阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

高分辨熔解曲线技术检测阴道念珠菌分型的研究

目的探讨采用高分辨熔解曲线方法鉴定常见致病性念珠菌的可行性,为外阴阴道念珠菌病的分子流行病学及病原学研究奠定基础。方法用芽管试验、厚壁孢子试验、科玛嘉(CHRO Magar)显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统对临床致病性念珠菌进行鉴定,然后对5株标准株和80株临床分离株的基因组DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应,对扩增产物进行高分辨熔解曲线分型。结果 5株念珠菌标准株和80株临床株聚合酶链反应扩增后,通过熔解曲线技术分析产生5种不同的峰图,即得到念珠菌5种分型。结论外阴阴道念珠菌的主要致病菌是白念珠菌(77.50%),高分辨熔解曲线方法鉴定常见的致病性念珠菌特异性强、稳定性好,是传统鉴别方法的有益补充。     

rDNA-RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种间鉴定初探

目的 探讨rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术构建毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析,尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定。方法 收集8种14株毛孢子菌,对其进行rDNA-ITS/IGS1扩增测序,并分别应用HaeⅢ、HhaⅠ、HaeⅢ和HhaⅠ双酶、HinfⅠ、MspⅠ和TaqⅠ对扩增片段进行RFLP酶切。结果 rDNA-ITS-RFLP多酶切可将8种毛孢子菌分为不同进化分支的4个亚类,而rDNA-IGS1-RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定,并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分。结论 rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术有望用于毛孢子菌属种水平的快速鉴定。     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

PCR-RFLP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌

目的 探讨用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中分枝杆菌。方法 皮肤感染性肉芽肿患者组织标本9份.提取组织DNA,进行PCR扩增,PCR产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ2种限制性内切酶进行酶切,3%Nusieve 3:1琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性分析,并与培养结果进行比较。结果 从5份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分枝杆菌,从另4份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出2份结核分枝杆菌和2份脓肿分枝杆菌,此9份结果与培养鉴定结果完全一致。结论 用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌。     

皮肤念珠菌病患者多部位分离菌株DNA分型研究

目的 比较皮肤念珠菌病患者不同部位分离菌株基因相似性,推测皮肤念珠菌病多部位感染的可能途径。方法 采用PCR扩增引物P-Ⅰ和P-Ⅱ扩增出白念珠菌染色体25SrDNA片段和特征性的基因片段重复序列片段,结合两种扩增结果进行分型,并将870bp大小的特征性的基因片段重复序列片段用限制性内切酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化。结果 来自19例皮肤念珠菌病患者的41株白念珠菌被分为6型,同一患者不同部位分离菌株基因型相似,不同个体间基因型有差异。结论 分离自皮肤念珠菌病患者不同部位的致病菌株基因型相同,提示其发病可能与外源性再发感染无关。     

阴道念珠菌随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对分离自外阴阴道念珠菌病患者阴道的念珠菌进行基因分型,并对不同菌株间的亲缘关系作相似性分析。方法 用形态学及生化方法对分离到的致病性念珠菌进行鉴定,然后采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对45株临床分离株基因组DNA进行扩增,并将DNA扩增带型进行聚类分析。结果 30株白念株菌可以分成7群共19个亚群,15株非白念珠菌(包括光滑念珠菌6株,克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌各3株)至少可鉴定到种水平。白念珠菌种内不同菌株间的相似性系数在90%以上,不同念珠菌种间的相似性系数介于80%~90%。结论 外阴阴道念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,用RAPD技术可将之分成不同的基因组型别。     

种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

外阴阴道念珠菌病患者临床分离菌株的菌种及基因型分析

目的 探讨初发型、复发型外阴阴道念珠菌病患者及健康带菌者阴道分离的念珠菌菌种及菌株基因型与初发及复发的关系。方法 选择分别来自健康带菌者、外阴阴道念珠菌病患者和复发性外阴阴道念珠菌病患者。首先经菌种鉴定,然后用RAPD技术对来自3组人群的菌株进行基因分型。结果 临床分离株菌种鉴定结果为白念珠菌83株,非白念珠菌共14株。从9个随机引物中筛选出的2条引物(引物4和引物7)对初发组、复发组及健康带菌组分离株的扩增带型多数未表现出与菌株来源的联系,但少数菌株依来源不同表现出了一定区别。引物4和引物7可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分成19型和21型。结论 外阴阴道念珠菌病致病菌以白念珠菌为主,非白念珠菌中以光滑念珠菌为主。     

八角茴香挥发油抗念珠菌活性的体外研究

目的 探讨八角茴香挥发油体外抗念珠菌活性及与氟康唑在联合抑菌实验中的相互作用。方法 参照NCCLSM27-A方案中的微量液基稀释法检测八角茴香挥发油对130株临床分离念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MFC),并以氟康唑作为质控药物;同时采用棋盘微量稀释法对18株念珠菌进行了八角茴香挥发油与氟康唑的体外联合抑菌实验。结果 八角茴香挥发油对临床分离念珠菌的MIC及MFC分别为白念珠菌1517.16μg/mL与2248.55μg/mL、光滑念珠菌1169.24μg/mL与2338.49μg/mL、近平滑念珠菌1320.03μg/mL与1741.79μg/mL、热带念珠菌1203.50μg/mL与2407.01μg/mL、克柔念珠菌1516.32μg/mL与2144.40μg/mL及季也蒙念珠菌1072.64μg/mL与2144.40μg/mL。八角茴香挥发油与氟康唑联用对氟康唑敏感株及耐药株均表现出较好的协同相加作用,而且未发现有拮抗作用,两组间分数抑菌浓度指数(FICI)差异无显著性(P=0.67)。结论 八角茴香挥发油对临床常见致病性念珠菌有程度相似的抗菌作用;八角茴香挥发油与氟康唑联用对念珠菌主要表现为协同相加作用。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因差异性分析

目的 探讨白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因间的差异.方法 将16株同一亲本来源、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1～CA-9、CA-11～CA-17)进行菌丝相与酵母相培养后,分别抽提基因组DNA,设计引物扩增ERG11基因,扩增产物分别用Acc I、Mun I、Afl Ⅱ消化,电泳后比较两相细胞RFLP图谱,同时用下游引物P₂对ERG11基因扩增产物进行反向测序.结果 Acc I、Mun I、Afl Ⅱ RFLP图谱及基因测序结果均显示菌株CA-7、CA-8、CA-14、CA-16、CA-17的菌丝相与酵母相间存在差异,两相细胞ERG11基因在1547、1587、1617三位点存在差异,位点编号按照基因库中ERG11基因序列编号(登录号X13296).结论 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因间存在差异,在进行白念珠菌体外研究时,选用其菌丝相更能反映体内真实情况.     

产孢丝状真菌药敏试验检测暗色真菌对九种药物的敏感性

目的 检测暗色真菌对9种常用抗真菌药物的敏感性,评价美国国家实验室标准委员会(NCCLS)推荐的产孢丝状真菌药敏试验方案(M38-P)应用于暗色真菌药敏试验的可行性.方法 参照M38-P方案,受试菌株共45株,包括卡氏枝孢14株,裴氏着色霉8株,紧密着色霉3株,疣状瓶霉16株,离蠕孢2株,德氏霉1株及弯孢1株.所用药物为氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑、制霉菌素、两性霉素B和特比萘芬.菌悬液终浓度为(0.4~5)×10⁶cfu/mL,孵育温度35℃,培养时间5~7d.结果 45株暗色真菌对伊曲康唑和特比萘芬的敏感性较高,部分菌株对氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑、两性霉素B存在耐药现象.结论 M38-P方案可用于暗色真菌的药敏试验研究,耐药菌株的发现提示在今后的治疗中药敏测试是必要的.     

白念珠菌颈淋巴结炎一例

目的 报道国内首见白念珠菌性淋巴结炎1例。方法 全面临床检查排除其他疾病;进行了淋巴结培养、鉴定、组织病理、透射电镜、流式细胞仪、细胞免疫学检测等研究。结果 患者为8岁男孩,平时体健,一次颈部皮肤轻微的外伤后,颈部淋巴结广泛肿大,手术取一淋巴结进行培养鉴定为白念珠菌生长,组织病理检查发现在淋巴结中有大量出芽孢子及假菌丝。用流式细胞仪对患者进行细胞免疫学检查,发现患者细胞免疫低下。患者接受氟康唑静脉滴注,同时用小牛胸腺肽增强患者细胞免疫、手术切除等综合治疗,并口服氟康唑及特比萘芬维持治疗2个月。患者病情明显好转,淋巴结不能触及。随访至今细胞免疫状况有明显改善,且无其他异常发现。结论 复习文献,局限性白念珠菌淋巴结炎国内未见报道,细胞免疫等综合治疗有效。     

低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的 研究低氧对系统性硬化病(SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成及胶原基因表达的影响。方法 分别以5例SSc患者和5例正常人皮肤成纤维细胞系作为实验对象。将成纤维细胞分别放入20%正常氧和2%低氧分压环境中培养,用分光光度仪测定细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。用Trizol提取细胞总RNA,用RT-PCR方法测定其中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果 培养至第6天,低氧分压条件下,SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量比正常氧分压条件下显著增加(t=3.97,P=0.0041);正常人皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量此时也显著增加(t=2.63,P=0.0302)。培养至第3天,低氧分压条件下,SSc成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=5.81,P=0.0004;Ⅲ型:t=6.44,P=0.0002);正常人皮肤成纤维细胞此时的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量与SSc患者相似,低氧分压条件下比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=4.40,P=0.0023;Ⅲ型:t=2.24,P=0.0453)。结论 低氧状态下,SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成均有增加,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达也均增加.低氧可能是皮肤硬化的一个相关因素。     

红斑狼疮患者皮损免疫复合物中DNA抗原性质的研究

目的 探讨红斑狼疮(LE)患者皮损免疫复合物中DNA分子的大小和来源.方法 取32例LE患者的皮肤标本,用冷沉淀法提取皮肤中免疫复合物,再用蛋白酶消化、酚氯仿抽提其中的DNA分子,经琼脂糖凝胶电泳分析其大小,斑点杂交法检测其可能来源.结果 LE患者皮损区标本有27例提取到DNA,经琼脂糖电泳分析显示4种不同大小的DNA片段:Ⅰ(约20000bp)、Ⅱ(约1300bp)、Ⅲ(800~900bp)、Ⅳ(100~200bp).15例标本显示以20000bp的大片段为主;2例以条带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为主;10例出现所有的4个条带.低相对分子质量DNA片段(100~200bp)的表达与病情成正相关(χ_p²=4.98,P<0.05,r=0.43).LE患者皮肤免疫复合物中DNA与人类基因组DNA有高度同源性,患者DNA样本之间也有同源片段.结论 DNA(核抗原)可能参与了LE皮肤损害中免疫沉积的构成,以内源性的可能性大,并具有一定的相对分子质量范围,从100~20000bp不等.其中低相对分子质量的DNA片段具有特异性,与疾病活动性相关.     

特比萘芬体外抗丝状真菌药物敏感试验:菌体不同形态对MIC的影响

目的 观察特比萘芬对部分深部丝状真菌和皮肤癣菌的MIC及分别接种未发芽孢子、发芽孢子和菌丝对MIC的影响。方法 参考M38-P(丝状真菌稀释法抗真菌药物敏感性试验参考方案)试验方案及其改进方案,测定特比萘芬对7株曲霉、5株着色真菌、4株波氏假阿利什霉、4株尖端赛多孢子菌及5株皮肤癣菌的未发芽孢子、发芽孢子或菌丝的MIC,并比较相互间的差异。结果 受试菌株以未发芽孢子形态接种时,曲霉MIC范围为≤0.03~0.5μg/mL,暗色真菌的MIC范围为≤0.03~0.06μg/mL,波氏假阿利什霉及尖端赛多孢子菌的MIC均>16μg/mL,皮肤癣菌的MIC均≤0.03μg/mL,提示上述菌株中除波氏假阿利什霉及尖端赛多孢子菌外,其余菌株体外均对特比萘芬敏感。所有受试菌中,除杂色曲霉和疣状瓶霉接种发芽孢子时MIC与接种菌丝时的MIC相差4倍外,其余菌株接种发芽孢子或菌丝悬液时的MIC与接种孢子时的MIC差异无显著性。结论 受试曲霉、暗色真菌及皮肤癣菌体外均对特比萘芬敏感或较敏感。在丝状真菌的特比萘芬体外药物敏感试验中,接种易于获取并易于量化的未发芽孢子时的MIC可以反映特比萘芬体外对发芽孢子及菌丝的抗菌活性。