北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.     

桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶——鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的原核表达和过表达载体。方法将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达2~10 h后,通过SDS-PAGE进行检测。根据Gen Bank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子序列设计引物,利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段,以植物双元表达载体p CAMBIA1301为基础载体,通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子,再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游,构建桑黄SE基因的过表达载体。结果成功构建了SE基因的原核表达载体p ET-32a-SE,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000,与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知,成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体p CAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体p CAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础。     

阳春砂单萜合酶基因AvTPS1载体构建和原核表达

目的构建AvTPS1的原核表达载体并进行蛋白表达,为该基因在原核表达系统中的功能鉴定奠定基础。方法用In-Fusion方法构建AvTPS1截掉转运肽的表达载体;用Gateway方法构建AvTPS1包含完整阅读框的表达载体;两种表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和BL21DE3plys中进行诱导表达,用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)以及Western杂交检测蛋白的表达情况。结果构建了原核表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1;这两个表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21DE3plys中均没有表达出明显的相应蛋白,但是这两个载体在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达后,用Western杂交检测有蛋白存在。结论成功构建了阳春砂单萜合酶基因AvTPS1的表达载体和工程菌。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

人参中核黄素激酶基因的克隆与原核表达

目的从人参中克隆出核黄素激酶基因,进行相关的生物信息学分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌诱导表达。方法根据人参转录组数据库筛选出序列comp61599_c0_seq12,经相关软件对其进行序列分析;该序列3’末端缺失,利用3’RACE技术获得3’端序列;通过PCR技术获得人参核黄素激酶基因的全长c DNA序列,并构建原核表达载体p ET-32a-Pg RFK,通过热激法转化到大肠杆菌BL-21中进行诱导表达。结果从人参中成功克隆出1条长度为1 200 bp的核黄素激酶基因,其编码399个氨基酸,同时成功构建该基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白大小与预测蛋白相对分子质量一致。结论成功克隆了人参核黄素激酶基因,并在大肠杆菌中成功表达。     

川泽泻鲨烯合酶基因的原核表达研究

目的:构建川泽泻鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的原核表达载体。方法:在建泽泻SS基因序列的基础上,采用RT-PCR技术,从川泽泻新鲜叶片中克隆得到SS基因,并在BL21(DE3)细胞中分别用不同的表达载体、IPTG浓度、温度诱导该蛋白表达。结果:该基因在大肠杆菌中表达,但为包涵体,将其克隆到带有GST标签的pGEX-6t-1载体中进行原核表达并未改善蛋白溶解性;30℃诱导蛋白表达最佳;不同IPTG浓度对蛋白表达影响不大。结论:川泽泻的原核表达为后续对该基因的生物学功能及川泽泻品质改良奠定了基础。     

芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达

目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin(Pl Actin)基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a(+)-Pl Actin,转化BL21(DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4~0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。     

人胰激肽原酶的表达

 目的克隆人胰腺组织激肽原酶基因，构建分泌型原核表达载体。方法使用RT-PCR的方法扩增人胰腺组织cDNA，从中扩增出激肽原酶基因。将扩增的激肽原酶基因用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，连接到同样双酶切处理的pET-20b(+)载体上，酶切鉴定后，进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE，在相对分子质量31.4×103处可见明显的高表达带。蛋白质免疫印迹实验表明，重组蛋白具有激肽原酶的抗原性。结论成功克隆人胰腺组织激肽原酶基因，并高效表达融合蛋白，为进一步开发基因工程药物打下基础。     

342bp人骨形态发生蛋白2成熟肽基因的克隆表达

目的探讨克隆人骨形态发生蛋白2(hBMP2)成熟肽的最精简的基因序列并原核表达方法。方法剔除所有信号肽和中间前肽的非必需基因序列,以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342 bp的成熟肽基因片段,将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序,构建PBV220-hBMP2的真核基因原核表达系统,在DH5α大肠杆菌下扩增并温度诱导表达hBMP2蛋白质,SDS-PAGE检测表达蛋白。结果RT-PCR扩增出hBMP2的成熟肽基因342 bp片段与Genbank公布的序列完全一致,且经DNA电泳和蛋白电泳鉴定,构建PBV220-hBMP2原核表达系统可导入DH5α大肠杆菌,并在温度诱导下表达出约16 kD的蛋白条带,诱导培养4 h后的蛋白表达量达到最高峰。结论成功扩增342 bp的成熟肽hBMP2基因片段能在原核大肠杆菌上有效表达生产hBMP2蛋白质。     

鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因的克隆及表达研究

目的:克隆和表达鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因,为提高湖北栽培的鞘蕊苏有效成分含量奠定基础。方法:提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得CfGA01基因全长。结果:完整的赤霉素氧化酶基因全长1234 bp,编码355个氨基酸,命名为CfGA01;通过构建系统进化树比较CfGA01与其他物种中的赤霉素氧化酶基因的亲缘关系,发现CfGA01与丹参GA蛋白的亲缘关系比较近,最后成功构建了赤霉素氧化酶基因原核表达载体PGCfGA01,并成功进行了表达。结论:克隆得到鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因全长并构建原核表达载体,为研究鞘蕊苏有效成分合成酶奠定了基础。     

大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因,构建蒜氨酸酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中表达,进一步探讨重组蒜氨酸酶的生物学活性。方法利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因,通过pPIczαC载体构建pPIczαC-蒜氨酸酶真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母X-33,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取表达上清进行SDS-PAGE和Western blotting分析。利用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性,Lowry法测2种蒜氨酸酶蛋白质量,通过比活力比较2种酶活性大小。结果从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因,大小为1 500 bp,重组蒜氨酸酶相对分子质量约为5.5×104,存在于毕赤酵母表达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为(82.09±3.89)U/mg,天然蒜氨酸酶比活力为(176.49±5.06)U/mg。结论蒜氨酸酶基因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达,重组蒜氨酸酶具有酶活性,但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。     

基于雌激素应答元件转录调节的药物筛选模型的建立

目的 :建立靶向雌激素应答元件 (ERE)的药物筛选模型 ,为筛选雌激素受体 (ER)配体奠定基础。方法 :构建重组报告基因载体 pERE-TAL-SEAP ,与对照载体 pCMVβ瞬时共转染表达人ERα或ERβ的Hela细胞株 ,观察化合物对SEAP报告基因表达活性的影响。结果 :雌二醇 (E₂ )诱导表达人ERα或ERβ的Hela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀分别为 (80.5 8± 8.51) pmol·L^-1和 (10 3.90± 5.29) pmol·L^-1,最大效应浓度为 10nmol·L^-1;金雀黄素 (Gen)也诱导表达人ERα和ERβHela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀ 分别为 (39.38±2.26)nmol·L^-1和 (10.86±0 .75 )nmol·L^-1;最大效应浓度为 1μmol·L^-1;E₂ 和Gen诱导SEAP表达的最大水平较对照孔细胞高 7～ 14倍。ER拮抗剂ICI182 ,780可完全抑制E₂ 和Gen对SEAP的诱导作用。结论 :利用此模型检测化合物诱导报告基因的表达水平可筛选和发现ER配体。     

RNA干扰抑制脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达的实验研究

目的:靶向白细胞介素6受体(sIL-6R)基因构建具有高干扰效率的RNA干扰载体,观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。方法:靶向sIL-6R基因设计3条短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,转染脊髓源星形胶质细胞,筛选出对sIL-6R基因干扰效率最高的sIL-6R siRNA,用免疫组化染色、RT-PCR及Western blot技术观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。结果:成功构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,免疫组化染色、RT-PCR及Western blot检测结果证实sIL-6R siRNA能显著下调sIL-6R的表达。结论:sIL-6Rs iRNA重组质粒真核表达载体对脊髓损伤后sIL-6R表达有明显的抑制作用,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤修复中的应用奠定了前期基础。     

pCMV-tag2B-CD258质粒的构建和初步表达鉴定

目的构建肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员CD258的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的CD258全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B中,构建CD258的重组表达载体pCMV-tag2B-CD258,经DNA测序证明CD258的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染人前列腺癌IA8细胞系,诱导其表达,G418筛选阳性克隆,用Western Blot进行鉴定。结果pCMV-tag2B-CD258经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的CD258基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-CD258导入IA8细胞并成功表达,目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论重组质粒pCMV-tag2B-CD258能表达具有生物学活性的CD258蛋白,为研究CD258在前列腺癌中的功能打下了基础。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达

目的：构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞中并检测其表达。方法：RT-PCR检测Bmi．1mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-468细胞中的表达水平;从MCF-7细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增Bmi-1基因序列,将含有Bmi-1全长编码序列的PCR产物经TA克隆后经PCR、酶切验证,亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转化至大肠杆菌后,酶切、测序鉴定;将重组质粒转染到MDA-MB-468中,48h后RT-PCR检测转染前后Bmi-1mRNA及hTERTmRNA的表达变化。结果：Bmi-1mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达。成功从MCF-7细胞中克隆获得Bmi-1基因并构建真核表达载体。转染后在MDA-MB-468中检测到Bmi-1mRNA表达上调,其过表达上调hTERTmRNA的表达。结论：成功克隆和建立人Bmi-1基因真核表达载体;pcDNA3．1（＋）-Bmi-1能在MDA-MB-468中表达;为进一步研究Bmi-1基因在细胞中的功能奠定了基础。     

红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

目的 获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。