外源Smad7基因对肝星状细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的影响

目的观察外源Smad7基因能否有效转染肝星状细胞及其对Smad7 mRNA和蛋白表达的影响。方法构建鼠Smad7真核表达重组质粒，脂质体介导转染HSC—T6细胞，以RT—PCR和Western blot检测正常对照组、空质粒组及转染组中Smad7表达情况。结果Smad7真核表达质粒构建成功；外源Smad7体外转染肝星状细胞后，Smad7 mRNA和蛋白水平均显著上调，Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较：Smad7 mRNA表达显著增加（P=0．009，0．011），蛋白水平显著上调（P=0．020，0．026），正常对照组、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平表达差异无统计学意义（P=0．944，0．644）。结论Smad7真核表达质粒构建成功，外源Smad7基因可有效转染肝星状细胞，并显著上调Smad7 mRNA和蛋白水平。     

P19-αMHC-EGFP干细胞株的构建及其向心肌细胞诱导分化的初步研究

目的 构建稳定携带心肌特异报告基因pαMHC-EGFP的P19细胞株并诱导其向心肌细胞分化.方法 应用脂质体转染法转染质粒pαMHC-EGFP到P19干细胞,通过G418筛选和有限稀释法得到稳定携带pαMHC-EGFP的细胞克隆P19-αMHC-EGFP.诱导P19-αMHC-EGFP向心肌细胞分化,在诱导的不同阶段观测其超微结构的变化,在诱导分化进程中监测"跳动"的发绿色荧光的心肌细胞出现.同时与未转染pαMHC-EGFP的P19细胞进行心肌细胞分化率及心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达量的对比.结果 电镜结果 提示在诱导的第10天,部分细胞出现心肌细胞样特征.P19-αMHC-EGFP在诱导分化的第7天出现发强绿色荧光并"跳动"的心肌细胞,同时与对照P19细胞在心肌细胞分化率及cTnI表达量上差异无统计学意义(P>0.05).结论 P19-αMHC-EGFP细胞株在分化为心肌细胞的同时具有强绿色荧光标记,其向心肌细胞分化的效率及cTnI的合成未受影响.这一特征有利于对分化成熟的心肌细胞进行识别和纯化,从而应用于心肌细胞替代治疗.     

P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox的变化

目的：探讨诱导P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox水平的变化。方法：P19细胞经0.9%二甲基亚砜（DMSO）于细菌培养皿中悬浮诱导培养4 d,待细胞聚集体形成,吸取聚集体接种于组织培养皿,贴壁培养至第13天。行Western blot检测肌钙蛋白I（cTnI）,以鉴定心肌样细胞的分化,并检测P19细胞向心肌样细胞分化前后细胞中gp91-phox蛋白水平。结果：（1）经0.9%DMSO诱导分化,P19细胞于第7天开始表达cTnI,随后cTnI表达明显增高并趋于稳定;（2）P19细胞分化为心肌样细胞后细胞内gp91-phox蛋白水平较分化前高（P〈0.05）。结论：P19细胞向心肌样细胞分化后gp91-phox表达上调,氧化应激水平增加。     

α烯醇化酶靶向RNA干扰对原代培养乳鼠心肌细胞能量代谢及收缩功能的影响

目的采用RNA干扰技术抑制培养大鼠心肌细胞α烯醇化酶的表达，探讨α烯醇化酶对心肌细胞能量产生和收缩功能的影响。方法针对α烯醇化酶基因，化学合成3对小片段干扰RNA（siRNA）（分别为针对α烯醇化酶mRNA406-425位点的序列1，针对α烯醇化酶mRNA656～675位点的序列2及针对α烯醇化酶mRNA754～773位点的序列3）并转染原代培养的WKY大鼠心肌细胞。采用Real—time RT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测α烯醇化酶的表达情况，筛选其中沉默效应最好的序列（序列1）转染心肌细胞，即RNA干扰实验组，以未转染siRNA的心肌细胞为对照组，荧光素荧光素酶法检测细胞ATP水平，视频跟踪计算机测定系统测定细胞收缩反应，参数包括最大收缩幅度（dL），最大收缩速度（dL／dtmax）。结果针对α烯醇化酶mRNA 406-425位点的siRNA显著下调α烯醇化酶mRNA和蛋白的表达，并且呈剂量和时间依赖关系，200nmol／L可达到最大沉默效应，其下调α烯醇化酶mRNA和蛋白表达的最大效应分别出现在转染后24h和48h。α烯醇化酶沉默后细胞ATP产生减少（3．55×10^-7nmol／mg蛋白），dL[（0．82±0．02）μm]和dL／dtmax[（2．7±0．3）μm／s]下降。结论应用siRNA技术靶向α烯醇化酶mRNA406～425位点可有效下调心肌细胞a烯醇化酶的表达，使细胞产能减少，收缩功能下降。     

过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的构建过表达大鼠热休克蛋白20(HSP20)基因慢病毒载体,探讨其对H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠HSP20基因pHIV-HSP20过表达质粒慢病毒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其转染效率;包装慢病毒并转染H9C2心肌细胞;72 h后观察其转染效率,RT-PCR法检测细胞HSP20 mRNA表达,CCK-8、Hochest33258染色法检测H2O2诱导后H9C2心肌细胞凋亡情况。结果成功构建了HSP20慢病毒过表达载体,经293FT细胞包装后,其对H9C2细胞72 h的转染效率为95%;与慢性病毒组比较,H9C2细胞转染72 h后HSP20 mRNA水平显著升高,细胞活力下降,心肌细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)。结论过表达HSP20能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

shRNA介导mcl-1基因沉默对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的观察shRNA介导mcl-1基因沉默对肝癌细胞HepG2的凋亡作用。方法构建靶向mcl-1基因的shRNA表达载体，经脂质体介导将其转入HepG2细胞内，48h后利用RT—PCR和Westernblot检测mcl-1mRNA和蛋白水平，Hoechst染色进行凋亡形态学观察，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果所构建的shRNA表达载体能明显降低HepG2细胞内mcl-1mRNA和蛋白水平。转染shRNA表达载体的细胞经Hoechst染色出现明显凋亡核形态学表现。经流式检测，shRNA组的凋亡率明显高于阴性对照组（7．74％±0．97％vs2．81％±0．46％，P=0．001）。结论shRNA介导mcl-1基因沉默可导致HepG2细胞凋亡，靶向mcl-1基因的RNA干扰可能是肝癌治疗的有效途径之一。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

RNAi 介导 IGF-1R 基因沉默对非小细胞肺癌PC-9／ZD 细胞株 EMT 的影响

目的：探讨RNA干扰（ RNAi）介导胰岛素样生长因子1受体（ IGF-1R）基因沉默对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞PC-9/ZD发生上皮-间质转化（EMT）的影响。方法构建靶向IGF-1R基因的RNAi重组慢病毒,感染NSCLC表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR-TKIs）获得性耐药细胞PC-9/ZD;实时荧光定量PCR法检测IGF-1R表达抑制效应及IGF-1R基因沉默后EMT相关分子的mRNA表达变化,Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化。结果成功构建靶向IGF-1R基因的RNAi重组慢病毒,滴度为1×106 TU/μL,对PC-9/ZD细胞IGF-1R基因的mRNA抑制效率为71．4％。 IGF-1R基因沉默后,PC-9/ZD细胞形态呈现间质向上皮化转变,上皮标志物E-cadherin的mRNA表达量升高（P＜0．05）,间质标志物Vimentin的mRNA表达量降低（P＜0．05）,且侵袭转移能力减弱（P＜0．05）。结论靶向IGF-1R基因沉默可逆转PC-9/ZD细胞EMT。     

二种不同的诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞分化的心肌样细胞L型钙电流的变化

目的利用膜片钳技术检测体外两种不同诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为心肌样细胞的L型钙电流(ICa-L)。方法体外培养扩增hMSCs,采用①5-氮胞苷(5-Aza,10μmol/L)化学诱导4周;②原代分离培养SD乳鼠搏动心肌细胞(CMs)制备的心肌微环境诱导10天直至CMs停止搏动。利用膜片钳技术检测两种不同方法诱导分化的心肌样细胞、hMSCs及原代CMs的ICa-L。结果 5-Aza与心肌微环境诱导分化的心肌样细胞较hMSCs的ICa-L增强(112.60±8.26,120.50±9.35pAvs96.67±13.50pA,P均<0.05);低于CMs组(263.86±39.01pA,P<0.01)。结论两种诱导方法诱导的心肌样细胞ICa-L均增强。     

JAZF1基因过表达对鼠肝细胞糖脂代谢相关基因表达的影响

目的探讨JAZF1过表达对鼠肝细胞IAR-20及Hepa1-6糖脂代谢相关基因的影响。方法克隆鼠JAZF1编码区并构建pIRES2-EGFP-JAZF1表达载体,利用脂质体法将目的基因转染到鼠肝细胞IAR-20及Hepa1-6中,采用实时荧光定量PCR测定各处理组JAZF1 mRNA表达情况,以及糖脂代谢相关基因SREBP1、AOC、FAS、HSL、PPARa、ATGL、G1uT-1、G1uT-4和细胞因子FGF-21mRNA的变化情况。结果JAZFl基因在鼠肝细胞中过表达导致脂代谢基因SREBP1,ACC,FAS表达降低（P〈0．01）,PPARa和HSL表达增加（P〈0．01）,对AXG-L无影响（P〉0．05）,使糖转运相关基因GluT-1表达增加（P〈0．01）,GluT-4无显著变化（P〉0．05）,对FGF-21无影响（P〉0．05）。结论JAZF1过表达可以抑制肝细胞的脂肪生成,促进脂肪分解,并可能增加基础葡萄糖转运。     

心房颤动患者心房组织碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子-β_1基因表达与心房纤维化的关系

目的探讨心房颤动(简称房颤)患者心房纤维化的分子机制。方法75例风湿性心脏瓣膜病(简称风心病)接受换瓣手术者按术前心脏节律分为窦性心律组(n=34),阵发性房颤组(n=11),持续性房颤组(n=30);分别采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组化技术测定Ⅰ型胶原(ColⅠ)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1(TGFβ-1)的mRNA和蛋白含量。结果阵发性房颤组、持续性房颤组心房组织胶原容积分数明显高于窦性心律组;持续性房颤组增加更明显(P均<0.05)。心房组织胶原容积分数与左房内径、房颤持续时间呈正相关。与窦性心律组比较,ColⅠ、bFGF和TGFβ-1的mRNA和蛋白表达水平在阵发性房颤组、持续性房颤组均显著上调,持续性房颤组相对于阵发性房颤组亦明显增高(P均<0.05)。同时ColⅠ、bFGF的mRNA、蛋白表达均与房颤持续时间及左房内径呈正相关。结论心房组织中bFGF和TGFβ-1的基因表达上调可能是成纤维细胞增殖导致胶原增加和心房纤维化的分子机制之一。     

RNA干扰沉默Cyclin D1基因对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨以细胞周期蛋白（Cyclin）D1为靶基因的RNA干扰对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响,为胰腺癌的靶向治疗提供依据。方法用含有10％FBS的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中常规培养AsPC-1细胞,至对数生长期后接种于96孔培养板中,随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组,并采用Lipo-fectamine^TM 2000脂质体分别转染Cyclin D1-小干扰RNA（siRNA）、阴性对照siRNA、脂质体,48h时收集细胞。应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞体外增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率（AI）。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞生长速度明显减慢,G0／G1细胞比例显著增大、S期细胞比例则明显降低、AI显著升高（P均〈0．01）。结论Cyclin D1-siRNA能通过沉默靶基因表达抑制AsPC-1细胞生长、改变细胞周期分布、诱导细胞凋亡,可作为胰腺癌基因治疗的一个有效靶点。     

雌激素对子宫内膜细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的 观察雌激素对子宫内膜细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法 将原代培养的子宫内膜细胞随机分为C组和E8、E7、E6组.C组不加雌激素,E8、E7、E6组分别加入浓度为10-8、10-7、10-6 mol/L的雌激素.采用流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR法检测前列腺特异性酸性磷酸酶（PSAP）基因;构建PSAP基因干扰载体,并转染至子宫内膜细胞,观察转染前后细胞凋亡率和PSAP基因表达量.结果 C、E8、E7、E6组细胞凋亡率（gate1）分别为10.8％±0.1％、15.5％±0.2％、15.8％±0.1％、16.6％±0.3％,E8组和E7组比较,P＞0.05;其余两两比较,P均＜0.05.C、E8、E7、E6组细胞凋亡率（gate2）分别为4.2％±0.2％、4.5％±0.1％、5.4％±0.2％、5.7％±0.1％,两两比较,P均＜0.05.C、E8、E7、E6组PSAP基因表达量分别为0.46 ±0.05、0.33 ±0.03、0.26±0.03、0.40 ±0.02,两两比较,P均＜0.05.干扰前后细胞凋亡率分别为18.2％±1.3％、10.2％±0.7％,PSAP基因表达量分别为50.4 ±3.2、19.2±1.3,P均＜0.05.结论 雌激素作用后子宫内膜细胞凋亡增加,PSAP基因表达降低;PSAP基因被干扰后,细胞凋亡减少.雌激素可能通过抑制PSAP基因表达促进子宫内膜细胞凋亡.     

MafA磷酸化在胰岛素基因表达中的作用

目的 探讨肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A （MafA）磷酸化在胰岛素基因表达中的作用.方法 在不同浓度的葡萄糖或糖原合成酶激酶3 （GSK3）抑制剂中培养Ins-1细胞24 h后,分别采用Western blotting和RT-PCR法检测MafA蛋白和胰岛素基因的表达. 结果 高糖组完全磷酸化的MafA和insulin 2 mRNA表达均降低（P＜0.05）.GSK3抑制剂组完全磷酸化的MafA降低（P＜0.05）,同时insulin 2 mRNA表达降低（P＜0.01）,分别下降了31.45％和46.77％. 结论 MafA在葡萄糖调节胰岛素基因表达中发挥重要作用,葡萄糖毒性可能通过抑制转录因子MafA降低insulin 2基因表达.MafA经GSK3磷酸化后促进insulin 2基因转录.     

肌细胞增强因子2A与肝星状细胞活化关系的体内实验研究

背景：转录调控在肝星状细胞（HSC）活化过程中起重要作用,研究显示转录因子肌细胞增强因子2（MEF2）参与了HSC的活化过程。目的：探讨肝纤维化形成过程中MEF2家族成员MEF2A与HSC活化的关系。方法：实验开始时处死6只大鼠作为0周对照组,64只大鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组。模型组大鼠皮下注射60％CCL（0．3ml／100g,每周2次）复制肝纤维化模型;正常对照组大鼠与模型组于相同条件下饲养,不予任何处理。造模开始后3、6、9、12周分批处死大鼠,取肝组织,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测MEF2AmRNA表达．蛋白质印迹法检测MEF2A蛋白和HSC活化标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达,VanGieson染色定量分析肝内胶原含量。结果：正常肝组织中仅有少量MEF2AmRNA和蛋白表达;随着肝纤维化的形成,肝组织MEF2AmRNA和蛋白表达量逐渐增加（P〈0．05）,MEF2A与Q—SMA蛋白表达呈正相关（r=0．88,P〈0．05）。肝内胶原含量随肝纤维化的形成呈递增趋势（P〈0．01）。结论：MEF2A参与了CCl4。诱导的大鼠肝纤维化形成过程中HSC的活化和增殖。     

1α，25-二羟维生素D3对成骨细胞增殖分化、Ⅰ型胶原及核心结合因子α-1基因表达的影响

目的研究1α,25-二羟维生素D3[1α,25-（OH）2D3]对体外培育SD大鼠成骨细胞（OB）增殖分化以及核心结合因子α-1（Cbfa-1）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA表达的影响。方法采用胰蛋白酶和胶原酶消化法从24h内新生SD乳鼠颅盖骨分离得到OB,设置0、1、10、100nmol／L1α,25-（OH）2D3干预组,干预24、48、72h后分别采用噻唑蓝比色法（MTT）检测OB增殖率,采用PNPP法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,采用逆转录-聚合酶链反应法检测细胞cbfa-1和ColImRNA表达。结果 在1α,25-（OH）2O3干预24、48h和72h后,与0nmol／L组比较,1nmol／L组吸光度（A值）均显著增加（P〈0．05）;1α,25-（OH）2D3干预细胞ALP活性、ColⅠ和Cbfa-1基因mRNA表达呈时间依赖性和剂量依赖性增高,且在24h、48h和72h,100nmol／L组与0nmol／L组比较,以上指标差异均显著性增高（P〈0．05）。结论低浓度1d,25-（OH）2D3可促进OB增殖和分化;高剂量对OB增殖无明显作用,但可促进OB分化,提高其ALP活性,增强ColⅠ及Cbfa-1基因mRNA表达而影响骨代谢。