抗凝血酶Ⅲ浓缩物制备及临床应用的研究 一、抗凝血酶Ⅲ的分离与纯化

本文报道用肝素-Sepharose 4B凝胶批式亲和吸附法,成功地从血浆中分离、纯化出抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。该法适于批量制备,整个分离过程仅需3天。从20升血浆中获得的AT-Ⅲ活性回收率为22.4％—42.3％,进一步纯化后的AT-Ⅲ活性及抗原回收率分别为26.3％和20.3％,其比活性为9.9U/mg蛋白,在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上显示单一的区带;其纯度、生物活性及回收率接近国外有关报道。     

重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,对吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱做脱盐处理;然后用单克隆抗体亲和层析柱做亲和层析;通过SDS-PAGE、Western Blot等试验测定纯化产物的纯度;通过凝血酶原时间(PT)测定纯化产物的促凝活性。结果制备出rhFⅦ单克隆抗体亲和层析介质;细胞表达产物经DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-25脱盐和亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定获得了分子量为50kD的单一蛋白洗脱峰;纯化所获得的重组蛋白具有促凝活性,促凝时间(DT)为52s。结论建立了纯化rhⅦ的亲和层析方法 ,为rhFⅦ的研制奠定了基础。     

人血小板第4因子和P—选择素的纯化

目的用单克隆抗体亲和层析方法从人血小板破碎液中纯化血小板因子4和P-选择素.方法将单克隆抗体SZ-95-IgG和SZ-51-IgG分别与溴化氰活化的Sepharose4B凝胶连接成SZ-95-IgG-Sepharose4B和SZ-51-IgG-Sepharose4B亲层析柱,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,再经FPLC系统获得的所要的产品,产品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度,用点杂交鉴定其生物学活性.结果SZ-95-Sepharose4B和SZ-51-Sepharose4B亲和层析柱的偶联率分别72%和68%,每1ml(约1×109个血小板)血小板破碎液中可以纯化到18μgPF4和12μgP-selectin,所得产品经SDS-PAGE,在分子量约为12kD和140KD处各显单一的蛋白区带,经点杂交印迹显示产品分别与单抗SZ-95和SZ-51反应显带.结论用单克隆抗体亲和层析柱纯化的PF4和P-selectin产品得率高、纯度高、活性好.     

人成釉蛋白C端肽的大量表达及纯化

目的:获得高纯度的重组人成釉蛋白C端肽。方法:实验于2001-01/2004-06在解放军第四军医大学口腔内科实验室解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学实验室完成。①转化pRSET-A/成釉蛋白原核表达质粒入BL21(DE3)细菌进行大量培养,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,32℃继续振荡诱导培养5h,收集细菌,诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱Ni-NTA结合蛋白,收集洗脱蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。②离子交换层析缓冲液(pH 7.4,50 mmol/L Tris·Cl)平衡Q SapharoseHP层析柱,将初步纯化的蛋白样品加在Q Sapharose HP凝胶介质上,梯度洗脱结合的蛋白,收集洗脱峰,制样,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白。结果:①表达重组人成釉蛋白C端肽的金属螯合亲和层析结果:诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱下Ni-NTA结合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳证实获得初步纯化的重组人成釉蛋白C端肽,其中仍含一些杂蛋白。②重组人成釉蛋白C端肽的离子交换层析结果:获得多个蛋白洗脱峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组人成釉蛋白C端肽。结论:获得了纯化的人成釉蛋白重组蛋白。     

人红细胞门冬氨酸氨基转移酶的提纯及有关性质研究

目的：为研制AST测定用的酶参考品。方法：从人红细胞中提取了胞质型AST（C－AST），并对其有关性质进行了研究。结果：提纯的AST比活达105kU/g蛋白，几乎不含杂酶[未检出LD、GGT、CK、ALP、ALT、 MDH（苹果酸脱氢酶）、GLDH（谷氨酸脱氢酶）、ChE及Amy]。聚丙烯酰胺凝胶电泳后酶染色呈单一C－AST区带，蛋白质染色显示相应的主区带有一条更向阳极的次区带。其酶动力学性质（如Michaelis常数，Arrhenius关系，最适pH）与血清AST非常接近。结论：本提制品可用于研制AST参考品。     

抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1的扩增和鉴定

目的制备纯化的抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1。方法给Balb/c小鼠腹腔注射BDI-1杂交瘤细胞。收集的腹水过Pmtein G-sgsros亲和层析柱即得到人膀胱癌BDI-1单克隆抗体。采用ELISA法、间接免疫荧光法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和点印迹法鉴定单克隆抗体。结果每毫升腹水可以得到1-1．5mg的高效价（106）的纯化抗体。结论该方法可以扩增高效价的单克隆抗体．     

核糖核酸酶及其临床意义

核糖核酸酶(EC 2.7.7.16,Ribonuc-lease,RNase)的系统名为聚核苷酸-α-寡核苷酸转移酶。该酶具有环化作用,能使核糖核酸(RNA)解聚,也能使某些人工合成的寡核苷酸如聚胞苷酸(Poly C)分解,是具高度特异性的核酸内切酶。RNase只水解核苷酸序列中的嘧啶核苷酸C_3’磷酸基与下一个核苷酸C_5’相连的键。其作用特点是,     

核糖核酸酶及其在胰腺癌诊断中的应用

核糖核酸酶(RNase)的全名为聚核苷-α-寡核苷酸转移酶。RNase 于1920年发现,1940年制成牛胰RNase 结晶纯品,现已知它是一条由124个氨基酸组成的肽链,N-端为赖氨酸,C-端为缬氨酸,第12位的组氨酸及第13位的蛋氨酸与其催化活性有关。1958年Migliarese 首先提出血清RNase 浓度与恶性肿     

重组泡球蚴主要表面抗原在棘球蚴病免疫诊断中的效果

目的 研究非融合表达重组抗原用于棘球蚴病免疫诊断的效果。方法 将泡球蚴主要表面抗原基因编码序列克隆于原核非融合表达载体pQE30（＋）并进行表达。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及免疫印迹（WB）试验对重组抗原鉴定。亲和层析纯化重组抗原，用于酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清特异性抗体。结果 SDS—PAGE及WB分析显示泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌内得到了高效非融合表达。以此重组抗原进行ELISA试验，检测棘球蚴病68例，阳性率达97．1％，检测囊虫等其他感染性疾病80例及健康人血清20份，阴性符合率达98％。结论 泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌中获得了高效非融合表达，以该重组抗原建立的ELISA试验，对棘球蚴病诊断具有较高的敏感性和属特异性。     

人心肌线粒体肌酸激酶的提纯及抗体制备

目的　从人心肌中分离纯化肌小节型线粒体肌酸激酶 (sMtCK) ,制备抗血清 ,从抗血清中制备对sMtCK有特异免疫反应的抗体 ,建立酶联免疫吸附试验 (ELISA) ,测定血清sMtCK。方法　采用超低温高速离心、硫酸铵分级提取、SepharoseCL6B层析等技术分离纯化sMtCK ,免疫新西兰大白兔。应用自制抗sMtCK建立ELISA检测健康体检者、心肌炎及急性心肌梗死 (AMI)患者血清sMtCK。结果　经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和Westernblot鉴定 ,纯化的sMtCK为单一蛋白质条带。制备的抗sMtCK多克隆抗体在琼脂糖免疫扩散实验和ELISA中的抗体效价分别为 1∶32和 1∶80 0。自制抗体建立的ELISA检测心肌炎和AMI患者的血清sMtCK阳性率分别为 5 1.6 % (16 / 31)和 5 4 .1% (2 0 / 37) ,与健康对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论　经离心、提取、纯化所得的sMtCK是免疫纯。建立的ELISA检测血清sMtCK有助于心肌炎和AMI的诊断。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C（TnC）,制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C(TnC),制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

引起牛奶不耐受的蛋白成分分析

目的分析引起牛奶不耐受的蛋白成分。方法脱脂奶经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE）分离蛋白,干法转至PVDF膜并作为分析对象,以牛奶不耐受患者血清特异性IgG（specific IgG,slgG）作为识别抗体,以酶标记兔抗人IgG作为标记抗体,经免疫印记技术分析与sIgG结合的蛋白成分。结果脱脂奶经SDS—PAGE分析,主要成分酪蛋白（casein,CN）、13乳球蛋白、仅乳白蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）条带清晰。阳性血清的免疫印记图谱显示3条明显区带,对应的蛋白组分为：免疫球蛋白、BSA和CN。结论免疫球蛋白、BSA和CN是引起牛奶不耐受的主要成分,且个体之间未见明显差别。     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

血清RNase在癌肿诊断中的意义

血清RNase(核糖核酸酶)应用于癌肿诊治已有不少报导,例如它在胰腺癌、卵巢癌的诊断方面被为很有价值。在粒细胞白血病、肝癌、肺癌等患者均可见血清RNase 升高.过去由于方法学等原因,尚未普遍应用于临床实验     

电泳分离肝癌患者血清γ-谷氨酰转肽酶

Kokot和Kuska在1965年首先证实,肝胆疾病患者血清γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)在电泳时出现多条区带.其后,有用纸、淀粉胶、琼脂糖凝胶、纤维凝胶(Cellogel)和聚丙烯酰胺电泳进行血清γ-GTP同工酶的分离,但对肝癌特异的一致的同工酶谱型则至今尚未报导.然而,有人已证实γ-GTP在胚胎肝和肝细胞瘤的活性较正常肝脏高,而且该酶在胚胎肝细胞内的亚细胞分布也不同于成人肝细胞.这些都提示了γ-GTP可能有癌胚特性,根据同工酶谱型可以更容易了解该酶的诊断意义.作者提供的方法可以检出肝细胞癌患者血清中特异的γ-GTP部份.     

人红细胞乳酸脱氢酶的提纯及性质研究

为了研制乳酸脱氢酶的标准品，从人红细胞提取了乳酸脱氢酶（ＬＤ）并对其特性进行了研究。该提制品ＬＤ比活性达１６３．０ＫＵ／ｇ蛋白，几乎不含其它杂酶（测不到ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＫ、ＧＧＴ、ＣｈＥ、ＡＬＰ、Ａｍｙ活性浓度）。聚丙烯酰胺凝胶电泳（自然凝胶系统）酶染色显示ＬＤ１、ＬＤ２区带，蛋白质染色显示与酶相应的区带。其催化特性和人混合血清ＬＤ非常相似，３７℃条件下，正向反应中，对底物Ｌ－乳酸和ＮＡＤ的米氏     

人红细胞乳酸脱氢酶的提纯及其性质研究

目的 研制乳酸脱氢酶的标准品，从人红细胞中提取了乳酸脱氢酶（LD）并对其特性进行了研究。方法 用经过改进的方法，包括完全溶解红细胞，羟磷灰石处理，硫酸铵沉淀，CM-Sephadex、C50、SephadexG100和5’-AMP-Sepharose亲和层析。结果 该提制品LD比活性达163.0KU/g蛋白，几乎不含其它杂酶（测不到ALT、AST、CK、GGT、ChE、ALP、Amy活性），聚丙烯酰胺凝胶电泳（自然凝胶系统——酶染色显示LD1、LD2区带，蛋白质染色显示与酶相应的区带。37℃条件下，正向反应中，对底物L-乳酸和NAD的米氏常数（Km)分别为1 。040和0.192mmol/LO；逆向反应中，对底物丙酮酸和NADH的Km分别为0.119和0.039mmol/L。结论 提纯的LD其催化性质和人混合血清KLD非常相似。本研究为今后进一步研制LD测定用参考品建立了基础。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.