人角膜缘干细胞体外培养的增殖与分化研究

目的了解角膜缘干细胞体外培养的增殖分化规律。方法组织块法培养细胞,测定细胞克隆形成率（ＣＦＥ）,免疫荧光染色检测干细胞表达角质蛋白Ｋ３的状况。结果原代培养２１天左右细胞生长达到饱和,传第１代７～１０天形成单层,ＣＦＥ为９．５２％±４．９７％;传第２代７天,ＣＦＥ为４．２５％±２．１０％（Ｐ＜０．０１）。正常角膜缘基底细胞不表达角质蛋白Ｋ３;原代培养的干细胞亦不表达Ｋ３,传第１代细胞有部分表达。结论人角膜干细胞位于角膜缘基底部,培养的角膜缘干细胞早期具有较高的增殖力并保持干细胞的分化特性。     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

角膜缘干细胞培养液影响血管内皮细胞增殖的实验研究

图1免疫荧光染色,角膜缘干细胞AE-5表达阴性(×200)图2免疫荧光染色,球结膜上皮细胞AE-5表达强阳性(×200)本研究通过体外细胞培养的方法观察角膜缘干细胞培养上清液对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。1材料与方法1.1实验所需试剂人脐静脉血管内皮细胞(上海细胞生物中心提供),鼠抗人K3蛋白单克隆抗体(AE-5),荧光素标记的兔抗鼠二抗(美国Sigma公司);MTT(噻唑蓝)(美国Sigma公司)。1.2方法1.2.1角膜缘干细胞的培养和检测角膜缘组织材料来自新鲜尸眼。采用组织块培养法于37℃、5%CO2条件下进行常规培养。细胞完全形成单层后收集培养上清…     

模拟角膜缘干细胞微环境诱导人多潜能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究

目的：探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法：体外建立hiPSCs细胞系，利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境，添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542)，诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化。采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物 CK3和CK12，角膜上皮细胞前体CK15，角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达。结果：hiPSCs体外培养增殖活跃，免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性。采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养，免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性，角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性； 在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542，免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达，且随分化时间延长表达比例增高。结论：模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4，可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化。     

体外传代培养的角膜缘干细胞特性的研究

目的探讨体外培养的角膜缘干细胞的特性并寻找其表面标志。方法体外扩增入角膜缘干细胞，检测第4代培养细胞Brd—U掺入率及p63、connexin43、角蛋白3／12的表达情况，分析细胞表面分子的表达。结果培养细胞Brd—U24h掺入率明显低于6d掺入率；第4代细胞表现为p63单阳、p63-connexin43双阳和角蛋白3单阳的混合体，而角膜上皮细胞只表达角蛋白。流式细胞分析传代的干细胞β4 integrin，CD90（＋），α6 integrin，CD14（-），角膜上皮细胞CD14（＋）。结论体外传代培养的角膜缘干细胞部分保持干细胞特性，具有增生能力。p63是增生细胞的标志。β4integrin＋／α6 integrin-联合CD90＋／CD14-可能纯化角膜缘干细胞。     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

人骨髓间充质干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的 应用猪板层角膜做载体将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)跨胚层诱导为上皮样细胞,甚至角膜上皮样细胞,初步探讨hMSC作为构建组织工程角膜种子细胞的可行性.方法 实验研究.用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化hMSC并传代,对体外培养的hMSC进行免疫表型鉴定.将传代后的hMSC接种于去上皮的猪角膜基质片前弹力层表面培养诱导分化,免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(CK12)以及角膜缘干细胞标记物ABCG2和CK19的表达.运用体外培养的方法使种植在前弹力层表面的细胞复层化.待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养.培养4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况.结果 获得的hMSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能.流式细胞仪示:培养的hMSC CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%.诱导4周后部分细胞表达CK12和CK19,不表达ABCG2.运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示可以形成1～2层的上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞.结论 在本实验的诱导条件下,hMSC可以分化为上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞,hMSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择.     

表皮生长因子对不同区域角膜上皮细胞体外传代培养的影响

目的　观察表皮生长因子 (EGF)对角膜上皮细胞体外传代培养的影响。方法　用抗 Brdu抗体标记法 ,流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果　对照组 :中央部细胞传代次数为 ( 5± 1)代 ,周边部的为 ( 7± 1)代 ,角膜缘部的为 ( 8±2 )代。EGF组 :角膜中央及周边部上皮细胞传代次数分别提高 ( 1± 1)及 ( 2± 1)代 ;角膜缘部的增加 ( 5± 1)代。结论　角膜缘细胞在添加EGF后 ,细胞体外传代有显著提高 (P <0 .0 1)。由此提示 :通过进一步改善培养条件 ,体外延长角膜缘部细胞的存活是可能的     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

NS398对白介素1α诱导兔角膜基质细胞环氧化酶2表达的抑制

目的探讨氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲基磺胺（NS398）对白介素1α（IL-1α）诱导的兔角膜基质细胞环氧化酶2（COX-2）表达的影响。方法体外培养兔角膜基质细胞,实验组分别以含0、25、50、100、200μmol／LNS398的培养液孵育2h后加入IL-1α诱导COX-2表达,24h后实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测兔角膜基质细胞中COX-2基因表达的差异,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度NS398对细胞生长的影响,并与对照组进行比较。结果Real—Time PCR结果显示IL—1α诱导后24h各组COX-2 mRNA表达量差异有统计学意义（F=988．45,P〈0．01）;对照组与各实验组以及各实验组之间COX-2 mRNA表达量进行多重比较可见,0μmol／LNS398浓度组与对照组之间差异无统计学意义（q=1．3322,P〉0．05）,其他NS398浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（q=34．7896,48．3298,65．8010,70．8131,P〈0．01）,随培养液中NS398浓度的增加,IL-1α刺激后兔角膜基质细胞中COX-2 mRNA表达量不断下降（q=36．1218,49．6620,67．1332,72．1453,13．5402,31．0114,36．0235,17．4712,22．4833,5．0121,P〈0．01）;MTT法检测结果显示,100μmol／L、200μmol／L的NS398对兔角膜基质细胞生长均有明显的抑制作用（q=12．7693,20．9087,P〈0．01）。结论NS398能够有效抑制IL-1α诱导的兔角膜基质细胞COX-2的表达,但超过一定浓度会对细胞产生明显毒性作用。     

诱导人脐带间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的研究

背景眼表疾病导致的角膜盲已成为全球致盲性角膜疾病中的主要原因之一。随着组织工程技术的发展和进步,组织工程角膜为眼表疾病的治疗开辟了新的途径。目的观察体外培养的人脐带间充质干细胞（UC—MSCs）移植到兔角膜基质后的分化发育情况,探讨人UC-MSCs分化为角膜上皮细胞以及治疗兔角膜损伤的可行性。方法获取人脐带组织,采用Ⅳ型胶原酶消化法分离纯化人UC—MSCs并传代,取第3代细胞用于扩增和实验。流式细胞仪检测细胞的免疫表型及诱导成骨分化鉴定。24只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为2个组,将人UC—MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4d后行实验组兔左眼板层角膜移植;对照组以相同的手术方法单纯移植去上皮猪角膜基质。术后对角膜定期行活体激光共焦显微镜检查,并分别于术后2、4、8周摘除各组实验眼行组织病理学和免疫荧光检查,评价移植到兔角膜基质的人UC-MSCs的存活、分化以及移植局部的反应等;应用免疫荧光技术检测移植后角膜上皮细胞中角蛋白3（CK3）、CKl2以及转运蛋白G超家族成员（ABCG2）的表达。结果消化培养的人UC—MSCs呈圆形,细胞胞体较大,贴壁后细胞呈长梭形。培养获得的人UC—MSCs的细胞表型CD105^＋／CD29^＋／CD44^＋／CD34^-／CD45^-,并可诱导分化为成骨细胞。实验组人ISC—MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附良好、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,种植了人UC-MSCs的去上皮猪角膜移植到兔眼,可见实验组受体角膜较对照组透明,未见明显新生血管,在活体共焦显微镜下可见新生的角膜上皮样细胞,未发生免疫排斥反应。免疫荧光检测可见在重建的角膜上皮层检测到CK3及CKl2的阳性表达,而未见ABCG2的表达。结论将种植了人UC—MSCs的猪角膜基质移植到损伤的兔角膜后,人UC—MSCs可以存活、增生并分化为角膜上皮样细胞,可用于修复甚至重建损伤的角膜表层。     

体外培养的兔角膜内皮细胞生物学特性

背景如何选择高质量、生物学特性更接近在体生理状态的角膜内皮种子细胞是组织工程角膜研究的基础。角膜内皮细胞（CECs）的培养、鉴定及生物学特性检测是优选角膜内皮种子细胞的瓶颈问题。目的建立兔CECs原代培养及鉴定的方法,检测传代后细胞的生物学特性。方法从30只新西兰大白兔的角膜组织完整撕除后弹力层及CECs层,采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,观察培养细胞的生长状态。分别从形态学、基因水平和蛋白水平鉴定细胞：茜素红染色法观察细胞形态,并与新鲜角膜组织的内皮细胞进行对比;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测IVα2型胶原（COL4A2）、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na^-K^＋ATP酶α亚单位（ATPIA1）、水通道蛋白1（AQP1）、电压依丛性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因;免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na^-K^＋ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代细胞的增生活性变化,采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代细胞Na^-K^＋ATP酶活性及其表达量的变化。结果原代培养的兔CECs多在24h内贴壁,2—3d达融合,形态呈六边形。随着传代代数的增加,细胞形态逐渐发生改变,第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓,与在体的CECs形态相似。RT—PCR法检测可见COL4A2、FLKl、ATP1Al、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na^-K^＋ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT检测结果显示,传代后细胞的增生活性逐渐下降,尤其第2代、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加,兔CECs的Na^-K^＋ATP酶活性逐渐降低,各代细胞的Na^-K^＋ATP酶活性总体比较的差异有统计学意义（F=77．174,P=0．000）。结论成功用酶消化法建立了体外培养兔CECs的方法,并从多个层次建立了纯化细胞的鉴定方法。研究结果证实经传代后的CECs的增生活性和功能均有所下降,因此在进行相关的研究时应选用前2代的细胞。     

转化生长因子β2对牛角膜内皮细胞增生的影响

目的体外培养牛角膜内皮细胞（CECs）,观察不同质量浓度的外源性转化生长因子β2（TGF-β2）对牛CECs的增生抑制作用。方法0.1、1、10、100μg/L的TGF-β2作用于体外培养的牛CECs,于24、48、72h观察不同质量浓度的TGF-β2对牛CECs的影响。采用CCK-8检测法测定各孔吸光度（A值）,采用流式细胞检测仪对各组细胞周期进行检测。结果0.1、1、10μg/L的TGF-β2作用后各时间点,均能使牛CECs的吸光度发生改变。在同一时间点,0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2抑制效果最为显著。各质量浓度的TGF-β2对牛CECs作用48h,其吸光度改变最明显。48h时,0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2对牛CECs的增生抑制作用明显。各质量浓度组作用48h后,0.1μg/L、1μg/L组牛CECs的G0周期细胞所占比例与阴性对照组比较,差异均有统计学意义,而10μg/L、100μg/L组的牛CECs的G0期细胞百分比与阴性对照组比较,差异均无统计学意义。结论0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2作用24、48、72h对牛CECs均具有明显的增生抑制作用。     

Human keratocytes cultured on amniotic membrane stroma preserve morphology and express keratocan

PURPOSE: To develop a new method of expanding human corneal keratocytes in serum while maintaining their characteristic morphology and keratocan expression. METHODS: Human keratocytes were isolated from central corneal buttons by digestion in 1 mg/mL of collagenase A in DMEM and seeded on plastic or the stromal matrix of human amniotic membrane (AM) in DMEM with different concentrations of FBS. On confluence, cells on AM were continuously subcultured for six passages on AM or plastic. In parallel, cells cultured on plastic at passages 3 and 11 were reseeded on AM. Cellular morphology and cell-cell networks were assessed by phase-contrast microscopy and a cell viability assay, respectively. Expression of keratocan was determined by RT-PCR and Western blot analysis. RESULTS: Trephined stroma yielded 91,600 +/- 26,300 cells (ranging from 67,000 to 128,000 cells per corneal button). Twenty-four hours after seeding, cells appeared dendritic on AM, even in 10% FBS but fibroblastic on plastic. Such a difference in morphology correlated with expression of keratocan assessed by RT-PCR and Western blot, which was high and continued at least to passage 6 on AM, even in 10% FBS, but was rapidly lost each time when cells on AM were passaged on plastic. Fibroblasts continuously cultured on plastic to passages 3 and 11 did not reverse their morphology or synthesize keratocan when reseeded on plastic in 1% FBS or on AM. CONCLUSIONS: Human keratocytes maintain their characteristic morphology and keratocan expression when subcultured on AM stromal matrix even in the presence of high serum concentrations. This method can be used to engineer a new corneal stroma.     

物理交联再生丝素膜组织工程角膜的生物相容性研究

背景角膜组织工程生物材料在体内应当具备透明性、一定的机械强度、生物相容性和缓慢降解的特点,丝素膜生物材料具备这些特征。目的研究采用物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜的可行性。方法用常规培养法培养人角膜上皮细胞（CECs）,将对数生长期的CECs在用家蚕丝制备的物理交联再生丝素膜上进行培养,分别于培养后24、48、72h在倒置显微镜、扫描电子显微镜下观察CECs的生长状态和形态学,并与细胞培养板培养的人CECs形态进行对照。MTT法每日检测和记录再生丝素膜培养后人CECs的增生情况,流式细胞仪检测再生丝素膜培养人CECs的细胞周期和凋亡率。将再生丝素膜4mm×3mm植入新西兰白兔右眼角膜基质层间,于术后1个月、2个月时裂隙灯下检查眼表,术后2个月摘除兔眼并制备移植眼角膜组织切片行组织病理学检查,观察再生丝素膜材料的降解情况及角膜新生血管（CNV）的生长情况。采用免疫组织化学法检测术后1个月、2个月CD34在移植眼角膜组织中的表达,并与正常眼进行对照。结果在24、48、72h3个时间点,倒置显微镜、扫描电子显微镜下见再生丝素膜培养的人CECs与细胞培养板培养法培养的人CECs形态结构无明显差别。再生丝素膜或细胞培养板培养CECs在1、2、3、4、5、6、7d各个时间点A490值比较,差异无统计学意义（F=0．641,P〉0．05）。再生丝素膜和细胞培养板培养的CECs凋亡率分别为1．8％、2．0％,细胞G2／G1期分别为1．956、1．945。再生丝素膜角膜植入后2个月时,再生丝素膜为排列整齐的胶原组织替代,角膜内新生血管和炎性细胞均少于移植后1个月。角膜免疫组织化学染色检测显示再生丝素膜植入角膜后1个月、2个月CD34表达量均明显低于Ad—VEGF165诱导的阳性对照,而与正常的角膜相比差异无统计学意义（P〉0．05）。术后1个月与术后2个月比较,角膜中CD34阳性率的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜可行,再生丝素膜与角膜组织生物相容性良好,再生丝素膜植入兔角膜基质后无明显的炎症反应和新生血管。     

不同浓度肽聚糖对角膜上皮细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响

目的 研究不同浓度肽聚糖对角膜上皮细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2和TLR4表达的影响.方法 原代培养C57小鼠角膜上皮细胞,随机分为对照组(无肽聚糖刺激)及按照肽聚糖刺激浓度分为10 mg·L-1组、30 mg·L-1组、80 mg·L-1组(作用时间均为12 h);按照肽聚糖刺激时间分为12 h组、24 h组、36 h组(作用浓度均为30mg·L-1),应用实时荧光定量PCR与流式细胞术检测各组TLR2、TLR4 mRNA和蛋白的表达量.结果 与对照组(1.00±0.14、1.00±0..01)相比,10 mg·L-1组(4.35±0.46、3.53±0.50)、30 mg· L-1组(8.06±0.72、5.31±0.34)、80 mg· L-1组(2.93±0.46、2.23±0.04)的TLR2、TLR4 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);与对照组(1.00±0.14、1.00±0.01)相比,12h组(2.94±0.46、2.23±0.50) TLR2、TLR4 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).与对照组相比,各浓度组和12 h组角膜上皮细胞TLR2、TLR4蛋白表达均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 肽聚糖可以刺激小鼠角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达增加,提示感染性角膜炎的发生、发展可能与角膜上皮细胞TLR2、TLR4识别病原体并参与炎症反应有关.     

Long-term culture and characterization of human limbal microvascular endothelial cells

Human limbal explants obtained from 44 eyebank donors were cultured in medium 199 supplemented with 20% fetal bovine serum, vascular endothelial cell growth supplement and heparin. Cells grew abundantly out of the explants. They initially formed a 'cobblestone' patterned monolayer but later exhibited an elongated morphology with growth in parallel bundles. These cells could be passaged at least nine times and were identified throughout the consecutive passages as microvascular endothelial cells by the expression of factor VIII-related antigen, laminin and of the H determinant of ABO blood groups. As expected from vascular endothelial cells, flow cytometric analysis demonstrated a strong expression of class I histocompatibility antigens and a weaker expression of class II antigens. Class II antigen expression was enhanced by culturing the cells in the presence of immune interferon. These cells produced immunoreactive interleukin-1, mainly of the alpha type, under endotoxin stimulation. Limbal microvascular cells could be useful to study corneal angiogenesis. Furthermore, long-term culture of limbal cadaveric tissue can potentially be used to characterize donor-specific immunologic responses in corneal graft recipients.     

银杏内酯B对H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨银杏内酯Ｂ对体外培养的人视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ,ＲＰＥ）细胞氧化损伤的保护作用及可能机制。方法　ＲＰＥ细胞传代培养２４ｈ后,随机分为阴性对照组、氧化损伤组、银杏内酯Ｂ低浓度组（１ｍｏｌ?Ｌ－１）和银杏内酯Ｂ高浓度组（１０ｍｏｌ?Ｌ－１）,银杏内酯Ｂ预处理２４ｈ后,加入１００μｍｏｌ?Ｌ－１Ｈ２Ｏ２继续孵育１２ｈ,ＭＴＴ比色法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８染色观察凋亡细胞形态,比色法检测凋亡相关因子Ｃａｓｐａｓｅ-３及Ｃａｓｐａｓｅ-９的表达。结果　银杏内酯Ｂ能明显抑制Ｈ２Ｏ２诱导的ＲＰＥ细胞活力的下降,ＭＴＴ结果显示银杏内酯Ｂ低浓度组和银杏内酯Ｂ高浓度组细胞活性分别为（５３．３７±２．５３）％和（６９．５７±３．１７）％,与氧化损伤组的（３１．３３±２．４１）％比较,差异均具有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;流式细胞计数结果显示银杏内酯Ｂ低浓度组和银杏内酯Ｂ高浓度组细胞凋亡率分别下降至（２７．５３±３．３４）％和（１３．３０±２．２５）％,与氧化损伤组的（４８．１３±２．６８）％比较,差异均具有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。此外,银杏内酯Ｂ还可以减少Ｈ２Ｏ２所致ＲＰＥ细胞内Ｃａｓｐａｓｅ-３及Ｃａｓｐａｓｅ-９的表达。结论　银杏内酯Ｂ通过抑制Ｃａｓｐａｓｅ-３及Ｃａｓｐａｓｅ-９的表达有效抑制了Ｈ２Ｏ２对ＲＰＥ细胞的损伤,从而为其用于治疗ＲＰＥ细胞损伤提供可靠的实验依据。     

体外培养人角膜上皮细胞中CD44的表达及IFN-γ和雷公藤多甙对其的影响

目的探讨黏附分子CD44在角膜上皮细胞中的表达及干扰素-γ（IFN-γ）和雷公藤多甙对角膜上皮细胞中CD44表达的影响。方法采用细胞培养和流式细胞技术,分别观察同一培养时间（24h）不同IFN-γ含量和同一IFN-γ含量不同培养时间对人角膜上皮细胞CD44表达的影响及0.03%雷公藤多甙对角膜上皮细胞中CD44表达的影响。结果体外培养的人角膜上皮细胞可基础表达一定量的CD44（1.944±0.237）,IFN-γ可上调CD44的表达,其上调作用呈量和时间依赖性（P〈0.05）。雷公藤多甙可以使角膜上皮中CD44的表达降低（P〈0.01）。结论IFN-γ可以使角膜上皮细胞中CD44的表达升高,使排斥反应加剧;雷公藤多甙可以抑制角膜上皮细胞中CD44的表达,从而抑制角膜移植排斥反应。