基于丹参基因组的蛋白磷酸酶2C家族的系统分析

目的:基于全基因组策略系统解析药用植物丹参的蛋白磷酸酶2C家族成员,为研究丹参逆境胁迫响应的分子机制奠定基础。方法:采用BLASTP序列比对、系统发育树构建、基因表达分析等方法解析丹参PP2C亚家族成员、基因结构以及差异表达图谱。结果:丹参基因组共注释到83个PP2C家族成员,在高等植物中保守存在;系统进化分析将PP2C家族分为13个亚家族(PP2CA-PP2CL,A、B、C、D、E、F1、F2、G、H、I、J、K、L),结构域高度保守;PP2CA亚家族基因启动子含有多种逆境胁迫应答的顺式作用元件,大部分PP2CA基因表达显著响应逆境胁迫信号。结论:本实验系统研究丹参PP2C基因的结构、在不同组织部位的表达及逆境胁迫下的响应,为揭示丹参响应生物或非生物胁迫的分子机制研究提供理论依据。     

铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(Sn RK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛Sn RK2(DoSRK2E)基因c DNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支III,与拟南芥At SnRK2.6的亲缘关系最近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量最高,茎中次之,叶中最低。结论首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础。     

太子参SnRK2I基因的克隆及在水分胁迫条件下的响应

目的:获取太子参蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因,分析该基因在水分胁迫条件下的响应情况。方法:基于对SnRK2基因的同源性及太子参转录组数据库的分析,以不同水分胁迫处理的太子参鲜品为材料,利用基因克隆技术克隆得到太子参SnRK2基因序列,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因与水分胁迫的相关性。结果:从太子参中克隆得到1条PhSnRK2I基因,cDNA全长为1 261 bp,编码305个氨基酸,分子量为47.27 kDa。该蛋白具有与SnRK2家族相似的ATP结合位点和Ser/Thr激酶活化环。实时荧光定量PCR分析结果表明,PhSnRK2I在土壤相对含水量为86%和44%时表达量较高。结论:成功克隆得到太子参PhSnRK2I基因序列,分析结果表明PhSnRK2I在中度水分胁迫下响应最积极,在太子参水分胁迫信号转导中发挥着重要作用。该研究可为进一步研究太子参PhSnRK2I基因在水分胁迫响应过程中的调控机理研究提供实验基础。     

铁皮石斛DcCDPK8基因启动子克隆及功能分析

铁皮石斛钙依赖性蛋白激酶基因DcCDPK8参与低温激素ABA和MeJA的信号转导过程,但转录调控尚不明确,为了研究铁皮石斛DcCDPK8基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,采用PCR技术克隆铁皮石斛DcCDPK8基因启动子序列,并利用5'端缺失和GUS基因的融合表达研究启动子序列功能。结果表明DcCDPK8基因启动子序列含有1个低温响应元件LTR(-1 749～-614 bp),2个茉莉酸甲酯响应元件(-1 749～-230 bp)和1个ABA响应元件(-614～-230 bp),构建3个5'端不同缺失片段融合GUS报告基因的p BI121真核表达载体,瞬时转化烟草叶片,经低温胁迫后GUS活性强弱为DcCDPK8-p1DcCDPK8-p2 DcCDPK8-p3,经外源ABA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1 DcCDPK8-p2 DcCDPK8-p3,而经外源MeJA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1DcCDPK8-p2DcCDPK8-p3,推测DcCDPK8基因启动子序列中ABA响应元件(ARE)对外源ABA的响应起正调控作用,而MeJA顺式作用元件对外源茉莉酸甲酯响应起抑制作用。     

丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析

目的克隆丹参晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对,发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列,命名为Sm LEA2,Gen Bank登录号为HQ676610。进一步利用PCR和RT-PCR技术从丹参g DNA以及c DNA水平克隆得到了Sm LEA2基因全长。采用软件分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量PCR的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的Sm LEA2表达量进行检测。结果获得Sm LEA2 g DNA长1 961 bp,由1个外显子和1个内含子组成,并且内含子位于ATG的上游;开放阅读框长为960 bp,共编码319个氨基酸。生物信息学分析显示,Sm LEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,其相对分子质量为35 340,等电点为4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,并且在茎中的表达量最高。随着花的成熟和种子的发育,该基因表达量逐渐升高,并且该基因的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)以及脱落酸(ABA)的诱导作用影响。结论克隆得到的丹参Sm LEA2可能参与种子发育过程,并在丹参防御反应中发挥作用。     

白桦BpTRX基因和启动子克隆及H_2S处理后的表达模式

目的研究白桦硫氧还蛋白(Betula platyphylla thioredoxin,BpTRX)基因全长和启动子序列及其编码结构和性质,揭示其在硫化氢(H2S)处理下BpTRX的表达模式。方法通过PCR手段克隆BpTRX基因,应用染色体步移技术获得BpTRX启动子区序列,并对BpTRX基因、启动子及其编码蛋白进行生物信息学分析,构建BpTRX系统进化树。利用实时荧光定量PCR定量分析BpTRX基因在H2S外源胁迫处理下的表达模式。结果 BpTRX基因全长351 bp,编码了由117个氨基酸组成的蛋白。BpTRX基因与蓖麻、大豆、苜蓿和葡萄TRX-H型蛋白亲缘关系紧密。获得的BpTRX启动子区序列为873 bp,包含了转录必备的元件以及大量的胁迫响应和激素响应元件等。结论获得BpTRX基因的全长和部分启动子序列,BpTRX基因对H2S处理的响应趋势为双峰形式,即先增加后降低、再增加再降低。     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

白花丹参顺式还原酮加双氧酶基因的克隆、 分子特征和表达调控分析

目的:获得白花丹参参与乙烯和多胺合成的顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase,ARD)基因(命名为SmARD)序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用全长cDNA文库技术,从两年生白花丹参根中获得目的基因SmARD序列.利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找该基因的开放读码框,prosite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花中的表达情况.结果:得到688 bp的SmARD基因全长序列.具有一个591 bp的开放读码框,编码196个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量23.27 kDa.使用预测的SmARD蛋白序列在NCBI中进行蛋白保守域分析,发现SmARD与ARD/ARD'家族具有很高的同源性.半定量RT-PCR表明,SmARD在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花等组织中均有转录水平的表达,但是在根部表达最强.水分亏缺处理3 d,150 mmol·L-1 NaCl处理1 d,4℃低温处理1 d和100 μmol·L-1 ABA处理1 d均抑制SmARD的表达,100 μmol·L-1茉莉酸甲脂(MJ)和10 μmol·L-1乙烯利(ETH)处理1 d诱导SmARD的表达.结论:首次得到白花丹参的顺式还原酮加双氧酶(ARD)基因序列,为其参与白花丹参响应逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能研究奠定了基础.     

穿心莲TCP基因家族全基因组鉴定及非生物胁迫下的表达分析

穿心莲是我国岭南地区重要的药用植物,具有清热解毒、抗菌消炎等功效。TCP基因家族是调控植物生长发育和胁迫响应的一类转录因子。为解析TCP基因家族成员在穿心莲非生物胁迫下的作用,该研究基于全基因组水平鉴定穿心莲TCP基因家族,并进行了其响应非生物胁迫的表达模式分析。结果表明,穿心莲TCP基因家族共有23个成员,氨基酸长度为136～508 aa,相对分子质量为14 854.71～55 944.90 kDa,等电点为5.67～10.39,均定位于细胞核,不均匀分布于13条染色体上,系统进化分析将其划分为3个亚家族：PCF、CIN和CYC/TB1。基因结构和保守基序分析显示绝大多数TCP基因家族成员均含有相同排列顺序的motif 1、motif 2、motif 3和1～3个CDS。启动子顺式作用元件分析表明穿心莲TCP基因家族的转录表达可能受光、激素和逆境胁迫的诱导;结合TCP基因家族响应逆境胁迫的表达模式分析和qRT-PCR验证,预测到ApTCP4、ApTCP5、ApTCP6和ApTCP11可能参与响应干旱、高温和MeJA等多种非生物胁迫。该研究为深入挖掘穿心莲TCP基因响应非生物胁迫下的功...     

地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析

为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对,应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系,以实时荧光定量PCR技术检测RgIAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明,获得1条903 bp的cDNA序列,包含一个681 bp完整的开放阅读框（ORF）,编码226个氨基酸,具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列。RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达,其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大,其次为茎,且随着叶片的伸展,RgIAA1表达强度不断降低。在连作时RgIAA1的表达量升高,NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低。实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

白花丹参丙酮酸脱羧酶基因的克隆和表达分析

目的 获得白花丹参丙酮酸脱羧酶(SmPDC)全长基因,分析该基因在白花丹参不同组织部位,以及缺氧胁迫处理后的该基因表达差异.方法 利用cDNA文库筛选获得SmPDC基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmPDC基因在白花丹参不同部位的表达情况,及缺氧处理条件下的表达情况.结果 获得的SmPDC基因由2 190个核苷酸组成,编码605个氨基酸,蛋白相对分子质量药6.485×104,等电点pI 5.49;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎和叶;缺氧胁迫处理会诱导该基因的表达,随胁迫时间延长表达量逐渐增加.结论 白花丹参SmPDC基因是PDC家族新成员,其功能与植物耐缺氧代谢途径有关.     

丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的 克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法 根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测逆境胁迫（低温、盐及干旱）和激素诱导（生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯）下的基因表达量。结果 丹参SmRopGEF1基因开放阅读框（ORF）全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62 362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta（DE3）菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论 克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

丹参转录因子SmWRKY14基因的克隆及表达分析

目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14，分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法 以丹参转录组数据中Unigene（c50007_g1）序列为参考，利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征，采用DNAMAN和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建，运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果 克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长1 103 bp，编码244个氨基酸，相对分子质量27 600，等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序，不含信号肽及跨膜结构域，其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达，且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似，且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论 获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征，为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。