩增产物酶切后克隆到ＰＢＶ２２０质粒的ＥＣＯＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切位点，转化大肠杆菌ＤＨ５α筛选阳性重组子（Ｐ＾ＧＭ０９／ＤＨ５α）经细菌形态，菌落形态功生化鉴别均符合要求，在Ｅ．Ｃｏｌｉ中获得高效表达，表达量占体总     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的：构建含人ＴＩＭＰ－２基因可调控逆转现毒重组体。方法：通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）的基因片段从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体ｐＬ－ＭＴ上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果：结果：限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论：含人组织金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ－２基因可逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供     

卡那霉素链霉菌噬菌体SKJ1DNA限制性内切酶图谱的构建

卡那霉素链霉菌温和性噬菌体ＳＫＪ１ＤＮＡ上有２个ＡｖａＩ和ＳｍａＩ酶切位点，８个ＳａｌＩ位点，７个ＥｃｏＲＩ位点及１２个ＢａｍＨＩ位点，经酶切后用１％琼脂糖凝胶电泳测定ＳＫＪ１ＤＮＡ大小为６０．７ｋｂ。用单酶切，双酶切及片段酶切分析，得到ＳＫＪ１ＤＮＡ的ＡｖａＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切图谱及ＢａｍＩ１的部分酶切图谱，证明ＡｖａＩ和ＳｍａＩ在ＳＫＪ１ＤＮＡ上具有相同酶切位点，并经过酶切结     

人G—CSF基因组基因的克隆和序列测定

用ＰＣＲ方法，以提取的正常中国人染色体ＤＮＡ为模板，成功地扩增出１．５ｋｂ的人Ｇ－ＣＳＦ基因组基因。将其克隆至ｐＵＣ１９，构建成重组质粒ｐＧＧ－２，在酶切证实正确的基础上，将其酶切成三个片段进行了亚克隆。利用ｐＵＣ１９的的正反通用引物进行序列分析。自动测序结果表明其编码区的序列是正确的。并对该基因的应用前景做了讨论。     

降钙素基因工程研究

降钙素临床上被用于治疗老年骨质硫松等，本文成功地全合成了人的降钙素基因，基因全长１０９个碱基对，分四个片段，在５′端有一个ＥｃｏＲＩ位点和一个精氨酸密码，３′端有一个ＢａｍＨＩ位点，一个甘氨酸密码和一个终止密码．合成基因克隆到ｐＷＲ５９０并转化ＪＭ１０９．用ＤＮＡ分子杂交筛选到单克隆，并对合成基因进行序列分析．同时对克隆菌的发酵、表达和质粒稳定性进行研究，结果较好．     

Construction of an inducible nitric-oxide synthase gene transferring vector mediated by retrovirus

目的：构建逆转录病毒介导的诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转移载体．方法：应用ＤＮＡ重组和ＰＣＲ扩增技术．结果：通过二步克隆，从质粒ｐＫＳｉＮＯＳ分离编码巨噬细胞ｉＮＯＳ的全长ｃＤＮＡ，亚克隆于中间载体ｐＳＰ７２，调整插入片段二端酶切位点；进而构建含ｉＮＯＳ基因、巨细胞病毒启动子和ｎｅｏ抗性基因的逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸｉＮＯＳ．限制性酶切分析和ＰＣＲ鉴定证实，重组体ｉＮＯＳ插入片段的大小和方向正确．结论：获得含ｉＮＯＳ基因逆转录病毒表达载体，为建立ｉＮＯＳ基因修饰的神经细胞模型，研究ＮＯ／ＮＯＳ在阿片耐受依赖中的作用奠定基础．     

环磷酰胺诱发叙利亚地鼠胚胎细胞恶性转化的分子生物学特征

采用杂交，测序，ＲＴ－ＰＣＲ等方法对环磷酰胺（ＣＰ）转化的不同叙利亚地鼠胚胎（ＳＨＥ）细胞株癌基因和抑癌基因进行了分析，结果表明，ｃ－ｍｙｃ癌基因以扩增的方式被激活，在Ｈａ－ｒａｓ和Ｋｉ－ｒａｓ癌基因上均存在着突变．在对Ｈａ－ｒａｓ２０７ｂｐ的一段ｃＤＮＡ序列分析中发现，总共发生了３５处碱基对的替换，除两处是在密码子的第一位碱基外，其余均发生于第三位碱基上，但除第６７位密码子的第三位碱基由于Ｇ－Ｔ颠换导致所编码的甲硫氨酸被异亮氨酸取代外，其余碱基的替换均未导致氨基酸的改变．分析还表明，ＣＰ致Ｈａ－ｒａｓ癌基因的突变无位点专一性．结果还表明，ｐ５３抑癌基因也发生了突变，并且可能属于点突变性质．因此，ＣＰ引起的ＳＨＥ细胞恶性转化的分子机理可能是以点突变和基因扩增的方式引起ｃ－ｍｙｃ，Ｋｉ－ｒａｓ，Ｈａ－ｒａｓ癌基因的激活及ｐ５３抑癌基因的失活或表达改变     

红细胞补体受体I型密度基因的克隆

为研究中国人红细胞补体受体Ｉ型密度基因多态性变化，构建红细胞补体受体Ｉ型密度基因重组体。采用ｐＧＥＭ Ｔ载体系统直接克隆红细胞ＣＲ１密度基因ＰＣＲ扩增产物。经过对重组体电泳、ＰＣＲ扩增及ＨｉｎｄⅢ酶切分析，结果与理论预计值大小一致。本文构建的红细胞补体受体Ｉ型密度基因重组体可以作为研究红细胞补体受体Ｉ型基因多态性的标准对照     

铜绿假单胞菌中β—内酰胺酶基因的克隆及其应用

从北京医院临床分离的铜绿假单胞菌，经药敏试验确证对头孢唑林及氨苄西林耐药的菌株６９１中，提取总ＤＮＡ，分别用ＢａｍＨⅠ和Ｓａｕ３ＡⅠ部分酶切后，与ＢａｍＨⅠ酶工的载体ｐＡＣＹＣ１８４（ＣＰ＾Ｒ，ＴＣ＾Ｒ，４．２ｋｂ）连接，转化大肠杆菌ＨＢ１０１，在含氯霉素（ＣＰ）５０μｇ／ｍｌ和ＡＢＰＣ１００μｇ／ｍｌ的选择性ＬＢ琼脂平板上筛选，获得了稳定性耐ＡＢＰＣ的菌落，从中提取质粒ＤＮＡ，并经酶切分析，证明     

低特异性L—苏氨酸醛缩酶工程菌的构建

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１ｋｂ的低特异性Ｌ－苏氨酸醛缩酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ １１ｃ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ痊点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产低特异性Ｌ－苏氨酸醛缩酶基因工程菌。     

人α2b型干扰素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达提高

应用ＰＣＲ的方法，从人的染色体片段制备人α２ｂ干扰素的ｃＤＮＡ，将其克隆到ｐＲＣ２３表达载体上，构建成重组表达质粒ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ，并转化大肠杆菌ＤＨ５α组建成工程菌。ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ的区别在于后者的α２ｂ基因５＇－卢始密码ＡＴＧ上游编制了一段ＳＤ顺序，与ｐＬ启动子上连接的ＳＤ顺序组成双ＳＤ顺序。表达重组质粒中由于不含ｃＩｔＳ基因，所以采取３７℃连续培养后比较两者的抗病毒活性，