KDR-CDglyTK融合基因系统对结肠癌细胞增值的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人结肠癌细胞SW620增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SW620细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciciovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine).观察该体系对SW620细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW620和LS174T细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P>0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW620细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P<0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人结肠癌SW620细胞,抑制其增值.     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK 基因靶向杀伤胃癌细胞的体外实验研究

目的探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901靶向杀伤作用以及是否存在旁观者效应。方法用MOI=100时,将携带融合基因重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK体外感染SCG7901、ECV304和HepG2细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦分别按不同浓度、不同作用时间和方式下,观察双自杀基因体系对SCG7901细胞的靶向杀伤作用和旁观者效应。结果携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901、HepG2和ECV304细胞中有GFP表达。感染腺病毒Ad-CMV-CDglyTK的各细胞以及感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞对单一前药具有较高的敏感性,细胞的存活率各随单一前药浓度的增加而递减;而感染腺病毒的Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞对前药不敏感。感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞分别在同一浓度前药的作用下,...     

双自杀基因重组腺病毒对SCG7901细胞的体外杀伤作用

目的 探讨KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-KDRp-CDglyTK)对胃癌SCG7901细胞的体外杀伤作用.方法 分别用重组腺病毒Ad-KDRp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染胃癌SCG7901细胞,给予前药5-FC、GCV,测定SCG7901细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应.流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-KDRp-CDglyTK和Ad-CMV-CDglyTK分别对SCG7901细胞的细胞周期的变化及凋亡率.结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-KDRp-CDglyTK系统对SCG7901细胞的集落形成、细胞生长均具有更强的抑制作用,并可见较明显的旁观者效应.而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用差异无统计学意义.感染SCG7901细胞的两种腺病毒各自的实验组和对照组之间的细胞周期和凋亡率差异有统计学意义.结论 KDR启动子驱动的双自杀基因治疗系统对胃癌SCG7901细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似.     

KDR启动子驱动的双自杀基因对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基凶系统CDglyTK对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用.方法 用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的BEL-7402、HUVEC细胞和不表达KDR的HepG2细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应.结果 以感染复数MOI为100的腺病毒AdKDR-CDglyTK分别感染各细胞株,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率.RT-PCR检测发现,重组腺病毒及感染AdKDR-CDglyT的三种细胞均有目的基因CDglyTK的表达.感染腺病毒的BEL-7402、HUVEC细胞对前药具有较高的敏感性,而HepG2细胞对前药不敏感(P<0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应.结论 KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对肝癌细胞及人脐静脉内皮细胞具有特异性的杀伤作用.     

KDR启动子驱动的双自杀基因对人结肠癌细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人结肠癌细胞SW480的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的SW480细胞和不表达KDR的LS174T细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应;用流式细胞术观察细胞内DNA含量和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW480和LS174T细胞中有GFP表达。RT-PCR检测发现SW480细胞有目的基因的表达,而LS174T细胞无表达。在前药应用下,已转染腺病毒的SW480和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW480细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应。用流式细胞仪测定给药组出现典型的凋亡峰,细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞...     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因(AdKDR-CDglyTK)对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法 选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞,用腺病毒重组体AdEasy-KDR-CDglyTK和AdEasy-CMV-CDglyTK感染之,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果 两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株,其表现出对前药不同的敏感性:感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(P>0.1);相比之下,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人脐血管内皮细胞株ECV30的增殖活性、细胞周期及凋亡的影响.方法 以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的ECV30细胞株和对照组不表达KDR的LS17T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对ECV30细胞的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变.结果 重组腺病毒对ECV30细胞及对照组LS17T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的ECV30细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS17T细胞对前药不敏感(P均<0.001).融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.流式细胞术检测表明该体系抑制ECV30细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P均<0.001).同时,电镜下可见ECV30有凋亡和坏死改变.结论 KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关.     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

目的 探讨血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动重组腺病毒CDglyTK融合基因体系对结直肠癌细胞株LOVO及人脐血管内皮细胞株ECV30的选择性杀伤作用.方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的LoVo、ECV30细胞和对照组不表达KDR的LS17T细胞,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对细胞株的杀伤效应.结果 制备的病毒滴度为2.0×1012pfu/ml.3种细胞的感染率相似,且感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均接近100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株,发现其对前药的敏感性不同:表达KDR的LoVo和ECV30细胞对前药具有较高的敏感性,且二者敏感性无显著差异(P>0.1);与前二者相比,LS17T细胞对前药不敏感(P<0.001).同时,CDglyTK双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001).流式细胞术检测表明该体系抑制LoVo细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P<0.001).结论 KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤结直肠癌LoVo细胞和血管内皮细胞.     

重组腺病毒驱动KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株MCF-7及血管内皮细胞(ECV304)选择性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。并通过流式细胞仪检测前药对瘤细胞周期的影响。结果所得病毒滴度为2.0×1012pfu/ml。3种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当感染复数(MOI)为200时,所有细胞株均达约100%感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的MCF-7细胞和ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,二者敏感性差异无显著性意义(P=1.00);与前2者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。CDglyTK融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MCF-7细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0.001)。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮细胞。     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.     

Adenovirus-mediated CDglyTK fusion gene system driven by KDR promoter selectively kills MCF-7 breast cancer cells and vascular endothelial cells]

OBJECTIVE: To observe the selective killing of MCF-7 human breast cancer cells and vascular endothelial ECV304 cells by adenovirus (Ad)-mediated double suicide gene driven by KDR promoter. METHODS: The plasmid pAdEasy-KDR- CDglyTK was transfected into 293 packaging cells for amplification of the infectious Ad, which were then used to infect KDR-producing ECV304 and MCF-7 cells and LS174T cells that did not produce KDR. The infected cells were treated with 5-FC and/or GCV at different doses to observe the cell-killing and bystander effects of AdKDR-CdglyTK. The cell cycle changes were also detected by flow cytometry. RESULTS: The Ad at the titer of 2.0 x 10(12) pfu/ml was obtained after the amplification, whose infection rates of the cells were similar, but could be increased gradually with the multiplicity of infection (MOI) till reaching 100% with the MOI of 200. The infected cells exhibited different sensitivities to the two prodrugs: ECV304 cells and MCF-7 cells infected with Ad-KDR-CDglyTK showed similar high sensitivity to the prodrugs (P=1.00), whereas the infected LS174T cells appeared to be less sensitive (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stranger than that of either suicide gene (P<0.001), but all exhbiting considerable bystander effect. In addition, the cell cycle of MCF-7 cells was arrested at G1 phase. CONCLUSIONS: CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter can selectively kill KDR-expressing vascular endothelial cells and MCF-7 cells.     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effect of adenovirus (Ad)-mediated fusion gene systemdriven by KDR promoter on the proliferation, apoptosis and cell cycle of human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The KDR-expressing ECV304 cells and LS174T cells not expressing KDR were both infected by the AdEasy-KDR-CDglyTK followed by treatment with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and/or ganciclovir (GCV) at different concentrations. The killing effects of the transfection on the cells were evaluated and bystander effects analyzed by coculturing the uninfected cells by AdKDR-CDglyTK with different ratios of infected cells. Flow cytometry was employed for determining the cell cycle distribution and electron microscopy performed to observe the pathological changes of cells. RESULTS: The infection rates of the resultant recombinant Ad (rAd) were similar in the cells and gradually increased with the increment in the multiplicity of infection (MOI) of the Ads. The infected cells exhibited different sensitivities to the two prodrugs: ECV304 cells infected with rAd were highly sensitive to the prodrugs, but the infected LS174T cells were not (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either single suicide gene (P<0.001), showing also obvious bystander effect. In addition, the cell cycle of ECV304 cells was arrested at S phase with morphologic features of apoptosis and necrosis as displayed by electron microscopy. CONCLUSIONS: CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter selectively kills the KDR-CDglyTK-expressing endothelial cells, the mechanism of which may involve cell cycle arrest and necrosis and apoptosis of the cells.