不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖的影响

目的探讨不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法使用0（对照）、10、25、50滋g/L的雷帕霉素（RAPA）预处理人胶质瘤细胞（U87细胞）0.5h;再加入200滋mol/L替莫唑胺作用24h,收集U87细胞。采用流式细胞术检测自噬标志物微管相关轻链蛋白3（LC3）-Ⅱ表达量,RT-PCR法检测自噬相关基因Beclin-1mRNA相对表达量,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果对照组、10滋g/L组、25滋g/L组和50滋g/L组U87细胞LC3-Ⅱ表达量、Beclin-1mRNA相对表达量及细胞增殖抑制率比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;经两两比较发现,随着RAPA浓度的增加,LC3-Ⅱ表达量及Beclin-1mRNA相对表达量均逐渐升高（均P＜0.05）,而细胞增殖抑制率先下降后逐步升高（均P＜0.05）。结论不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖产生不同的影响,随着自噬水平的提高,替莫唑胺对神经胶质瘤细胞的增殖抑制率先下降后逐渐升高。     

脂肪乳剂复苏布比卡因导致的心脏停搏的机制探讨

目的：探讨脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性可能的作用机制。方法：SD雄性大鼠72只,随机分成六组：A组（布比卡因致心脏停搏脂肪乳剂复苏组）、B组（布比卡因致心脏停搏K-H液灌注组）、C组（布比卡因致心脏停搏组）、D组（平衡灌注25min组）、E组（含脂肪乳剂的K-H液灌注组）、F组（K-H液灌注组）,每组12只。记录灌注期间的心率-左心室发展压乘积（RPP）,测定停灌时各组心肌组织腺苷酸含量和布比卡因浓度。结果：A组复跳例数、早期复跳例数均显著多于B组（P〈0.01）。A组复跳时间显著短于B组（P〈0.05）。复跳后40min内,A组的RPP均显著高于B组（P〈0.01）。A组的EC值显著低于B组（P〈0.05）。心肌组织中的布比卡因浓度从高到低依次为C组〉B组〉A组（P〈0.01）。结论：脂肪乳剂降低心肌组织布比卡因浓度,是其逆转布比卡因心脏毒性的主要作用机制。     

右美托咪定对脂肪乳剂逆转布比卡因所致大鼠离体心脏停搏的影响

目的研究右美托咪定对脂肪乳剂复苏布比卡因所致离体心脏停搏效果的影响。方法30只雄性SD大鼠随机分为右美托咪定组（Dex组）和对照组,每组15只,建立Langendorff离体心脏灌流模型,采用100滋mol/L布比卡因灌流建立心脏停搏模型。Dex组灌流含有50ng/ml右美托咪定和2%脂肪乳剂的K-H液,对照组灌流含有2%脂肪乳剂的K-H液。记录离体心脏首个心搏时间（Te）、复跳时间（Tr）以及复跳后40min内心率、左心室发展压（LvdevP）以及心率左心室发展压乘积（RPP）,同时测定各时间点心室肌布比卡因浓度。结果Dex组的Te和Tr均较对照组长（均P＜0.05）。Dex组心率、LvdevP和RPP在复跳后1min（T1）、3min（T3）和5min（T5）均低于对照组（均P＜0.05）。复跳后T1、T3和T5时间点,Dex组心肌布比卡因浓度均高于对照组（均P＜0.05）。结论右美托咪定可以延长脂肪乳剂逆转布比卡因所致离体心脏停搏的时间,这可能与右美托咪定减慢离体心肌布比卡因排出有关。     

布比卡因介导PI3K/AKT/mTOR通路诱导结肠癌SW480细胞自噬和凋亡及抑制裸鼠移植瘤的形成

【摘要】目的 探究布比卡因介导PI3K/AKT/mTOR通路诱导结肠癌SW480细胞自噬和凋亡的机制及其对裸鼠移植瘤形成的抑制作用。方法 结肠癌SW480细胞分为对照组、布比卡因组（025、05、1 mM）。各组细胞处理24h后采用Edu染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测增殖、凋亡、自噬及信号通路相关蛋白表达。建立结肠癌裸鼠模型,随机分为布比卡因组（5、10、20 mg）及对照组,分别腹腔注射5、10、20 mg/kg的布比卡因及等体积生理盐水,1次/d,连续治疗30d后处死小鼠,取瘤、称重,免疫组化检测肿瘤组织Ki67蛋白阳性表达,并绘制各组裸鼠生存曲线。〖HT结果 随着布比卡因浓度增加,SW480细胞增殖数及增殖相关蛋白Ki67、PCNA表达量逐渐降低（F=94068、160905、49255,P＜005）,且均低于对照组（P＜005）;SW480细胞凋亡数及凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9表达量逐渐升高（F=30948、110730、233550,P＜005）,且均高于对照组（P＜005）。随着布比卡因浓度增加,SW480细胞Beclin1、ATG8蛋白相对表达量,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及LC3阳性数均逐渐升高（F=65287、112337、50602、26690,P＜005）,且高于对照组（P＜005）;p62蛋白相对表达量及p PI3K/PI3K、p AKT/AKT、p mTOR/mTOR比值逐渐降低（F=33276、98246、102488、58051,P＜005）,且均低于对照组（P＜005）。给药30d后,布比卡因给药组裸鼠肿瘤质量、Ki67阳性细胞占比及30d生存率均低于对照组（P＜005）。结论 布比卡因可抑制结肠癌SW480细胞增殖,诱导其发生自噬及凋亡,并抑制裸鼠移植瘤的形成,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR通路有关。     

脂肪乳剂对布比卡因心脏抑制犬血压、心率和心电图的影响

目的：探讨30％脂肪乳剂对布比卡因心脏抑制犬模型的血流动力学和心电图的影响。方法：14只杂种犬随机分为实验组和对照组。犬静咏输入布比卡因,使平均动脉压（MAP）降至基础值的60％,布比卡因心脏抑制的中毒模型造模成功。实验组静脉注射30％脂肪乳剂负荷量3mL／kg,然后10min匀速输入3nL／kg脂肪乳剂。对照组以同样速度和容量输入生理盐水。观察两组犬血压、心率和心电图PR间期、QRS间期、QT间期变化。结果：实验组的血压、心率和心电图PR间期、QRS间期、QT间期较对照组恢复快（P＜0．05）。结论：脂肪乳剂具有改善布比卡因心脏中毒时血流动力学及心肌电生理的作用。     

金丝桃素介导的光动力学疗法对K562细胞活性与自噬的影响

目的：观察金丝桃素介导的光动力学疗法（Hyp-PDT）对慢性髓性白血病细胞（K562细胞株）活性与自噬的影响。方法：体外培养K562细胞株经过含金丝桃素（0.4 μg/mL）的培养液避光孵育后，采用0.3 mW/cm2光强度及照射4 min实施Hyp-PDT，CCK-8法测定细胞活性。收集照射前，照射后4、8、16 h的细胞悬液，分别在光镜和电镜下观察细胞形态学及自噬体数量，Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、p-Akt、Akt的表达水平。结果：金丝桃素组光照后细胞活性随时间延长逐渐降低，与光照前比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），且与正常细胞组、DMSO细胞组比，所有时间点的细胞活性均显著降低（均P＜0.01）。Hyp-PDT干预后，金丝桃素组光照后部分细胞出现细胞肿胀变性甚至溶解破裂。透射电镜显示K562细胞照射前即存在自噬体，照射后8 h DMSO组中的自噬体数量开始增多，但金丝桃素组的自噬体数量明显减少。Western blot结果显示：照射后8 h和16 h时金丝桃素组LC3蛋白表达量减少，而DMSO组LC3蛋白含量呈上升趋势；照射后16 h，与DMSO组比，金丝桃素组的Beclin-1蛋白含量明显下降，p-Akt蛋白表达量明显减少（均P＜0.01）。结论：Hyp-PDT可能通过抑制p-Akt磷酸化，影响PI3K-Akt通路，减少K562自噬，促进细胞死亡，起到杀伤白血病肿瘤细胞的作用。     

肾上腺素对脂肪乳剂复苏布比卡因所致离体心脏停搏效果的影响

目的探讨肾上腺素对脂肪乳剂复苏布比卡因所致离体心脏停搏效果的影响。方法24只雄性SD大鼠按随机数字表法分为实验组和对照组,每组12只,制作Langendorff离体心脏灌流模型,以100滋mol/L布比卡因诱导心脏停搏后继续灌注3min,对照组采用含有2%脂肪乳剂和100滋mol/L布比卡因的灌流液,实验组采用含有0.15滋g/ml肾上腺素和2%脂肪乳剂以及100滋mol/L布比卡因的灌流液。记录离体心脏首个心搏时间（Te）、复跳时间（Tr）以及复跳后1（T1）、5（T2）、10（T3）、20（T4）、30（T5）和40min（T6）的心率（HR）、左室发展压（LvdevP）以及心率左室发展压乘积（RPP）,并进行组间比较。结果实验组的Te和Tr均短于对照组（均P＜0.05）。实验组HR、LvdevP和RPP在复跳后T1~T2高于对照组（均P＜0.05）。复跳后T3~T6,两组间心功能差异均无统计学（均P＞0.05）。结论肾上腺素可以缩短脂肪乳剂解救临床浓度布比卡因所致离体心脏停搏复苏时间,并且可以增强复跳后初期（复跳后5min内）离体心脏心功能,但是对复跳后期心功能无明显作用。     

脂肪乳剂救治布比卡因所致心脏骤停时肾上腺素合理使用时机探讨

目的探讨脂肪乳剂救治布比卡因所致心脏骤停时肾上腺素合理使用时机,并观察大鼠复苏效果。方法将20只雄性SD大鼠随机分为推注脂肪乳剂后给予肾上腺素组（ALE组）、推注脂肪乳剂后延迟1min给予肾上腺素组（DLE组）,每组10只。大鼠股静脉推注布比卡因15mg/kg,心脏停搏后1min推注脂肪乳剂负荷量（5ml/kg）,随后以1ml/（kg·min）速度持续输注5min。同时ALE组于心脏停搏后75s注射肾上腺素10滋g/kg,135s注射0.9%氯化钠注射液0.1ml,DLE组在75s注射0.9%氯化钠注射液0.1ml,135s注射肾上腺素10滋g/kg。如若自主循环未恢复则在4min后追加肾上腺素5滋g/kg,随后每隔2min追加肾上腺素5滋g/kg,直至自主循环恢复或者20min复苏期末。记录两组大鼠血流动力学指标及20min复苏末血气值、复苏率、存活率、肺湿干比、肺泡损伤率和布比卡因浓度等并作比较。结果ALE组和DLE组存活率分别为100%和40%,差异有统计学意义（P＜0.01）。复苏后ALE组SBP和RPP均高于DLE组（P＜0.01）。ALE组心脏停搏后2min和20min的pH较DLE组高（P＜0.05）。两组大鼠肺湿干比和肺泡损伤率差异均有统计学意义（均P＜0.05）。心肌组织布比卡因浓度ALE组显著低于DLE组（P＜0.05）。结论在布比卡因导致的心脏停搏模型中,注射脂肪乳剂后延迟注射肾上腺素不利于心脏早期复跳,降低复苏成功率。     

丁酸通过诱导自噬抑制宫颈癌细胞增殖的研究

目的探讨短链脂肪酸丁酸对宫颈癌细胞增殖的影响及作用机制。方法体外培养人宫颈癌Hela细胞系,5mmol/L丁酸处理细胞48h后,采用MTT实验检测细胞增殖能力;电镜下观察细胞自噬体形成;采用mRFP-GFP-LC3双荧光染色检测细胞自噬流;分别采用Westernblot法、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测自噬相关微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62蛋白和mRNA的表达;采用流式细胞术检测线粒体活性氧水平。结果MTT实验结果表明丁酸显著抑制宫颈癌细胞的增殖。电镜下观察到丁酸处理后的宫颈癌细胞中形成大量的双层膜结构自噬体,其中可见线粒体等细胞器。mRFP-GFP-LC3双荧光实验结果显示丁酸处理的细胞绿色荧光减少,红色荧光增强,表明丁酸增高自噬流水平。Westernblot分析发现LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化随丁酸处理时间增加而增多,p62的表达则随丁酸处理时间增加而减少。RT-qPCR分析也在基因层面验证了丁酸上调LC3、下调p62基因表达。使用3-甲基腺嘌呤则会显著抑制丁酸诱导的LC3-Ⅱ活化。流式细胞术检测发现丁酸促进了线粒体内活性氧的积累。结论短链脂肪酸丁酸通过自噬抑制宫颈癌细胞的增殖,线粒体ROS可能是重要的触发机制。     

基于细胞自噬探讨气虚血瘀型肝纤维化大鼠的分子机制

摘要 目的 探讨气虚血瘀肝纤维化大鼠细胞自噬基因LC3II和p62的mRNA、蛋白表达水平及扶正化瘀胶囊的干预效果。方法40只SD大鼠根据随机数字表法分正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组、扶正化瘀治疗组,处死后予以天狼星红染色,并分别测定肝重、肝湿重。采用qPCR、Western blot测定LC3II、p62 mRNA和蛋白的表达水平。结果 治疗组体重(375.80±24.36)及肝湿重(11.31±1.13),分别高于气虚血瘀肝纤维化组(356.10±20.45; 10.34±1.13,p＜0.05）;天狼星红染色提示,气虚血瘀肝纤维化组肝纤维最重,治疗后显著改善;Ishak评分在气虚血瘀肝纤维化组（20.001.60）最高,扶正化瘀治疗组（12.90±1.90）显著下降（p＜0.05）。LC3II mRNA（1.44± 0.01）及蛋白（3.01± 0.57）表达在气虚血瘀肝纤维化组最高,治疗组LC3II mRNA（1.20±0.01）、及蛋白(1.12± 0.01）均显著下降（p＜0.05）;而P62 mRNA（0.95±0.05）及蛋白（0.19±0.12）在气虚血瘀肝纤维化组最低,扶正化瘀治疗组P62 mRNA（2.04±0.30）及蛋白（0.67±0.32）显著升高（p＜0.05）。结论 气虚血瘀型肝纤维化大鼠较单纯肝纤维化大鼠LC3II表达明显增加,而自噬底物p62消耗明显,并与纤维化严重程度呈正相关,且通过扶正化瘀胶囊干预可以显著抑制LC3II/ p62通路。     

PARP-1介导的自噬流受阻在大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨PARP-1介导的自噬流受阻在大鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中的作用。方法采用大鼠心肌细胞H9c2制备 缺血再灌注细胞模型。实验分为对照组、缺氧/复氧处理模型组、PARP-1抑制剂组、PARP-1抑制剂+模型组（PJ34+H/R组）。取 各组处理后的6孔板H9c2细胞提取总蛋白后Western blot分别检测PARP-1活性蛋白pADPr,凋亡相关蛋白Bax,细胞DNA损 伤标记蛋白p-γH2ax的表达,细胞自噬流相关蛋白：LC3BII/LC3I、Beclin-1、P62的表达量。通过GraphPad Prism 6 统计软件对 数据进行分析,比较各组间差异。结果与对照组比较,MIRI模型组PARP-1活性标记物pADPr表达更高表示PARP-1激活增 多,细胞凋亡损伤增加,DNA损伤（p-γH2ax）也增多（P<0.05）。LC3B II、beclin-1表达增高,同时p62表达也增高（P<0.05）,表示自 噬流受阻。与模型组比较,加入PARP-1抑制剂后（H/R+PJ34组）可明显抑制心肌细胞内PARP-1活性（pADPr）,细胞凋亡减少, 细胞DNA损伤也减轻（P<0.05）;自噬相关蛋白LC3B II、beclin-1表达无明显变化,而p62表达降低（P<0.05）,表明自噬流受阻情 况得到缓解（P<0.05）。结论PARP-1激活介导的自噬流受阻在大鼠MIRI中发挥着作用,通过抑制PARP-1活性后可明显逆转 自噬流受阻情况,减轻MIRI。     

异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响

目的：探讨吸入麻醉药异氟醚对β淀粉样蛋白（Aβ）25-35诱导的大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将PC12细胞随机分为正常对照组（C组）、10   μmol•L-1Aβ25-35 处理组（Aβ组）、2%异氟醚处理组（Iso组）和2%异氟醚与10   μmol•L-1Aβ25-35联合处理组（Iso+Aβ组）。各组PC12细胞药物处理6 h后应用透射电镜观察自噬体,Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和自噬信号调控基因p-mTOR、Beclin-1表达;药物处理24 h后应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达。结果：与C组比较,Aβ组PC12细胞中可见大量的自噬体,LC3-Ⅱ、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,p62、p-mTOR和Bcl-2表达量降低（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;Iso组PCI2细胞未见自噬体,LC3-Ⅱ
表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;与Aβ组比较,Iso+Aβ组PC12细胞仅见少量自噬体,LC3-Ⅱ表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）,Bcl-2表达无明显变化（P>0.05）。结论：异氟醚能够抑制Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬的活化,促进凋亡蛋白的表达,其作用机制与激活自噬信号调控基因mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

丝胶蛋白通过自噬通路调控人胃癌MKN45细胞的增殖

目的探索丝胶蛋白对胃癌MKN45细胞增殖活性的影响及作用机制。方法用LC3双荧光自噬病毒转染胃癌MKN45细 胞,用嘌呤霉素筛选LC3双荧光自噬病毒的MKN45稳转株。实验分为3组,空白对照组（Blank）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）、丝 胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA）。培育48 h后用cck-8试剂测定细胞增殖活性,根据所测数据得出丝胶蛋白半数致死浓 度IC50,按此浓度处理细胞并培育48h,用流式细胞仪分别检测凋亡、周期,电镜检测细胞自噬,Western blotting检测LC3、p62、 Beclin蛋白表达。将种植胃癌的裸鼠分为2组,即对照组（Saline）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）,每组5只;分别注射生理盐水和丝 胶蛋白,测量肿瘤体积和质量。结果丝胶蛋白阳性组（Sericin）与空白对照组（Blank）相比,MKN45细胞增殖活性明显受到抑 制,且细胞凋亡增加（P<0.01）,细胞阻滞于G2/M期（P<0.01）。相对于空白组,丝胶蛋白处理后细胞在电镜观察到自噬小体明显 增多;Western blotting检测到LC3-2 表达上调,Beclin表达增加,p62表达逐渐下调;丝胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA） 实验结果则介于两者之间。动物实验中,丝胶蛋白阳性组（Sericin）与对照组（Saline）相比,肿瘤体积和质量有显著下降。结论 丝胶蛋白可通过调控胃癌MKN45细胞自噬影响细胞增殖活性。     

末端结合蛋白1 (EB1)在宫颈组织中的表达及其对自噬标志蛋白表达的影响

 目的  探讨末端结合蛋白1 (end binding protein 1,EB1)在宫颈组织中的表达及其对自噬标志蛋白LC3和p62/SQSTM1蛋白表达的影响。方法  免疫组织化学检测EB1在宫颈癌、宫颈息肉和慢性宫颈炎组织中的表达;siRNA干扰方法抑制EB1基因表达,并采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测此时宫颈癌Siha细胞自噬标志蛋白LC3和p62/SQSTM1基因的表达。结果  EB1的表达部位主要集中在细胞核外周的胞质中。EB1在宫颈癌和宫颈息肉中的阳性表达率显著低于宫颈慢性炎性组织(P<0.05),但在阳性表达的宫颈癌组织中,绝大多数间质细胞表现为阴性;EB1在中、低分化宫颈鳞癌组织中的阳性表达率显著低于高分化宫颈鳞癌组织(P<0.05)。当EB1基因表达在宫颈癌Siha细胞中的表达被抑制时,无论是在mRNA还是在蛋白水平,自噬标志蛋白p62/SQSTM1和LC3的表达均显著增加(P<0.05)。结论  EB1在自噬发生较低的宫颈癌组织中阳性表达率低于自噬发生较高的宫颈慢性炎性组织;抑制EB1在宫颈癌Siha细胞中的表达,则自噬标志蛋白p62/SQSTM1和LC3表达改变,这一发现充分证明EB1在宫颈癌的自噬过程中发挥着一定的生物学效应。     

舒尼替尼通过抑制 Akt／mTOR 信号通路诱导肾癌细胞自噬

目的：研究舒尼替尼引起的肾癌细胞出现细胞自噬的机制。方法：以肾癌细胞系ACHN细胞为细胞模型,利用3-(4,5-二甲基)-5-(3-羧甲基苯环)-2-(4-硫基苯)-2H 四唑盐复合物［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt,MTS］检测法观察舒尼替尼对ACHN 细胞活性的影响;应用RNA干扰技术敲降自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白1轻链3融合蛋白（microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion protein, LC3）检测自噬与舒尼替尼引起的细胞凋亡。使用电子显微镜和荧光显微镜观察在舒尼替尼作用下自噬体的形成;蛋白质免疫印迹检测舒尼替尼对LC3-Ⅱ的积累,自噬相关信号通路蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、哺乳动物雷帕霉素受体( mammalian target of rapamycin, mTOR) 及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶( poly ADP-ribose polymerase,PARP) 切割的变化和过量表达,以及敲降Akt检测诱导自噬的变化。结果: 舒尼替尼能显著抑制ACHN的细胞活性,这种作用具有时间和浓度依赖性;敲降自噬相关蛋白Beclin1和LC3减少自噬可改变舒尼替尼引起PARP的切割;透射和荧光显微镜观察结果表明,舒尼替尼引起细胞自噬体明显增加;蛋白质免疫印迹结果显示舒尼替尼增加自噬同时减少了Akt/mTOR的磷酸化。过量表达持续活化的Akt抑制了该化合物引起的自噬,而敲降Akt可促进自噬发生。mTOR抑制剂雷帕霉素能上调舒尼替尼引起的自噬并促进细胞活性的丢失。结论：舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR信号通路促进肾癌细胞ACHN的自噬,其诱导的自噬与凋亡有关。     

抑制Aurora激酶B的表达可促进骨肉瘤143B细胞凋亡

目的 探讨抑制Aurora激酶B（AURKB）诱导骨肉瘤143B细胞自噬对凋亡的影响及其潜在的分子机制。方法 构建慢病毒载体（干扰慢病毒Lv/shAURKB和相应的空载慢病毒Lv/shScrambled）,分别感染人源骨肉瘤细胞系143B细胞,并采用氯喹（CQ）进行干预24 h,分别作为：AURKB慢病毒干扰组（plv/shAURKB组）;阴性对照组（plv/NC组）;plv/shAURKB+CQ组;空载慢病毒+氯喹处理组（plv/NC+CQ组）。RT-qPCR检测Lv/shAURKB慢病毒载体对AURKB mRNA的干扰效率。Western blot检测AURKB、P62、LC3、Cleaved-Caspase3、Bcl2、P-ULK1（Ser555）等蛋白表达水平。采用透射电镜和LC3双标荧光法示踪143B细胞内自噬小体并检测自噬水平,流式细胞术和Tunel实验检测细胞凋亡。免疫共沉淀检测AURKB蛋白与ULK1（UNC-51样激酶1）蛋白间的相互作用关系。结果 plv/shAURKB组细胞中AURKB mRNA及蛋白表达水平均低于plv/NC组,差异有统计学意义（P<0.05）;plv/shAURKB组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的比率和自噬小体数量高于plv/NC组,而P62的表达低于plv/NC组,差异均有统计学意义（P<0.05）;plv/shAURKB组细胞中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3显著高于plv/NC组（P<0.05）,而抑制凋亡蛋白Bcl2的表达水平显著低于plv/NC组（P<0.05）;与plv/shAURKB组相比plv/shAURKB+CQ组中凋亡相关蛋白 Cleaved-caspase3和Bcl2的表达得到明显回复（P<0.05）。Tunel实验和流式细胞术结果显示,plv/shAURKB组细胞凋亡率显著高于plv/NC组（P<0.05）,plv/shAURKB+CQ组细胞凋亡率与plv /shAURKB组相比得到明显的回复（P<0.05）。plv/shAURKB组细胞中自噬启动蛋白ULK1Ser555磷酸化水平显著高于plv/NC组（P<0.05）。免疫共沉淀检测显示：免疫沉淀AURKB的同时ULK1也发生了沉淀。结论 沉默AURKB能够通过激活ULK1Ser555磷酸化诱导细胞自噬促进骨肉瘤143B细胞凋亡。     

基于“STAT3/miR-17”反馈环探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用机制

目的探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及对线粒体自噬的影响。方法采用生物信息学方法挖掘脑梗死差异表达miRNAs,并预测活血荣络方可能通过调节"STAT3-miR-17"反馈环路发挥作用。将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方组,运用线栓法建立脑缺血再灌注模型。造模前36、12 h及术后12 h给药。术后24 h行神经功能评分,并行TTC染色评估脑梗死体积;透射电镜观察自噬小体;Western blot检测线粒体及自噬相关蛋白,评估线粒体自噬情况;Real-time PCR检测"STAT3-miR-17"反馈环中miRNA、mRNA的表达。结果与模型组相比,活血荣络方可明显改善模型大鼠神经功能损伤,减少脑梗死体积(P<0.01),下调p62、TOMM20的表达(P<0.05),上调LC3B的表达(P<0.01),增加损伤侧脑组织自噬小体;下调miR-17 miRNA的表达(P<0.01),上调STAT3 mRNA的表达(P<0.01)。结论活血荣络方可通过上调线粒体自噬发挥神经保护作用,其机制可能与调控"STAT3-miR-17"反馈环路相关。     

脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

目的：探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法：72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（分别再灌0、6、12、24、36 h）,每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果：与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加（均P＜0.05）;随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调（P＜0.05）;PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调（P＜0.05）。结论：脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。     

p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞成脂的促进作用

目的：探讨p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）自噬活性的影响,阐明脂肪分化的分子机制。方法：应用Ⅰ型胶原酶消化法从人大腿皮下脂肪抽吸液中分离培养hADSCs,使用80 μmol·L^-1油酸（OA）联合地塞米松和胰岛素对hADSCs进行成脂诱导;将hADSCs分为对照组和p62基因缺失组,p62基因缺失组hADSCs转染p62 shRNA慢病毒载体,对照组hADSCs转染hADSCs空载体。采用CCK-8实验绘制2组细胞的生长曲线并观察细胞增殖活性变化;应用尼罗红染色观察脂滴的形成（尼罗红脂滴染色阳性细胞数）,Western blotting法检测成脂标志转录因子C/EBPα和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ型（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）蛋白表达,磺酰成二胺（MDC）染色检测2组细胞成脂中的自噬活性（MDC染色阳性细胞数）,采用LC3与Mitotracker Red荧光共定位检测2组细胞的线粒体自噬活性,使用环孢菌素A（CsA）分别抑制2组细胞线粒体自噬活性并进行成脂诱导,光镜下计数含脂滴细胞数。结果：分离培养的细胞呈多角形或梭形,传代后细胞呈漩涡状排列;OA诱导hADSCs成脂后,细胞内有大量脂滴形成。CCK-8实验,在培养6 d后p62基因缺失组细胞增殖活性较对照组明显降低（P<0.01）。2组细胞诱导成脂后,与对照组比较,p62基因缺失组hADSCs中尼罗红脂滴染色阳性细胞数增多,C/EBPα蛋白表达水平升高（P<0.01）,MDC染色阳性细胞数明显升高（P<0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高（P<0.01）,细胞中LC3的点状化和颗粒化增多,与线粒体的共定位现象增加。使用CsA抑制线粒体自噬后,光镜下观察,p62基因缺失组含脂滴细胞数降低到与对照组接近的水平。结论：p62基因缺失可通过增强总自噬及线粒体自噬促进hADSCs的成脂。