RCS大鼠视网膜色素变性过程中内源性干细胞激活的初步研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeon's rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中是否有内源性视网膜干细胞(retinal stem cells,RSCs)激活.方法RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS 15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS 90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C15 d,C30 d,C90 d),每组4只8眼,对各组视网膜切片进行免疫荧光组织化学(抗Chx10)实验,以鉴定视网膜干细胞;进一步采用Western blot检测各组视网膜神经上皮总蛋白中Chx10表达.结果①各正常组及变性15 d大鼠视网膜各层抗Chx10免疫荧光检测均为阴性,变性中、晚期视网膜光感受细胞层部位Chx10免疫荧光阳性;②Western blot检测各变性组视网膜神经上皮总蛋白中Chx1O均有表达,但变性中期Chx10表达显著高于早期和晚期(P＜0.05).结论 RCS大鼠变性过程中视网膜感光细胞层出现视网膜干细胞激活.     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白的表达

目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。方法 对RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚，视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降，到出生后60d，仅少许感光细胞存留。出生后25～40d，RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL染色阳性的感光细胞，阳性细胞数35d最多。30-40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达细胞，35d时内核层阳性表达细胞数最多。外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达细胞。结论 RCS大鼠视网膜变性过程中。感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白表达的关系

①目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。②方法 对：RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。③结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚，视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降，到出生后60d，仅少许感光细胞存留。出生后25～40d，RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL，染色阳性的感光细胞，阳性细胞数35d最多。30～40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达，35d时内核层阳性表达细胞数最多，外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达。④结论 RCS大鼠视网膜变性过程中，感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

Nogo-A/B蛋白在RCS大鼠视网膜色素变性过程中的表达

目的 观察髓磷脂抑制蛋白Nogo-A/B在遗传性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)遗传模型皇家外科学院大鼠( Royal college of surgeons rat,RCS)视网膜变性发展过程中的表达并探讨其意义.方法 按出生后视网膜变性的发展程度将RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)分为P15d、P30d、P60d和P90d 4组,采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照,5只/时间点,利用免疫组织化学技术及免疫印迹检测2组(共40只)RCS视网膜上Nogo-A/B蛋白的表达趋势.结果 与对照组相比,①P15d、P30d RCS-p+大鼠视网膜各层结构和细胞数目无明显变化,仅节细胞数目轻微减少；P60d、P90d大鼠视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)和内核层(inner nuclear layer,INL)结构出现明显紊乱,细胞数目的减少以ONL和神经节细胞层(ganglion cell layer,RGC)层为主.②IH显示Nogo-A/B蛋白在RCS-p+大鼠各时间段视网膜表达均为阳性,P15d开始出现,随变性过程呈升高趋势,主要表达在INL和RGC层,阳性细胞数目显著高于对照组.③WB免疫印迹检测结果显示P15d、P30d、P60d和P90d Nogo-A蛋白表达量分别为(0.82737±0.212 92)、(1.110 19±0.089 99)、(1.315 52±0.028 57)、(1.268 81±0.080 42),与对照组相比有显著差异(P＜0.05).Nogo-B2蛋白与Nogo-A蛋白表达趋势一致,但总体表达量较低.结论 Nogo-A蛋白可能参与了视网膜色素变性过程中视神经损伤后的再生修复抑制.     

枸杞子提取液对RCS大鼠遗传性视网膜变性的作用

目的 观察枸杞子提取液(LBA)对RCS大鼠遗传性视网膜变性的治疗作用.方法 出生后RCS大鼠24只,随机分为对照组和治疗组,每组12只.治疗组RCS大鼠出生后10 d开始喂食1 mg/kg的LBA, 对照组正常饲养.两组大鼠分别在出生后25、35、45 d取眼球,制备组织切片,应用苏木精-伊红(HE)染色和TUNEL染色观察视网膜感光细胞坏死和凋亡情况,并应用免疫组化方法检测Caspase-2的表达.结果 治疗组大鼠出生后25 d 和35 d时TUNEL染色阳性细胞与对照组相比明显减少(t=3.33～6.72,P<0.05);治疗组和对照组大鼠生后25～45 d时Caspase-2在节细胞层和内核层均有表达,但在25 d时治疗组与对照组相比明显减少(t=6.33,P<0.05).结论 在RCS大鼠遗传性视网膜变性的早期,LBA通过抑制细胞凋亡及Caspase-2表达对神经元起保护作用.     

不同日龄视网膜变性大鼠眼底组织结构学观察

目的 探究转基因视网膜退行性变性S334ter-line-3大鼠在出生后不同日龄视网膜组织结构学变化.方法 选择出生后1,9,11,18,30,59 d的S334ter-line-3大鼠,断颈或腹腔注射过量麻药后处死大鼠,摘除双眼球,置入眼球混合固定液及福尔马林液中,左眼行常规石腊包埋,右眼行Histocryl plastic包埋,HE染色,光学显微镜下观察不同时点视网膜组织学结构.结果 出生后第1天,S334ter-line-3大鼠视网膜是一种未发育完善的胚胎型组织,仅有RPE细胞层、祖细胞层,短的内丛状层和神经节细胞层;第9天时其视网膜发育才较完善.第11天时视网膜感光细胞层即开始发生退行性变性,其外核层内可见深染皱缩的凋亡细胞核;第18天时感光细胞层内外节几乎完全消失,外核层变薄,胞核数仅为正常1/2;第30天时,S334ter-line-3大鼠视网膜外层退行性变性已基本完成,仅残留1排感光细胞核层,其外接RPE细胞层,内接视网膜内核层;第59天视网膜结构与第30天基本相同.结论 S334ter-line-3大鼠在出生后随年龄的增长,视网膜外层逐渐发生退行性变性,至出生后第30 d时这种退行性变性基本完成,故出生后30 d的大鼠适合作为视网膜移植中的移植受体.     

金纳多对RCS鼠视网膜色素变性神经元保护作用

目的 探讨金纳多（Ginaton，EGb761）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元保护作用的机制。方法 将出生后雄性RCS大鼠48只随机分为给药组和对照组。给药组大鼠从生后7d开始腹腔注射金纳多，每3d注射一次，剂量为100mg／kg。对照组大鼠注射生理盐水，剂量相同。苏木精-伊红染色和TUNEL检测观察EGB761对视网膜色素变性神经元的保护作用。应用免疫组织化学方法检测Caspase-2蛋白的表达。结果 给药组大鼠生后20和25d，感光细胞的数目与对照组大鼠比较明显增加（t=3．32、3．56，P〈0．05）。给药组大鼠生后25d TUNEL检测阳性细胞数目比对照组少，差异有统计学意义（t=3．74，P〈0．05）。生后25～40d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和内核层观察到Caspase-2阳性染色。给药组大鼠生后20和25d时内核层Caspase-2阳性细胞数少于对照组（t=2．87，P〈0．05）。结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期，EGb761对神经元起保护作用，其作用机制可能与Caspase-2蛋白的低表达有关。     

枸杞子提取液对RCS大鼠视网膜色素变性的保护作用

目的 观察枸杞子提取液(LBA)对RCS大鼠视网膜色素变性的治疗作用.方法 RCS大鼠24只,随机分为给药组和对照组,各12只.给药组大鼠出生后10 d开始喂食LBA(1 mg/kg), 对照组大鼠喂食等量生理盐水.两组大鼠分别于生后25、35、45 d处死,取出眼球,制备组织切片,苏木精-伊红染色和TUNEL法检测视网膜感光细胞的数量.结果 与对照组比较,给药组大鼠出生25 d时感光细胞数目增多,TUNEL阳性细胞数目减少,差异有统计学意义(t=3.12、3.41,P<0.05).结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期应用LBA,可对早期变性的神经元发挥保护作用.     

RCS大鼠病变发育过程中视网膜神经节细胞形态学变化的研究

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)病变发育过程中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学变化.方法取RCS大鼠、RCS-rdy 大鼠3、5、7、9、11周龄视网膜,固定后行视网膜平铺片,甲酚紫染色,使用LEICA DM TRET显微镜及自带的LEICA Q WIN系统软件,观察视网膜神经节细胞层细胞数量总数及RGCs亚群数量上的变化.结果RCS大鼠病变发育过程中,其节细胞层中细胞横径≥12μm的细胞在数量上,7、9、11周龄段相较与3周龄段出现显著减少(P＜0.01).相同周龄段上的视网膜节细胞层中,RCS大鼠与RCS-rdy 大鼠在横径≥12μm的细胞数量上相互比较,可见RCS大鼠从5周龄段开始相较于RCS-rdy 大鼠出现显著减少(P＜0.05),7、9、11周龄段相较与RCS-rdy 大鼠减少更为显著(P＜0.01).但是节细胞层细胞总数及横径≥9 μm的细胞数量上,RCS大鼠自身发育前后对照以及与RCS-rdy 大鼠相比较没有显著差异.结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,随着光感受器细胞的变性和缺失,虽然视网膜节细胞层细胞在整体数量上没有明显变化,但是RCS大鼠视网膜病变发育早期,其节细胞层中胞体横径≥12μm的RGCs在数量上开始出现明显缺失.     

大鼠视网膜光损伤与细胞凋亡

目的 本文通过动物实验的方法,建立视网膜光损伤的动物模型,取材后进行光镜组织切片采用HE染色和TUNEL标记方法 观察视网膜光损伤后的病理改变,探讨普通日光灯对大鼠眼视网膜损伤的发病机制.方法 利用自制光照箱[中央平均光度(5680±146)lux],20只SD封闭群大鼠和1只RCS大鼠,随机建立实验组和对照组(实验组三组,阴性对照一组,阳性对照一组),实验组分别在光照后12、24、36h取材摘除眼球,解剖显微镜下取视网膜组织,固定、脱水、包埋,制作光镜组织切片进行HE染色和核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口翻译法(TUNEL)标记凋亡细胞,在光镜下观察的方法 .结果 (1)实验大鼠在暗适应后,鼠视网膜形态结构正常,层次清楚,视杆细胞内外节排列整齐,界限清楚,TUNEL标记阴性.(2)光照12h后,视杆细胞外节轻度空泡变性,外核层细胞核浓缩不明显,TUNEL标记细胞较少.(3)光照24h后,视杆细胞外节结构不清,外核层细胞核明显破碎,浓染,TUNEL标记较多,色素上皮细胞核浓染.(4)光照36h后,视杆细胞内外节溶解,外核层细胞稀疏,色素上皮核破碎,细胞核标记明显减少.结论 普通日光灯在一定强度下,经过一定时间的照射,对视网膜有损害,视网膜光损伤的病理变化中有细胞凋亡现象发生,视细胞凋亡是大鼠实验性视网膜光损伤的重要机制之一;视网膜凋亡细胞的出现位置主要集中在视网膜外核层,内核层和视神经节细胞层,随着损伤后时间的推移,调亡细胞逐渐被清除,视网膜组织则变薄,造成功能损害.     

N-Arg对RCS大鼠遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响

目的:研究一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂对遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响.方法:测定出生后不同鼠龄RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜的诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)活性;出生后第17天RCS大鼠玻璃体腔内注射NOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸(Nω-nitro-L-arginine,N-Arg),并于出生后第22、27和32天重复注射,于出生后第38天以TUNEL法检测视网膜视细胞凋亡.结果:RCS大鼠出生后第25天,视网膜iNOS活性达高峰;注射N-Arg后,视网膜TUNEL阳性视细胞核相对面积显著降低,外核层明显增厚,杆锥层显著变薄.结论:一氧化氮合酶抑制剂对遗传性视网膜变性具有潜在的临床治疗价值.     

IMMUNOHISTOCHEMICAL DISTRIBUTION OF ERYTHROPOIETIN AND ITS RECEPTOR EXPRESSION IN POSTNATAL RAT RETINA DEVELOPMENT

Objective To investigate the distribution of erythropoietin （EPO） and erythropoietin receptor （ EPOR ） expression in the postnatal rat retina development. Methods Forty-two male Sprague-Dawley rats were divided into 7 groups according to their various postnatal days： postnatal 1 d （D1 group）, 3 d （D3 group）, I week （W1 group）, 2 weeks （W2 group）, 3 weeks （W3 group）, 4 weeks （W4 group） and8 weeks （W8 group） （ n = 6 ）. Single eye was randomly chosen from each rat for the study. The retinal sections were stained with hematoxylin and eosin （HE） and used for the retina development observation. Immunohistochemical staining was used to localize EPO and EPOR expressions in retinas.of differentstages of development, and the expression intensities were determined by an image plus 4 program~~ Results The retinal inner nuclear layer （INL） and outer nuclear layer （ONL） were mixed together and had not yet fully differentiated in D1 and D3 groups. The INL and ONL formed their own independent regions and the outer plexiform layer （OPL） appeared between two layers in W1 group. With the postnatal retinal development, the inner plexiform layer （ IPL ） , rods and cones layer （ RCL ）, and OPL were gradually widened and stabilized in W2 to W3 groups. EPO/EPOR expressions located prominently in the inner part of the postnatal rat developing retinas. The expression of EPO in GCL and INL gradually increased from DI to W4, then the expression decreased in W8. Expression of EPOR in GCL gradually increased from DI to WI , then decreased in W2 ; and it gradually increased again from W3 to W8. Expression of EPOR in INL gradually increased from D1 to W1, then decreased in W2 ; and it continued to decrease from W3 to W8. Expression of EPOR in the external segment of RCL gradually increased from D1 to W8. However, expression in the internal segment of RCL gradually decreased from D1 to W3 , then no obvious expression was seen in the internal segment of RCL in W4 and W8. Conclusion     

N-甲基-D-天门冬氨酸对大鼠视网膜损伤的形态学观察

目的： 研究N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）兴奋毒性对大鼠视网膜及视神经所致的形态学变化。 方法： 32只大鼠随机均分为4组,正常对照组（A组）,实验组24只右眼注射NMDA 2 μl,依注射剂量10 nmol,20 nmol,40 nmol随机等分为B组、C组、D组,7 d后处死大鼠摘除眼球。每组取6只大鼠眼球作石蜡包埋,测量距视乳头边缘1～1.5 mm间的视网膜内丛状层厚度,用以评价NMDA对视网膜的神经毒性。各组其余2只大鼠取视神经作半薄切片,光镜下观察是否有轴索退行性变,电镜观察同一眼视网膜神经元的超微结构改变。结果： 不同剂量NMDA干预后7 d视网膜内丛状层的厚度均明显降低,各组间差异有统计学意义（P＜0.05)。视神经半薄切片光镜下可见轴索退行性变,其程度与NMDA浓度相关。在各浓度组切片均可见视网膜神经节细胞（RGC）及双极细胞出现核固缩,染色质边聚等具有凋亡特征的改变。 结论： NMDA导致的视网膜内丛状层厚度变薄及视神经轴突变性程度与NMDA剂量相关。凋亡可能是NMDA介导的视网膜神经节细胞（RGC）死亡的主要形式,NMDA损伤模型与青光眼性损伤有相似性。     

大鼠视网膜缺血再灌注后多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的表达变化

目的观察大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时相视网膜结构变化及多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)的表达情况。方法升高眼压到110mmHg持续1h，建立大鼠视网膜缺血再灌注模型。HE染色观察视网膜组织病理学改变；免疫组化Ehvision^TM法检测视网膜细胞PARP表达。结果正常对照组大鼠视网膜仅见微量PARP表达；缺血1h再灌0h组视网膜结构未见明显变化；再灌注6h，视网膜开始有中性粒细胞浸润，神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)PARP表达显著增加；12、24h组视网膜中有较多中性粒细胞浸润，神经节细胞层PARP表达24h达高峰后下降，但仍维持较高水平；24h后内核层(inner nuclear layer，INL)细胞PARP表达明显增高，168h达高峰，伴之神经节细胞层和内核层细胞明显变薄。另外，也见自身对照眼视网膜神经节细胞层PARP表达增加。结论大鼠视网膜缺血再灌注早期PARP即表达上调，24h组在GCL达高峰，168h组在INL达高峰，这一过程可能与视网膜神经节细胞层和内核层细胞凋亡有关。     

实验性光损伤大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的研究

目的：观察较强可见光所致大鼠视网膜光感受器细胞凋亡现象，探讨视网膜光化学损伤发病机制。方法：取健康成年SD大鼠50只，随机分成正常对照组（CON）、光损伤后1天（D1）、3天（D3）、5天（D5）、7天（D7）组，每组10只。各组大鼠在12h明12h暗环境中饲养7天，然后暗适应36h。D1、D3、D5、D7组大鼠采用4178Lux照度的可见光进行12h间歇光照射，连续3天，总计36h，然后在正常环境中分别饲养1天、3天、5天、7天。10％水合氯醛麻醉大鼠，摘取眼球，制备视网膜石蜡切片及超薄切片，行HE染色、TUNEL法标记及重金属染色，光镜、透射电镜观察，MIAS-1000图像分析系统检测。结果：正常大鼠视网膜组织结构层次清楚，外核层排列规则，染色质电子密度均匀。TUNEL法染色阴性。光照后1天，外核层开始变薄，其厚度减少11.88％。核染色质开始固缩。可见少量TUNEL法标记的阳性细胞核，染色质向核膜下聚集，呈现典型的凋亡细胞表现。光照后3天，外核层厚度减少26.80％。电镜下核染色质向中心聚集。TUNEL法标记的凋亡细胞增加。光照后5天，外核层厚度减少39.76％。TUNEL法标记的凋亡细胞更。光照后7天，外核层厚度和TUNEL法标记的凋亡细胞数与光照后5天基本相似。视网膜色素上皮细胞、节细胞及内核层均无明显变化。也未了现炎症细胞。结论：实验性光损伤导致大鼠光感受器丧失，光感受器丧失的性质为细胞凋亡。实验结果初步证实光感受器细胞凋亡是实验性大鼠视网膜光损伤的重要机制。