甘草次酸对黑素瘤细胞侵袭力及明胶酶表达的影响

目的探讨甘草次酸(GA)对黑素瘤细胞侵袭能力和明胶酶表达的影响。方法体外培养黑素瘤细胞系SK-MEL-1,用MTT法检测不同浓度GA对细胞增殖的影响;采用Transwell小室基质胶侵袭实验观察GA对SK-MEL-1细胞株侵袭能力的影响;应用半定量RT-PCR检测GA对明胶酶A和B mRNA表达的影响;明胶酶谱法检测GA对SK-MEL-1细胞明胶酶活性的影响。结果SK-MEL-1细胞增殖抑制率与GA浓度及用药后培养时间呈正相关。GA对SK-MEL-1细胞侵袭能力的抑制与浓度相关,各浓度处理组与对照组差异均有显著性意义(P<0.01);GA能抑制SK-MEL-1细胞明胶酶A和B mRNA表达,与浓度呈正相关,各处理组与对照组差异有显著性意义(P<0.05);GA能够抑制SK-MEL-1细胞明胶酶活性,随浓度增高抑制作用增强,与对照组相比,120,240μmol/L浓度组差异具有显著性意义(P<0.05)。结论GA能够抑制黑素瘤细胞的增殖与侵袭能力,可能与抑制明胶酶的表达有关。     

二甲双胍对转化生长因子β1诱导黑素瘤1205Lu细胞上皮-间质转化及侵袭的影响

目的 探讨二甲双胍在转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导下,对黑素瘤1205Lu细胞上皮-间质转化(EMT)过程及侵袭的影响.方法 体外培养1205Lu细胞,分3组处理:空白对照组、TGF-β1(5 ng/ml)组、TGF-β1(5 ng/ml)+二甲双胍(1 mmol/L)组.处理48 h后,显微镜下观察各组细胞形态变化并采集照片.Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量RT-PCR技术分别测定细胞内N-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶9(MMP-9)在蛋白质和mRNA水平上的表达,通过单因素方差分析及LSD-t法对结果进行统计学分析.结果 与空白对照组相比,TGF-β 1诱导1205Lu细胞向成纤维细胞样形态转变(同上皮-间质转化样改变),联合二甲双胍可逆转上述形态改变.3组穿膜细胞数为空白对照组194.1±8.295、TGF-β1组412.2±13.427、TGF-β1+二甲双胍组175.3±8.693.N钙黏蛋白水平3组分别为0.603±0.029、1.963±0.016、0.207±0.009,mRNA水平3组分别为1.000±0.000、6.678±0.043、1.035±0.015.MMP-9蛋白水平3组分别为0.575±0.009、1.243±0.027、0.629±0.008,mRNA水平3组分别为1.000±0.000、5.351±0.604、0.930±0.130.结果经方差分析显示,3组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 二甲双胍可显著抑制TGF-p1诱导的黑素瘤1205Lu细胞EMT样形态改变、细胞侵袭及N钙黏蛋白、MMP-9在蛋白和mRNA水平上的表达.     

BRAFV600E突变基因对人黑素瘤细胞侵袭能力影响的研究

目的 探讨BRAFV600E突变基因对黑素瘤细胞侵袭能力的影响。方法　用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375，在体外干扰BRAFV600E突变基因，用Transwell小室检测肿瘤细胞侵袭能力，用明胶酶法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化，采用RT-PCR和Western印迹检测MMP-2和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果　特异性短发卡RNA抑制人黑素瘤细胞MMP-2和VEGF mRNA和蛋白的表达，MMP-2 mRNA和蛋白表达分别减少35%和80%，VEGF则减少45%和14%。转染特异性质粒的黑素瘤细胞穿过Metrigel的数目下降69%。结论 BRAFV600E突变增强黑素瘤细胞的侵袭能力，特异性shRNA可以使瘤细胞的侵袭性下降。     

黑素瘤细胞及表皮黑素细胞中酪氨酸激酶c-abl,c-kit和PDGFRα/β的表达

目的观察酪氨酸激酶在多株黑素瘤细胞系及原代表皮黑素细胞中的表达,探讨酪氨酸激酶在黑素瘤发生发展过程中的作用。方法分离并培养人原代表皮黑素细胞,培养浅表垂直生长期黑素瘤细胞株WM793B,转移性黑素瘤细胞株A2058,WM-266-4,Hs294T,SK-MEL-5和SK-MEL-1,用RT-PCR法分别检测7株细胞中酪氨酸激酶c-abl,c-kit和PDGFRα/βmRNA的表达;Western-blot法检测7组细胞中非受体性酪氨酸激酶c-abl蛋白水平的表达。结果与表皮黑素细胞和WM793B细胞相比,5株转移性黑素瘤细胞中的c-ablmRNA及其蛋白水平的表达偏高;而PDGFRα/βmRNA表达明显偏低、c-kitmR-NA在表皮黑素细胞,A2058,WM-266-4和Hs294T中mRNA表达较高,而在WM793B,SK-MEL-5和SK-MEL-1中偏弱。结论酪氨酸激酶c-abl对黑素瘤的发生发展可能有促进作用,而PDGFRα/βmRNA的低表达可能与黑素瘤的转移有关。     

黑素瘤中VEGF—D，MMP-7和MMP-9的表达

目的：确定黑素瘤组织中血管内皮生长因子D（VEGF—D）、基质金属蛋白酶-7（MMP-7）和MMP-9表达水平及其与肿瘤侵袭和转移的关系。方法：应用免疫组化法检测16例黑素瘤和12例黑素痣组织中VEGF—D,MMP-7和MMP-9蛋白的原位表达,并与临床肿瘤的侵袭和转移进行相关分析。结果：黑素瘤组织中VEGF—D,MMP-7和MMP-9阳性表达率（75％,62．5％和56．3％）明显高于黑素痣组织（25％,16．7％,41．7％）,在有淋巴转移的黑素瘤组织中,VEGF—D,MMP-7和MMP-9的表达（91．7％,66．67％和66．67％）明显高于无淋巴转移的黑素瘤组织（25％,50％和25％）,均P〈0．05。结论：VEGF—D,MMP-7和MMP-9与黑素瘤的侵袭和转移有关,它们的表达水平可作为预测肿瘤转移的指标,可为临床治疗提供靶点。     

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。     

干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

皮肤恶性黑素瘤中基质金属蛋白酶-9及其组织抑制物-1的表达及意义

目的:探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其组织抑制物-1(TIMP-1)在皮肤恶性黑素瘤中的表达及其临床、病理学意义。方法:采用免疫组织化学S-P方法观察MMP-9和TIMP-1在51例皮肤黑素瘤及15例色素痣石蜡切片中的表达,使用图像分析技术对免疫组化结果进行定量分析。结果:与色素痣比较,皮肤恶性黑素瘤中MMP-9表达较强(P<0.05),MMP-9/TIMP-1比值较高(P<0.05)。MMP-9和TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1比值与黑素瘤浸润深度有关(P<0.05)。有淋巴结转移者MMP-9表达较强(P<0.05),MMP-9/TIMP-1比值较高(P<0.05)。结论:MMP-9、TIMP-1蛋白的表达与皮肤恶性黑素瘤的侵袭性有关,MMP-9/TIMP-1比值增高提示肿瘤具有较高侵袭转移能力。     

核蛋白14对黑素瘤新生血管形成的影响及机制研究

目的 分析核蛋白14 （NOP14）对黑素瘤血管形成的影响。方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织，免疫组化检测NOP14和CD31［以微血管密度（MVD）表示］的表达。将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组，分别转染空载体（空载体组）、NOP14过表达载体（NOP14组）、靶向NOP14的siRNA（siNOP14组）和阴性对照siRNA（siNC组）。荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达，Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达。利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型，利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力。采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系，多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异，其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验。结果 NOP14高表达组（20例）黑素瘤组织MVD为44 ± 13，中表达组（17例）为58 ± 16，低表达组（3例）为62 ± 11，且NOP14表达和MVD呈负相关（r = -0.525，P = 0.017）。与空载体组相比，NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低（P < 0.05）。与siNC组相比，siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高（P < 0.05）。在A375与HUVEC共培养模型中，与空载体共组相比，NOP14组HUVEC的增殖活性（F = 131.85，P < 0.05）和迁移细胞数［22 ± 5比63 ± 8，t = 7.07，P = 0.002）、侵袭细胞数（14 ± 5比45 ± 10，t = 4.94，P = 0.008）及分支节点数（8 ± 2比14 ± 3，t = 5.06，P < 0.001）均显著下降；与siNC组相比，siNOP14组HUVEC的增殖活性（F = 79.92，P < 0.01）和迁移细胞数（152 ± 30比59 ± 4，t = 5.36，P = 0.006）、侵袭细胞数（134 ± 21比50 ± 8，t = 6.40，P < 0.001）及分支节点数（27 ± 3比15 ± 4，t = 6.10，P < 0.001）显著升高。在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中，各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致。结论 黑素瘤组织中 NOP14表达和MVD呈负相关，NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用。     

丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞CXCR7及VEGF表达的影响

目的观察丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞CXCR7及VEGF表达的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法体外培养黑素瘤A375细胞,经4组不同浓度丹参酮ⅡA(0,1,2,4mg/L)作用后,ELISA法检测培养液中VEGF浓度,Real time-PCR法及Western blotting法分别检测其对CXCR7和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。结果丹参酮ⅡA处理黑素瘤A375细胞48h后,培养液中VEGF浓度随丹参酮ⅡA浓度的升高而降低,CXCR7及VEGF mRNA及蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论丹参酮ⅡA能抑制黑素瘤肿瘤细胞内VEGF及CXCR7的转录和蛋白的表达,提示丹参酮ⅡA可能具有潜在的抗肿瘤作用。     

MV3恶性黑素瘤皮肤体外模型中基质金属蛋白酶-2、9的表达

目的 探讨体外构建的MV3恶性黑素瘤皮肤模型中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达及意义。方法 用MV3恶性黑素瘤细胞接种至去表皮的真皮（DED）上,采用液下和空气－液面培养相结合的方式进行组织培养,2周后取培养的黑素瘤组织切片分别做HE染色及MMP-2、9免疫组化染色。同时用RT-PCR对培养组织进行MMP-2、9表达检测。结果 HE染色显示MV3黑素瘤细胞在DED表面呈条带状生长,在凹陷处聚集生长,在DED残留的皮肤附属器管腔中形成大小不等的团、灶;免疫组化染色显示在MV3黑素瘤细胞生长的DED表层及DED附属器管壁基底膜处MMP-2、9均呈阳性表达;RT-PCR检测进一步证实体外构建的恶性黑素瘤组织表达MMP-2和MMP-9,而未接种MV3黑素瘤细胞的DED组织无MMP-2、9表达。结论 体外构建的恶性黑素瘤皮肤模型中瘤细胞侵入到真皮,表达MMP-2、9,为进一步研究黑素瘤的侵袭与转移提供实验依据。     

Wild-type p53 gene transfer inhibits invasion and reduces matrix metalloproteinase-2 levels in p53-mutated human melanoma cells

The tumor suppressor gene p53 has inhibitory effects on cell growth and angiogenesis and induces apoptosis when overexpressed in melanoma and in a variety of tumor cells by adenovirus-mediated gene transfer. The invasive ability of tumor cells, facilitating local infiltration and metastasis, is related to matrix metalloproteinase levels. In melanoma, matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 have a prominent role in this process. The aim of this study was to evaluate whether wild-type p53 overexpression, obtained by a recombinant adenovirus vector (AdCMV.p53), affects cell invasiveness through modulation of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9. Two human melanoma cell lines were used in this study: the SK-MEL-110, carrying a mutated p53 gene, and the SK-MEL-147, carrying the wild-type p53 gene. SK-MEL-110 cells infected with AdCMV.p53 exhibited decreased invasion capability from day 1 after infection, compared with cells not infected or infected with the control vector AdCMV.Null. This reduced invasiveness was associated with decreased matrix metalloproteinase-2 levels in conditioned media whereas no changes were detected in matrix metalloproteinase-9 secreted levels. No modulation in matrix metalloproteinase-2 mRNA levels was detectable, however, after wild-type p53 gene transfer. Furthermore, protein expression of secreted tissue inhibitor of metalloproteinase-2 was not altered by AdCMV.p53 treatment. In contrast, in SK-MEL-147 cells, AdCMV.p53 did not affect cell invasiveness and levels of secreted matrix metalloproteinase-2. Gene transfer of wild-type p53 inhibited proliferation of both cell lines, showing that also SK-MEL-147 cells respond to wild-type p53 overexpression. This novel mechanism of action of wild-type p53 gene transfer may contribute to its antitumor effect by downregulating cell invasion and matrix metalloproteinase-2 secreted levels in mutated p53 human melanoma cell lines.     

MiRNA-373在皮肤鳞状细胞癌的表达及对侵袭的影响

目的 分析microRNA-373 (miR-373)在皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)组织和细胞中的表达,探讨对皮肤鳞癌细胞侵袭的影响.方法 实时PCR检测皮肤鳞癌组织和细胞中miR-373的表达,将miR-373模拟物、miR-373抑制剂以及阴性对照miRNA转染皮肤鳞癌A431细胞,采用细胞侵袭实验分析miR-373表达下调对细胞侵袭的影响,采用Western印迹分析miR-373表达下调对MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响.结果 皮肤鳞癌组织(2.465±0.218)和SCL-1细胞及A431细胞(1.864±0.178,2.919±0.277)中miR-373的表达水平显著高于瘤旁组织和细胞(1.000±0.000),差异有统计学意义(P＜0.05).在转移性的皮肤鳞癌患者(3.323±0.344)中,miR-373的表达显著高于非转移组(1.914±0.161),差异有统计学意义(t=4.158,P＜0.01).与未处理组和阴性对照组相比,miR-373模拟物显著增加皮肤鳞癌A431细胞中miR-373的表达水平和细胞的侵袭能力,而miR-373的抑制剂显著下调皮肤鳞癌A431细胞中miR-373的表达水平和细胞的侵袭,差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 MiR-373表达下调显著抑制皮肤鳞癌A431细胞的侵袭,并能显著下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达.     

Fibroblasts enhance the invasive capacity of melanoma cells in vitro

In previous experiments we have shown an enhanced expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) in fibroblasts obtained from the border of invasive melanoma in comparison to fibroblasts more distant from the tumour. In the study reported here we sought to determine whether melanoma-derived soluble factors are responsible for the stimulation of MMP-1 expression in fibroblasts. By real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assays, we demonstrated that the stimulation of fibroblasts with melanoma cell conditioned medium led to an increased expression of MMP-1 mRNA as well as MMP-1 protein, whereas melanoma cells themselves did not produce detectable amounts of MMP-1 protein. Basic fibroblast growth factor (bFGF) was detected as an important factor responsible for the enhanced expression of MMP-1 by fibroblasts after stimulation with melanoma cell conditioned medium. In a three-dimensional in vitro invasion assay, we demonstrated that fibroblasts are essential for melanoma cell invasion into a collagen I matrix. These findings support the hypothesis that stromal fibroblasts assist the invasion of melanoma cells through the extracellular matrix by producing elevated amounts of proteolytic enzymes after interaction with soluble factors (e.g. bFGF).     

基质金属蛋白酶-9及其组织抑制物-1在皮肤鳞状细胞癌中的表达

目的探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其组织抑制物-1(TIMP-1)在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的表达及其与肿瘤浸润转移的关系。方法免疫组化SP法检测MMP-9和TIMP-1蛋白在65例皮肤SCC(Bowen病17例,SCC48例)和5例正常表皮石蜡切片的表达,采用图像分析技术对免疫组化结果进行定量分析。结果MMP-9和TIMP-1蛋白均弥漫表达于皮肤SCC,分布于SCC癌巢及癌巢周围间质细胞,而在正常人皮肤仅见MMP-9和TIMP-1的弱阳性表达。SCC组MMP-9蛋白的表达水平及MMP-9/TIMP1比值高于Bowen病组(t值分别为2.33、2.36,P<0.05),SCC中淋巴结转移组MMP-9/TIMP1的比值高于无淋巴结转移组(t=2.46,P<0.05)。结论MMP-9、TIMP-1蛋白的表达与SCC的侵袭性有关,MMP-9/TIMP1比值升高(MMP-TIMP失衡)预示了SCC肿瘤细胞较高的侵袭转移潜能。     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对鳞状细胞癌Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的:研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)表达的影响。方法:免疫细胞化学法检测Colo-16细胞中COX-2蛋白表达;免疫荧光显微镜观察转染情况;蛋白免疫印迹(Western blot)及半定量反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测Colo-16细胞MMP-2蛋白和MMP-2mRNA表达水平。结果:Colo-16细胞中COX-2蛋白阳性表达,并分布在胞质、胞核;Colo-16细胞胞质和胞核可见荧光标记的COX-2无义寡核苷酸、反义寡核苷酸;Western blot及RT-PCR检测结果显不COX-2反义寡核苷酸作用Colo-16细胞48 h后,MMP-2表达显著下调(P0.05)。结论:COX-2反义寡核苷酸能有效下调Colo-16细胞MMP-2表达,提示COX-2反义寡核苷酸可能通过抑制MMP-2表达来阻断皮肤鳞状细胞癌的浸润、转移。     

Stromal cells as the major source for matrix metalloproteinase-2 in cutaneous melanoma

Matrix metalloproteinases (MMPs) are essential for tumor progression, invasion and metastases formation. Expression of these proteinases is not only restricted to the tumor cells themselves, but also is found in normal stromal cells. Moreover, immunohistochemistry suggests stromal cells as the major source. To scrutinize this hypothesis we established a slowly growing, syngeneic tumor model using the B16-melanoma cell line B78D14. In vitro analysis demonstrated that B78D14 cells secreted MMP-2, MT1-MMP, and to a lesser degree MMP-9; in addition they expressed both MT1-MMP and EMMPRIN on their surface. In subcutaneous (s.c.) tumors of these cells MMP-2 expression was predominantly present at the tumor-stroma border indicating stromal cells as primary source for this protease in vivo. Indeed, double staining experiments and in situ zymography confirmed that tumor adjacent stromal cells at the invasive front expressed MMP-2 and only at this site activated MMP-2 was detectable. Notably, in an experimental pulmonary metastases model neither tumor nor stromal cells expressed MMP-2, suggesting that the capacity of stromal cells is largely dependent on the surrounding microenvironment.