脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

背景:脐带Wharton's Jelly中间充质干细胞可以向胰岛样细胞诱导分化.目的:验证脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞诱导分化的可能性,并观察移植后对糖尿病大鼠血糖的影响.方法:分离、诱导、传代脐带Wharton's Jelly中间充质干细胞,再与大鼠胰腺细胞共培养,诱导成胰岛细胞团样组织.将大鼠分为3组,正常对照组不进行移植及造模;模型组仅制备糖尿病大鼠模型;实验组造模后将胰岛样细胞移植入糖尿病大鼠肾脏包膜.结果与结论:脐带Wharton's Jelly细胞培养中有细胞从组织块中爬出,第7天形态发生变化,贴壁细胞部分变成梭形.分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志CD44、CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD14.诱导第7,10天PDX-1及人胰岛素强染色;胰岛素及C-肽浓度较单纯培养组明显升高;PDX-1及人胰岛素mRNA诱导第7、10天较高表达.移植第1周大鼠尾尖血糖链脲佐菌素实验组明显低于模型组(P < 0.01),但明显高于正常照组(P < 0.01).8周链脲佐菌素实验组肾脏被膜下发现胞核染棕色染色的Brdu阳性、胞浆棕色染色的胰岛素阳性细胞.结果表明,脐带Wharton's Jelly中存在脐带源间充质干细胞,与大鼠胰腺细胞共培养可促进间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化,移植入糖尿病大鼠肾脏被膜下,可显著降低糖尿病大鼠血糖.     

人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化

目的:前期实验采用药物诱导的方法将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞,将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞共同培养及移植入糖尿病大鼠体内,观察其在胰岛细胞生长的微环境及在体环境中向胰岛样细胞分化的潜能.方法:实验于2006-10/2007-09在汕头大学医学院生殖遗传实验室完成,属于广东省科技厅重点实验室.[1]实验材料:SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.对动物处置符合动物伦理学标准.脐带取自汕大附二妇产科健康足月妊娠剖宫产的胎儿,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:分离培养人脐带间充质干细胞,并采用酶消法分离大鼠胰岛细胞.将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔共同培养,在共培养的第3,7,14天采用放射免疫法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1基因的表达,以单独培养的脐带间充质干细胞为对照.经尾静脉将人脐带间充质干细胞移植入糖尿病模型大鼠体内,采用半定量RT-PCR方法检测人insulin基因表达.结果:[1]共培养条件下的人脐带间充质干细胞由长梭形逐渐变圆,并聚集成团.[2]放射免疫法结果表明,共培养组人脐带间充质干细胞随葡萄糖浓度的增高而分泌的胰岛素量也增加,与对照组相比差异显著(P<0.05).[3]未经共培养诱导的人脐带间充质干细胞不表达PDX-1,共培养3d的人脐带间充质干细胞表达PDX-1,共培养7d的人脐带间充质干细胞仍表达PDX-1,共培养14d的人脐带间充质干细胞未表达PDX-1.[4]未经移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺不表达人insulin基因,而移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺在第60天时能够检测出人insulin基因.结论:人脐带间充质干细胞具有在体内外的微环境中向胰岛样细胞分化的潜能.     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景:相对于其他来源的干细胞而言,脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小,但并不等同于无任何免疫排斥反应.目的:观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化,及其移植后对槠尿病大鼠的治疗效果.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验窀完成.材料:清洁级雄性SD大鼠36只,随机分为4组:胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只.人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供.方法:取传至第3代的人脐带间充质干细胞,待细胞融合至70%～80%后,换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基,向胰岛样细胞诱导分化.除正常对照组外,其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建屯糖尿病模型.造模后,胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2× 106个,间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞,模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL.主要观察指标:诱导后胰岛样细胞的鉴定,胰岛样细胞的移植效果.结果:诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长;诱导4 d后细胞向中央聚集,出现胰岛样细胞团,此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多;诱导7d双硫腙染色呈阳性表达.移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低,一直维持至第6周;间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降,但4周后皿糖浓度上升;模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内.免疫组化染色结果显示,移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达,间充质干细胞组仪有表达少量胰岛素,正常对照组胰岛素表达无明显变化.结论:人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞.与脐带间充质干细胞相比,胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平,且植入后可迅速发挥降糖作用.     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景：人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的：观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法：分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论：脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志：CD44（91.4%）,CD29（91.3%）,CD105（99.2%）,不表达CD34（0.2%）,CD45（0.9%）,CD14（0.6%）。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示：长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景:人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的:观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法:分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论:脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志:CD44(91.4%),CD29(91.3%),CD105(99.2%),不表达CD34(0.2%),CD45(0.9%),CD14(0.6%)。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示:长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用*

背景：移植胰岛及胰岛细胞治疗糖尿病已初见成效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而研究受阻。目的：移植将大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为胰岛样细胞,观察其对糖尿病大鼠的治疗作用。方法：将大鼠骨髓间充质干细胞用碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等诱导,免疫细胞染色等检测诱导情况。SD 大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,建模成功后,随机分为对照组移植诱导胰岛样细胞的实验组,实验组经肾包囊移植诱导后的胰岛样细胞,对照组移植相同体积生理盐水,观察移植后糖尿病大鼠血糖和体质量变化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞体外经肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等因子诱导后可以向胰岛样细胞转化。细胞移植后,对照组大鼠血糖无明显变化(P>0.05),实验组大鼠血糖与对照组和移植前相比较,明显降低(P<0.05)。大鼠骨髓间充质干细胞经含肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等的诱导体系可诱导成胰岛样细胞,经诱导的细胞有一定胰岛素分泌能力,将诱导后细胞通过肾包囊途径移植入糖尿病大鼠体内,可降低大鼠血糖水平。     

人脐带间充质干细胞分离和初步鉴定

目的寻找一种高效获得稳定人脐带间充质干细胞的方法。方法采集3例足月剖宫产健康胎儿脐带,剥离血管及外膜得到Wharton’s胶。贴壁培养脐带Wharton’s胶,收集爬出的细胞进行传代,观察细胞形态;取第3代细胞采用流式细胞学检测细胞表面抗原的表达情况;使用成骨、成脂诱导分化的方法对第3代细胞进行分化潜能的鉴定,成骨诱导细胞用茜素红染液染色,成脂诱导细胞用油红O染液染色,并与未诱导分化的细胞进行比较。结果 Wharton’s胶培养10d左右可见梭形细胞从脐带组织逸出,贴壁培养细胞,可见呈放射状或螺旋状生长;流式细胞仪检测结果显示细胞表面抗原CD29、CD44呈高表达,CD34、CD45呈低表达;成脂诱导培养基中细胞油红O染色可见红色脂滴,成骨诱导培养基中细胞茜素红染色可见红色钙质结节,未诱导的细胞未见脂滴及结节样改变。结论贴壁培养的细胞符合间充质干细胞生长的形态,有向成骨、成脂分化的能力;贴壁法培养脐带Wharton胶可得到稳定的间充质干细胞。     

脐带Wharton＇s Jelly中间充质干细胞的生物学特性

背景：脐带Wharton’s Jelly中的间充质干细胞免疫原性低,增殖能力优于骨髓间充质干细胞,受到广泛关注。目的：分离、培养人脐带Wharton’s Jelly中的间充质干细胞,并观测其生物学特性。方法：利用组织块培养法分离培养脐带Wharton’s Jelly中的间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法测定细胞倍增时间,流式细胞仪检测细胞免疫表型。结果与结论：组织块培养第2天时,开始有细胞从组织块爬出;第7天细胞形态开始发生变化,部分细胞呈梭形。传至第3代的细胞形态均一,呈梭形或成纤维形。传至第7代、第10代的细胞形态无明显变化,仍呈梭形。MTT结果示细胞的倍增时间为三四天,传至10代后细胞倍增时间无明显差别。分离培养的脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD14。     

骨髓间充质干细胞的分化潜能及临床应用价值

目的:观察人的骨髓间充质干细胞多分化潜能及在糖尿病治疗领域的价值。方法:实验于2005-07/2006-07在青岛大学医学院附属医院内分泌科完成。骨髓来源于非造血系统疾病的16岁儿童胸骨骨髓血(查体以排除造血系统疾病,结果显示为健康体质),经得家属同意。Percoll淋巴细胞分层液分离骨髓间充质干细胞,取第3代细胞,等密度接种于培养瓶中,经CD44抗体、CD45抗体、CD34抗体鉴定。取其第4代细胞,诱导其向脂肪细胞及神经细胞分化,利用碱性成纤维细胞生长因子预处理先获得巢蛋白阳性细胞,分别用两种方法诱导其向胰岛祖细胞的转化:化学物质诱导和共培养法诱导,免疫荧光检测胰岛祖细胞标志-胰十二指肠同源异型盒基因(蛋白的表达,电化学发光法检测其是否表达胰岛素)。胶原酶消化法获取胰腺间充质干细胞,鉴定,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM使其增殖。将胰腺间充质干细胞接种于底层已接种骨髓间充质干细胞的6孔板共培养,共培养法诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的初步转化。结果:成脂诱导及成神经诱导可获得油红O染色阳性细胞以及巢蛋白阳性细胞。化学法向胰岛祖细胞诱导后可检测到PDX-1免疫反应阳性细胞。共培养法诱导也可获得PDX-1免疫反应阳性细胞。新生儿胰腺具有巢蛋白、CK-19阳性的胰腺间充质干细胞,体外高糖诱导可形成胰岛样细胞团。结论:骨髓间充质干细胞在体外具有诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞及胰岛祖细胞的潜能。新生儿胰腺间充质干细胞向胰岛细胞分化过程中所分泌的一些物质对骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的转化具有促进作用。     

人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果

目的:观察人胎儿胰腺干细体外诱导分化为胰岛样细胞团及治疗大鼠糖尿病的效果。方法:实验于2005-09/2006-09在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。人胰腺干细胞为本实验室冻存的1株传至50代的人胎儿胰腺干细胞。采用DMEM/F12培养液,添加B27、1g/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1g/L牛血清白蛋白、10mmol/L烟酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子及10μg/L肝细胞生长因子,诱导胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团,应用双硫腙染色、RT-PCR及葡萄糖刺激试验对该胰岛样细胞团进行鉴定。采用完全随机法将30只SD大鼠分为链脲菌素注射组24只,正常对照组6只。空腹12h后,两组大鼠分别腹腔注射70mg/kg体质量的链脲菌素和0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠分别于注射前、注射后48h、第5天和第8天空腹断尾采血,测定全血血糖浓度。选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法从已成模的糖尿病大鼠中挑出18只分为3组:胰岛移植组9只,进行肾被膜下胰岛样细胞团移植,每只大鼠植入胰岛数(3000±100)个;干细胞移植组3只,肾被膜下移植未进行诱导的胰腺干细胞,细胞数约2×106个;糖尿病对照组6只,肾被膜下移植不含细胞的培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度,每周定点测空腹血糖及称体质量1次。结果:18只符合糖尿病模型标准的大鼠与正常对照组6只大鼠均进入结果分析。①成功将人胎儿胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,RT-PCR检测表达胰岛素,经葡萄糖刺激能释放胰岛素。②共有22只大鼠糖尿病成模,成模率达91.7%。③胰岛移植组大鼠移植后2周内,血糖浓度均有所降低,但仍高于正常血糖浓度范围;移植后第3周血糖浓度迅速上升,之后一直维持高血糖状态。干细胞移植组大鼠移植后血糖一直处于较高水平,移植后第6周血糖开始下降,之后维持于较低水平。糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。结论:人胎儿胰腺干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞团,该胰岛团能分泌胰岛素,具有一定的抗大鼠糖尿病作用。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用.关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道.目的:进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性.方法:采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养:传2代后,用高浓度葡萄糖(2s mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化.倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素.结果与结论:第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团:并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团:免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性.结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能.     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord Wharton s jelly-derived mesenchymal stem cells,HuMSCs)向胰岛素分泌细胞分化的潜能,为胰岛细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病提供新的细胞来源。方法体外分离培养HuMSCs,在胰岛细胞培养条件下经药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇和高糖)定向诱导其分化;倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态;免疫组化、RT-PCR对诱导细胞进行胰岛β细胞标记鉴定;双硫腙染色鉴定锌离子表达;放射免疫法检测胰岛素含量。结果诱导后HuMSCs由长梭形逐渐变为多角形、类圆形,部分聚集成团;免疫细胞化学染色显示,HuMSCs经诱导后表达人胰岛素和胰高血糖素抗原;RT-PCR检测显示诱导后HuMSCs表达了人胰岛素基因和PDX-1基因;双硫腙染色呈棕红色。结论HuMSCs在体外胰岛细胞培养条件诱导下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这种细胞可能为Ⅰ型糖尿病提供一条新的治疗途径。     

骨髓间充质干细胞移植后2型糖尿病鼠血糖及肾脏病变的改善

背景:胰岛细胞移植可改善胰岛功能,但其来源匮乏.骨髓间充质干细胞可被诱导分化成胰岛细胞,在糖尿病足、糖尿病心肌病、糖尿病神经病变中具有较强的组织修复能力.目的:观察骨髓间充质干细胞移植后存2型糖尿病模型鼠胰腺、肾脏组织中的存活及转归,及对血糖及肾脏病变的改善.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-02/07在山西医科大学生物化学与分子生物学教研室完成.材料:雄性Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供,造模使用的链脲佐菌素为Sigma公司产品.方法:取1只大鼠体外分离培养骨髓间充质干细胞,反复贴璧纯化,传至第3代行BrdU标记后用于移植.60只大鼠随机分为3组,模犁对照组、细胞移植组向标准混合饲料中添加含体积分数为0.1的猪油和蛋黄高脂成分.喂养2个月后向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,血糖≥16.77mmol/L且维持3d稳定代表成功建立2型糖尿病模型.正常组采用标准混合饲料喂养2个月后,向大鼠腹腔内注射等容积柠檬酸缓冲液.造模成功后,细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL(细胞数1×1 06个),其余两组注射等最PBS液.主要观察指标:各组大鼠血糖浓度及三酰甘油、胰岛素水平的变化,肾组织病理学变化.细胞在肾脏及胰腺组织中的分布.结果:与移植前比较,移植后7,14,21 d模型对照组血糖浓度无明显变化,细胞移植组血糖浓度明显F降(P＜0.001);移植后21 d与正常组比较,模犁对照组及细胞移植组三酰甘油水平均显著升高(P＜0.001),胰岛素水平均显著降低(P＜0.001),但细胞移植组胰岛索降低幅度小于模型对照组(P＜0.001).糖原染色结果示模型对照组肾小球发生肥大,细胞移植组肾小球基质变薄,肥大得以改善.胰岛素免疫荧光染色后,模型对照组胰岛细胞明显减少,而细胞移植组胰岛细胞增加,在胰腺、肾脏组织中均可见BrdU标记的阳性细胞.结论:经尾静脉注射骨髓间充质干细胞可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及肾脏,并对其进行组织修复,同时可降低血糖,增加胰岛素分泌.     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞实验研究

目的 探索人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)在胰岛细胞微环境中向胰岛样细胞的分化潜能及功能变化趋势.方法 将分离的第3代hUC-MSCs用低糖达尔伯克必需基本培养基(L-DMEM)重悬,接种单纯培养组及与大鼠胰岛细胞共培养组(共培养组).倒置显微镜观察hUC-MSCs的形态变化;流式细胞仪鉴定其细胞表面标志;免疫细胞化学鉴定胰十二指肠同源框-1基因(PDX-1)的表达;放免法检测hUC-MSCs胰岛素和C肽的分泌及对糖刺激的反应.结果 hUC-MSCs呈均一纺锤形平行排列或漩涡状排列生长,不表达CD34、CD45和CD14,高表达CD29、CD44和CD105;共培养组诱导后3 d及7 d经细胞逐渐变圆并聚集成团,PDX-1呈阳性表达,至10 d及14 d PDX-1阳性细胞罕见.单纯培养组细胞形态未发生变化,PDX-1表达阴性.共培养组培养上清中检测到较高水平的胰岛素及C肽,单纯培养组检测到少量的胰岛素,检测不到C肽,两组培养3、7、10和14 d的胰岛素分泌水平比较差异均有统计学意义(P<0.01).共培养组胰岛素及C肽水平以7 d最高,10 d次之,与3 d和14 d比较差异均有统计学意义(P<0.01),共培养组糖刺激指数为1.41.结论 hUC-MSCs在胰岛细胞微环境中具有向胰岛样细胞分化的潜能,其内分泌功能随体外诱导时间的延长呈现先递增后递减的趋势.     

骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病*

背景：药物是目前糖尿病治疗最主要的方法,但病情的进展以及相关并发症的发生使药物的作用受到挑战。目的：探讨骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病的应用效果以及可行性。方法：分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养,建立糖尿病模型,对糖尿病模型大鼠分别注射骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胰岛细胞共培养混合物以及生理盐水或磷酸盐缓冲液作为对照。通过观察监测各糖尿病模型大鼠血糖水平的变化、胰岛素分泌情况以及胰腺组织的病理学变化评估移植治疗效果。结果与结论：骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病模型大鼠,移植后C-肽值明显升高,血糖水平明显下降,但仍未降至正常范围内,且随着时间的延长,血糖水平再次升高。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病模型大鼠,血糖水平亦明显下降,且下降程度大于单纯骨髓间充质干细胞移植治疗,可下降至正常水平,并在一定时间内能够维持。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病具有一定的效果,具有应用的可行性。     

骨髓间充质干细胞胰腺内移植治疗糖尿病：是否发生了细胞的“转分化”？

背景：近年来大量研究认为骨髓间充质干细胞植入后可以改善糖尿病鼠的高血糖状态,但相关的机制尚不明确且存在一些争议。目的：探讨骨髓间充质干细胞移植到糖尿病大鼠胰腺后的作用机制。方法：将增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞移植到糖尿病大鼠胰腺包膜下,血糖仪监测血糖,RT-PCR动态检测受体鼠胰腺组织增强型绿色荧光蛋白阳性细胞中关键转录因子的表达,免疫荧光染色观察胰腺组织中增强型绿色荧光蛋白和胰岛素共表达情况,流式细胞术分析增强型绿色荧光蛋白阳性胰腺组织细胞的细胞周期和DNA倍性。结果与结论：胰腺包膜下移植骨髓间充质干细胞能有效降低糖尿病鼠血糖;Nestin、Nkx 2.2的表达分别在移植后1,3周到达峰值,Pax 4和Ngn 3的表达在移植后4周到达峰值,胰岛素和胰高血糖素的表达至移植后12周到达峰值,PDX-1的表达在8周时达到峰值并维持至12周;免疫荧光染色发现有增强型绿色荧光蛋白和胰岛素共表达细胞;流式细胞术测定增强型绿色荧光蛋白阳性的胰腺组织细胞中处于S＋G2/M期的细胞增加,细胞核型未见多倍体或非整倍体细胞。提示在胰腺微环境中,植入糖尿病鼠胰腺局部的骨髓间充质干细胞在基因调控下向胰岛β样细胞发生横向转分化,而非细胞融合获得β细胞的功能表型。     

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。 目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。 设计：随机对照观察。 单位：中日友好医院临床医学研究所。 材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。 方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。 主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。 结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。 结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。     

体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化

背景:体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案.目的:探讨胎儿骨髓间充质干细胞在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性.方法:将胎儿骨髓间充质干细胞与胎儿胰岛素细胞分别接种于Transwell 双层细胞培养板上下层共培养.对照组中的骨髓间充质干细胞仅用胰岛细胞培养基培养.倒置相差显微镜观察胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰岛细胞的形态,放射免疫分析法检测共培养刺激下胰岛素的分泌情况.结果与结论:未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的骨髓间充质干细胞逐渐变圆,并聚集成团,共培养9 d后骨髓间充质干细胞经RAI检测分泌大量胰岛素,DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性.而对照组无胰岛素释放.提示在适当的培养条件下,胎儿骨髓间充质干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的能力.     

体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化

背景：体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案。目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性。方法：将胎儿骨髓间充质干细胞与胎儿胰岛素细胞分别接种于Transwell双层细胞培养板上下层共培养。对照组中的骨髓间充质干细胞仅用胰岛细胞培养基培养。倒置相差显微镜观察胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰岛细胞的形态,放射免疫分析法检测共培养刺激下胰岛素的分泌情况。结果与结论：未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的骨髓间充质干细胞逐渐变圆,并聚集成团,共培养9d后骨髓间充质干细胞经RAI检测分泌大量胰岛素,DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性。而对照组无胰岛素释放。提示在适当的培养条件下,胎儿骨髓间充质干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。     

人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养可分化为肝样细胞

背景：文献报道,从骨髓与脐带中分离获得的间充质干细胞可在体外连续传代培养,仍保持干细胞的特性,并在多种细胞因子的＂鸡尾酒式＂诱导下分化为肝细胞样细胞。目的：进一步验证人脐带间充质干细胞在体外正常人肝细胞共培养体系下是否可分化为肝细胞并探讨其分化方法。方法：采用贴壁法,从脐带中分离培养间充质干细胞,流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志。人肝细胞LO2细胞与人脐带间充质干细胞建立共培养体系,不添加外源诱导因子,分别于第7,14,21天,通过RT-PCR法检测肝细胞特异标志物甲胎蛋白、白蛋白、人细胞角蛋白19mRNA的表达,糖原染色进行功能鉴定。结果与结论：从人脐带中可分离得到贴壁生长的间充质干细胞,其中CD29＋细胞比例为96.02%,CD105＋细胞比例为96.6%,CD34-细胞比例为99.65%,CD105＋CD29＋双阳性细胞比例为94.84%。与LO2细胞共培养后第7天仅有甲胎蛋白阳性表达;第14天表达白蛋白、人细胞角蛋白19,第21天时,LO2与人脐带间充质干细胞共培养组未出现甲胎蛋白表达;人细胞角蛋白19和白蛋白的表达比第14天略有增强。共培养21d后,糖原染色呈阳性。结果证实,无需额外添加外源诱导因子,脐带间充质干细胞可在人正常肝细胞共培养的微环境中,向正常肝细胞分化。