双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化

背景:碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化,并被认为是胶质细胞的分裂原。目的:以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况,及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成。材料:选用50只SD大鼠,按随机数字表法分为4组:假手术组(n=10),脑缺血/再灌注损伤模型组(n=10),骨髓间充质干细胞治疗组(n=15),碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组(n=15)。方法:除假手术组外,其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内,脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。主要观察指标:应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况,比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。结果:移植7d后,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组(P<0.05),两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义(P>0.05)。再灌注7d后,静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。结论:碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活,并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞,发挥神经修复作用。     

双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化术

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006—03在中南大学实验动物中心实验室完成。材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血，再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。结果：移植7d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P〈0．05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P〉0．05）。再灌注7d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景:目前正在兴起的干细胞治疗技术及基因修饰技术有可能在肺动脉高压治疗中获得独特疗效。目的:探讨携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠血流动力学水平的影响。方法:选择3周龄SD雄性大鼠,于体外进行骨髓间充质干细胞培养及纯化,在腺病毒介导下实施基因转染,使碱性成纤维细胞生长因子基因成功导入骨髓间充质干细胞。将60只SD大鼠给予野百合碱腹腔注射(50 mg/kg)进行肺动脉高压模型复制,随机分成3组,其中肺动脉高压组于颈内静脉移植1 m L的L-DMEM培养基,骨髓间充质干细胞组于颈内静脉移植1 m L空腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞悬液,碱性成纤维细胞生长因子组于颈内静脉移植1 m L腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞悬液。结果与结论:经3周治疗后,各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P>0.05);其中碱性成纤维细胞生长因子组大鼠的肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05);各组大鼠右心室的肥大指数比较差异无显著性意义(P>0.05);碱性成纤维细胞生长因子组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示携带碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞移植,能够改善肺动脉高压大鼠肺血管的血流动力学水平,保护机体血管的内皮细胞,并拮抗血管的收缩。     

经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体内分化的影响

背景：体外研究显示,碱性成纤维细胞生长因子能促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。然而,在体内环境下经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能否促进骨髓间充质干细胞分化尚不明确。目的：探讨经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞在体内分化的影响。方法：①杂种犬12只,采用密度梯度离心与贴壁培养法在体外分离、培养骨髓间充质干细胞,增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞并分析转染率。②开胸结扎法建立急性心肌梗死模型,1周后将存活犬（n=10）随机分为骨髓间充质干细胞组（n=5）和碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组（n=5）,采用OTW球囊经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子和增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞。移植后1周,免疫荧光法比较两组梗死心肌内增强型绿色荧光蛋白阳性细胞共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白I的数量。结果与结论：增强型绿色荧光蛋白慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,转染率达85%;灌注后免疫荧光显示,23.5%的切片可以看到增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞阳性细胞;碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组增强型绿色荧光蛋白共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白 I 的细胞数量明显高于骨髓间充质干细胞组（P＆lt;0.05）。因此,经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能更有效地促进骨髓间充质干细胞分化成血管内皮细胞和心肌细胞;采用该途径联合灌注碱性成纤维细胞生长因子和骨髓间充质干细胞有望发挥协同作用,更好地促进心脏修复。     

芬戈莫德联合骨髓间充质干细胞移植脑创伤大鼠记忆功能的变化

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑损伤的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的：观察骨髓间充质干细胞移植同时应用芬戈莫德免疫抑制剂对脑损伤大鼠记忆功能恢复的影响。方法：选取健康SD大鼠60只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975 kPa峰值的液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为脑损伤组、骨髓间充质干细胞移植组、芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组。PKH-26标记的骨髓间充质干细胞移植后21-28 d进行Morris水迷宫试验。脑损伤4周后取脑组织行PKH-26免疫荧光、苏木精-伊红染色。结果与结论：移植后4周,各组平均潜伏时间均逐渐缩短,芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组平均潜伏时间较骨髓间充质干细胞移植组缩短（P＜0.05）,较脑损伤组明显缩短（P＜0.01）。芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组穿越平台次数及目标象限游泳距离与总距离百分比均高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组（P＜0.05）。芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组 PKH-26阳性细胞明显高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组（P＜0.05）。结果可见骨髓间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的记忆功能,联合应用芬戈莫德免疫抑制剂有协同效果。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:干细胞治疗神经组织损伤的关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,重建中枢神经系统的结构和功能.目的:立体定向移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制.方法:密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10 mg/L的BrdU进行标记.将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹闭法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为对照组、生理盐水组与移植组.移植组大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到脊髓损伤中心,生理盐水组给予等量生理盐水,对照组大鼠不做处理.于大鼠脊髓损伤前及损伤后第7,14,30,60,90天进行BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白、Brdu+碱性成纤维细胞生长因子、Brdu+脑源性神经生长因子免疫组织化学双染阳性细胞及单染阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P＜0.05):生理盐水组BBB评分在损伤后30 d内恢复速度慢于对照组(P＜0.05),至第90天与对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).②移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及免疫组织化学双染阳性细胞.移植组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子单染阳性细胞数明显高于对照组和生理盐水组(P＜0.05).结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关.     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力

背景:基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少.目的:观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响.方法:贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞.用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率.骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组.在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果与结论:重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%.缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05).缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05).提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关.     

静脉移植人脂肪间充质干细胞治疗大鼠颅脑损伤

背景：动物实验及临床研究证实间充质干细胞对创伤性脑损伤具有一定的治疗作用。目的：观察脂肪间充质干细胞移植治疗急性创伤性脑损伤大鼠行为学及损伤脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。方法：以自由落体硬膜外撞击法制作SD大鼠脑损伤模型后随机分为3组：移植组于脑损伤48h时经尾静脉注射Brdu标记的成人脂肪间充质干细胞;对照组不作处理;生理盐水组于脑损伤48h时经尾静脉注射生理盐水。采用NSS评分法评价大鼠神经功能恢复情况;倒置显微镜观察脂肪间充质干细胞在损伤脑组织内的迁移情况;免疫组织化学法检测大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白表达。结果与结论：移植组NSS评分明显低于对照组与生理盐水组（P〈0.05）。在受损伤脑组织周围可发现经Brdu标记的脂肪间充质干细胞。移植组大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率明显低于对照组与生理盐水组（P〈0.05）,且下降速度较快;巢蛋白表达明显高于对照组与生理盐水组（P〈0.05）。证实脂肪间充质干细胞通过血脑屏障进入受损大鼠脑组织后,以上调巢蛋白基因的表达来发挥保护神经元、促进神经发育与再生的功能。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植联合亚低温治疗大鼠脑损伤

背景：临床研究证明,亚低温（33~35℃）能有效减轻继发性脑和脊髓损伤,对中枢神经损伤有确切的保护作用。目的：检测是否可以通亚低温治疗的方法提高骨髓间充质干细胞立体定向移植对重型颅脑损伤大鼠的治疗效果。方法：采用液压颅脑损伤仪,给予Wistar大鼠2.53.31~303.98kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤大鼠模型,将其随机分为脑损伤组,骨髓间充质干细胞移植组,亚低温＋骨髓间充质干细胞组。后2组伤后6h将体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞立体定向移植到脑损伤灶内,亚低温＋骨髓间充质干细胞组同时给予低温治疗。伤后第3天用WesternBlot检测脑组织中AQP4蛋白合成的变化,采用干湿比重法测脑组织含水量。伤后24h,3d及伤后1,2周行动物神经学缺损评分,2周后处死行免疫组织化学和苏木精-伊红染色。结果与结论：亚低温治疗后,与脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组相比,亚低温＋骨髓间充质干细胞组AQP4蛋白表达量及脑水肿程度也明显降低（P〈0.05）,移植后1和2周,亚低温＋骨髓间充质干细胞组的大鼠神经学缺损评分明显低于其他两组;且其脑组织切片中的神经元数量较其他两组明显增多（P〈0.01）。提示骨髓间充质干细胞立体定向移植联合亚低温治疗大鼠脑损伤可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但目前尚不能清楚阐述骨髓间充质干细胞移植促进神经功能恢复的相关机制.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在中国医科大学神经生物学实验室完成.材料:健康Wistar大鼠75只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离培养,72只随机分为3组:假手术组(n=18)、DMEM组(n=27)、骨髓间充质干细胞组(n=27).方法:以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.参照Nystrom's压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓.模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射.主要观察指标:应用RT-PCR法和应用免疫组织化学技术检测损伤脊髓组织内血管内皮生长因子的表达和分布变化.结果:假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达.骨髓间充质干细胞组在细胞移植后l,3,5d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM组(P<0.05),移植后7,14d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间.     

骨髓间充质干细胞移植大鼠脑缺血区微血管密度和肝细胞生长因子的表达

背景：应用骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血可促进损伤神经功能的恢复,目前其作用机制尚未明确。目的：分析骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血保护作用的机制。方法：采用线栓法复制大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为假手术组、大脑中动脉栓塞组、溶剂对照组和骨髓间充质干细胞组。骨髓间充质干细胞组于脑梗死1d后经侧脑室注射入骨髓间充质干细胞,溶剂对照组则注射同等剂量的PBS。结果与结论：大鼠脑缺血后缺血区皮质可见大量的微血管生成,2周达高峰。骨髓间充质干细胞组缺血区微血管密度显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组（P〈0.01）。治疗后4,7,14d骨髓间充质干细胞组脑组织中肝细胞生长因子的表达水平显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组（P〈0.01）。提示骨髓间充质干细胞移植可促进大鼠缺血区微血管生成,改善缺血区血运,从而改善脑缺血大鼠的神经功能。     

静脉移植人脂肪间充质干细胞治疗大鼠颅脑损伤

背景:动物实验及临床研究证实间充质干细胞对创伤性脑损伤具有一定的治疗作用。目的:观察脂肪间充质干细胞移植治疗急性创伤性脑损伤大鼠行为学及损伤脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。方法:以自由落体硬膜外撞击法制作SD大鼠脑损伤模型后随机分为3组:移植组于脑损伤48h时经尾静脉注射Brdu标记的成人脂肪间充质干细胞;对照组不作处理;生理盐水组于脑损伤48h时经尾静脉注射生理盐水。采用NSS评分法评价大鼠神经功能恢复情况;倒置显微镜观察脂肪间充质干细胞在损伤脑组织内的迁移情况;免疫组织化学法检测大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白表达。结果与结论:移植组NSS评分明显低于对照组与生理盐水组(P<0.05)。在受损伤脑组织周围可发现经Brdu标记的脂肪间充质干细胞。移植组大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率明显低于对照组与生理盐水组(P<0.05),且下降速度较快;巢蛋白表达明显高于对照组与生理盐水组(P<0.05)。证实脂肪间充质干细胞通过血脑屏障进入受损大鼠脑组织后,以上调巢蛋白基因的表达来发挥保护神经元、促进神经发育与再生的功能。     

骨髓间充质干细胞移植入脑缺血大鼠侧脑室后的迁移及分化:免疫荧光标记

目的:骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞替代受损组织,并可分泌生长因子和营养因子来促进其体内细胞的存活和分化。实验将体外扩增和Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞移植入缺血性大鼠侧脑室内,观察干细胞在大鼠脑内的生存、迁移、分化情况及对神经功能恢复的影响。方法:实验于2004-12/2007-06在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①取体质量120～160g的SD大鼠用于制备移植细胞;另取80只体质量250～300g的SD大鼠用于制作大脑中动脉闭塞模型。实验方法符合动物伦理学要求。②应用直接贴壁法分离纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞,荧光染料Hoechst33342标记。③将造模成功的75只大脑中动脉闭塞大鼠按随机数字表法分为3组:模型对照组15只;磷酸缓冲液组30只;骨髓间充质干细胞移植组30只,将骨髓间充质干细胞立体定向移植到大鼠缺血侧脑室中。④术后1,3,6,12,24d测定大鼠神经功能损害评分,荧光显微镜下观察Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况,采用免疫荧光法检测胶质原纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的表达。结果:①细胞移植后6d,12d骨髓间充质干细胞移植组大鼠的神经功能评分均显著低于磷酸缓冲液组(P<0.05)。②移植的骨髓间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移。③移植第24天Hoechst33342/微管相关蛋白2、Hoechst33342/胶质原纤维酸性蛋白双阳性细胞占Hoechst33342阳性细胞的百分率为(10.45±1.35)%,(8.73±1.38)%。结论:骨髓间充质干细胞可以在动脉闭塞局灶性脑缺血模型大鼠脑中存活,并向缺血区域附近迁移,在一定条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,同时能促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的生物学特性及对血管生成的影响

背景:碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比.设计、时间及地点:对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成.材料:2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导.5周龄Wistar大鼠用于移植实验.牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠.方法:分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选.稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况.主要观察指标:碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较.结果:利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况.从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性.重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达.转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达.转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化.转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P＞0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P＜0.01).骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录.转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多.结论:稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想.外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因.     

RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复

背景：研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。目的：脐带间充质干细胞移植同时联合RNAi介导的RhoA基因沉默,观察两者对脑损伤大鼠恢复的影响。方法：健康Wistar大鼠84只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为对照组,脐带间充质干细胞移植组,联合组（脐带间充质干细胞移植联合RhoA基因沉默）。CM-Dil标记的脐带间充质干细胞移植后采用改良神经功能损伤评分系统（mNSS）评价大鼠神经功能恢复情况,在创伤性脑损伤后21-28d进行Morris水迷宫试验。4周后处死并行全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况,采用RT-PCR检测各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。结果与结论：移植后1,2,3,4周,大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞移植组低于对照组（P〈0.05）,联合组明显低于对照组（P〈0.01）。Morris水迷宫试验各组平均逃避潜伏期均逐渐缩短,联合组3-5d时平均潜伏时间较脐带间充质干细胞移植组缩短（P〈0.05）,较对照组明显缩短（P〈0.01）;联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于对照组和脐带间充质干细胞移植组（P〈0.05）。移植4周后,脑组织冰冻切片和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量和CM-Dil阳性细胞数联合组多于脐带间充质干细胞移植组,脐带间充质干细胞移植组多于对照组（P〈0.05）;联合组RhoAmRNA表达水平较对照组和脐带间充质干细胞移植组显著降低（P〈0.05）。提示脐带间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用RhoA基因沉默有协同效果。     

BMSCs移植后脊髓损伤大鼠VEGF表达的变化

目的观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响。方法以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质千细胞。压迫法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓。模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射。结果假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达。骨髓间充质干细胞组在细胞移植后1,3,5 d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM(P0.05),移植后7,14 d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P0.01)。结论骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植联合亚低温治疗大鼠脑损伤

背景:临床研究证明,亚低温(33~35℃)能有效减轻继发性脑和脊髓损伤,对中枢神经损伤有确切的保护作用。目的:检测是否可以通亚低温治疗的方法提高骨髓间充质干细胞立体定向移植对重型颅脑损伤大鼠的治疗效果。方法:采用液压颅脑损伤仪,给予Wistar大鼠2.53.31~303.98kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤大鼠模型,将其随机分为脑损伤组,骨髓间充质干细胞移植组,亚低温+骨髓间充质干细胞组。后2组伤后6h将体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞立体定向移植到脑损伤灶内,亚低温+骨髓间充质干细胞组同时给予低温治疗。伤后第3天用WesternBlot检测脑组织中AQP4蛋白合成的变化,采用干湿比重法测脑组织含水量。伤后24h,3d及伤后1,2周行动物神经学缺损评分,2周后处死行免疫组织化学和苏木精-伊红染色。结果与结论:亚低温治疗后,与脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组相比,亚低温+骨髓间充质干细胞组AQP4蛋白表达量及脑水肿程度也明显降低(P<0.05),移植后1和2周,亚低温+骨髓间充质干细胞组的大鼠神经学缺损评分明显低于其他两组;且其脑组织切片中的神经元数量较其他两组明显增多(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞立体定向移植联合亚低温治疗大鼠脑损伤可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能。     

沉默RhoA基因对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的作用

背景:研究证实,RhoA基因在神经继发损伤中发挥着重要的作用,通过基因沉默降低其表达,可以有效阻断继发性神经损伤.RhoA蛋白介导的神经突生长抑制作用是影响骨髓间充质干细胞移植后修复效果的重要原因.目的:验证是否可以通过沉默RhoA基因的方法,改良骨髓间充质干细胞静脉移植对大鼠脑梗死的治疗效果.方法:体外培养骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,用Western blot法检测神经干细胞在转染前后RhoA基因的表达.建立大脑中动脉闭塞模型,分为3组,通过尾静脉分别注入RhoA基因沉默的骨髓间充质干细胞悬液、骨髓间充质干细胞悬液及不含干细胞的培养液(对照组).注入移植液后24 h,3 d,1,2 周行Bederson评分检测神经功能的损伤情况.造模2周后处死大鼠取材,行免疫组织化学和苏木精-伊红染色观察大脑梗死处组织学变化.结果与结论:经分子干扰RNA转染后24 h的骨髓间充质干细胞RhoA基因表达较转染前显著降低(P=0.002).沉默RhoA基因后的骨髓间充质干细胞移植治疗,无论从组织学上还是功能学上疗效都有明显的提高.提示用RNA干扰的方法使骨髓间充质干细胞的RhoA基因沉默,再通过尾静脉注射的方法移植到大鼠颅脑损伤区,移植的骨髓间充质干细胞可以更好地在损伤部位存活,增殖分化与迁移,促进脑梗死后大鼠神经功能的恢复.     

骨髓间充质干细胞移植大鼠脑缺血区微血管密度和肝细胞生长因子的表达

背景:应用骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血可促进损伤神经功能的恢复,目前其作用机制尚未明确。目的:分析骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血保护作用的机制。方法:采用线栓法复制大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为假手术组、大脑中动脉栓塞组、溶剂对照组和骨髓间充质干细胞组。骨髓间充质干细胞组于脑梗死1d后经侧脑室注射入骨髓间充质干细胞,溶剂对照组则注射同等剂量的PBS。结果与结论:大鼠脑缺血后缺血区皮质可见大量的微血管生成,2周达高峰。骨髓间充质干细胞组缺血区微血管密度显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组(P<0.01)。治疗后4,7,14d骨髓间充质干细胞组脑组织中肝细胞生长因子的表达水平显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞移植可促进大鼠缺血区微血管生成,改善缺血区血运,从而改善脑缺血大鼠的神经功能。     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的：验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24h,3d及伤后1,2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。结果与结论：移植后1周,高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组（P〈0.05）。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43mRNA的表达高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组（P〈0.05）。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组（P〈0.05）。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。