干扰miR-21调控人前列腺癌 细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭的实验研究

目的观察干扰微小RNA-21(miR-21)对人前列腺癌细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭的影响,并初步探讨其调控机制。方法收集对数期生长PC-3细胞株及人前列腺正常上皮细胞株RWPE-1,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测并对比其miR-21基因表达情况。取对数期生长PC-3细胞株,采用脂质体转染法将miR-21抑制剂(inhibitor)及NC inhibitor质粒转染至PC-3细胞,分别设为干扰组和空载组,另取不做处理PC-3细胞为空白组。采用倒置荧光显微镜检测转染效率;采用MTT法检测并对比各组不同时刻吸光度(OD值);采用划痕试验及Transwell试验检测并对比三组穿膜细胞数及迁移率;采用RT-PCR法检测并对比三组miR-21、基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因表达水平;采用蛋白免疫印迹法检测并对比三组TIMP3、MMP-9蛋白表达水平。结果 PC-3细胞miR-21相对表达量显著低于RWPE-1细胞(P 0. 05);倒置显微镜下检测转染24 h后干扰组和空载组转染效率分别为(82. 16±8. 20)%、(80. 23±8. 69)%;干扰组MTT实验不同时刻OD值均显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05),三组MTT实验OD值均随时间延长呈显著升高趋势(P 0. 05);干扰组12 h、24 h迁移率均显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05),三组24 h迁移率显著高于12 h(P 0. 05);干扰组穿膜细胞数显著少于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05);干扰组miR-21相对表达量、MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05);干扰组TIMP3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论前列腺癌细胞miR-21异常高表达,干扰miR-21可抑制人前列腺癌细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭能力,可能与上调TIMP3 mRNA和蛋白、下调MMP-9 mRNA和蛋白有关。     

miR-29b 对缺血损伤心肌细胞模型的自噬影响及分子机制研究

目的　探讨与研究微 RNA-29b ( miR-29b) 对缺血损伤心肌细胞模型自噬的影响及分子机制。方法　将已经建立缺氧 / 复氧模型的心肌细胞系 (H9C2) 随机分为三组:空白组、对照组与实验组 , 以 life2000 TM 为载体体外转染磷酸盐缓冲液 (PBS)，miRNA 对照质粒（miR-NC）与 miR-29b，检测细胞自噬、增殖水平与氧化自由基等表达变化情况。结果　细胞转染后 24h 与 36h，三组 miR-29b mRNA 表达水平，细胞增殖指数相比差异有统计学意义（F=9.284~81.871,均 P ＜ 0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），空白组与对照组相比差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)。细胞转染后 24h 与 36h，三组 HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及 SOD 活力，MDA 含量相比差异具有统计学意义（F=9.133~15.693, 均 P ＜ 0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)。结论　miR-29b 能通过正向调节 HIF-1α 和 LC-3 的相对表达量来提高SOD 活性，降低 MDA 含量，从而促进细胞自噬，发挥对缺血损伤心肌细胞的保护作用。     

miR-21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响

目的探讨miR-21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响。方法人晶状体上皮细胞(HLE-B3)随机分为三组,实验组转染miR-21模拟剂(mimic),对照组转染miR-21阴性对照(NC),空白组加入等剂量的磷酸盐缓冲液(PBS)。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移,Western-blot检测细胞Bcl-2、Akt蛋白表达。对三组上述各指标进行比较。结果转染48 h后,实验组中miR-21相对表达水平显著上升,与空白组、对照组比较差异均有统计学意义(P 0. 05)。转染24 h、48 h后,实验组的细胞增殖活性显著低于空白组与对照组(P 0. 05);转染48 h后,实验组的细胞凋亡率显著高于空白组与对照组(P 0. 05),迁移距离与过膜细胞数都显著少于空白组与对照组(P 0. 05)。转染48 h后,实验组的Bcl-2、Akt蛋白表达水平显著低于空白组与对照组(P 0. 05),空白组与对照组对比差异无统计学意义(P 0. 05)。结论 miR-21能通过调节晶状体上皮细胞中Bcl-2、Akt蛋白的表达,从而抑制细胞增殖与迁移,促进细胞凋亡。     

BCL-6对血管平滑肌细胞增殖和氧化应激的影响

目的探讨原癌基因BCL-6对血管平滑肌细胞增殖和氧化应激的影响。方法人主动脉平滑肌细胞株(HA-VSMCs)随机分为三组:对照组、空载组和BCL-6组。对照组不进行转染,空载组转染空载体pcDNA3. 1 2μg,BCL-6组转染pcDNA3. 1-BCL-6 2μg。MTT法检测细胞增殖,二氯荧光素双醋酸盐法检测活性氧(ROS)水平,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测BCL-6及α-SMA蛋白表达。结果转染后24 h与48 h,BCL-6组的细胞增殖指数显著高于对照组与空载组(P 0. 05),BCL-6组的ROS水平均显著对照组与空载组(P 0. 05)。转染后48h,BCL-6组的GO/G1期比率、α-SMA蛋白相对表达量显著低于对照组与空载组(P 0. 05),S期比率、BCL-6蛋白相对表达量显著高于对照组与空载组(P 0. 05)。对照组与空载组对比差异无统计学意义(P 0. 05)。结论 BCL-6可抑制血管平滑肌细胞α-SMA蛋白的表达,抑制细胞周期由G2期向M期转变,激活氧化应激反应,从而促进细胞增殖。     

miR-133b表达在肝癌发生、发展中作用研究

目的 探讨miR-133b在肝癌发生、发展中的作用.方法 收集2016—2018年经病理证实为肝癌病变组织标本106例纳入肝癌组织组,同时,收集其相应癌旁组织(距离癌灶边缘>2 cm)标本纳入为癌旁组织组.实时定量聚合酶链式反应检测肝癌、癌旁组织及LO2、HB-611、BEL-7402、Hep3b、SMMC-7721、HepG2等细胞株中miR-133b表达情况.体外培养SMMC-7721、HepG2细胞,应用细胞转染技术上调肝癌细胞中miR-133b表达,并将其分别随机分为mimic-133b转染组(细胞转染mimic-133b)和mimic-NC转染组(细胞转染mimic-NC).CCK-8法检测细胞增殖能力.创伤愈合法检测细胞迁移能力.transwell小室法检测细胞侵袭能力.免疫印迹法检测肝癌细胞中结缔组织生长因子(CTGF)表达变化.结果 106例肝癌患者组织中,82例肝癌组织内miR-133b表达水平明显低于正常癌旁组织(P<0.05).HB-611、Hep3b、SMMC-7721和HepG2细胞中miR-133b表达水平较LO2细胞明显降低(P<0.05).BEL-7402细胞中miR-133b表达水平与LO2细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05).mimic-133b转染组细胞miR-133b表达水平显著高于mimic-NC转染组,增殖能力明显低于mimic-NC转染组,迁移能力明显弱于mimic-NC转染组,侵袭能力明显弱于mimic-NC转染组,CTGF表达水平明显低于mimic-NC转染组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 miR-133b可能通过下调CTGF表达来抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭等,进而抑制肝癌的发生、发展.     

miR-21对肝癌细胞Keap-1/Nrf2通路的调控作用分析

目的探讨miR-21对肝癌细胞Keap-1/Nrf2通路的调控作用。方法人肝癌细胞株HSMMC-7721随机分为三组,实验组、对照组分别转染miRNA-21模拟剂(mimics)、miRNA-21 NC,空白组不进行转染。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪实验检测细胞周期,Transwell小室实验检测细胞侵袭,Western blot检测蛋白表达。结果转染后36 h与48 h,实验组的miRNA-21相对表达量显著高于空白组和对照组(P 0. 05),实验组的细胞增殖率、侵袭率显著低于空白组和对照组(P 0. 05);转染后48 h,实验组的S期与G2/M期比率显著高于空白组和对照组,(P0. 05),GO/G1期比率显著低于空白组和对照组,(P 0. 05),空白组和对照组对比差异无统计学意义(P 0. 05)。转染后36 h与48 h,与空白组和对照组相比,实验组的Keap-1、Nrf2蛋白相对表达量显著下降(P 0. 05)。结论miRNA-21高表达能抑制Keap-1/Nrf2通路的激活,可调节肝癌细胞周期,从而抑制肝癌细胞的增殖与侵袭。     

miR-543调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭的机制分析

目的探讨与分析miR-543调控肾透明细胞癌(CCRCC)细胞增殖和侵袭的机制。方法 CCRCC细胞系ACHN随机分为三组:空白组、阴性对照(NC)组与miR-543组,NC组与miR-543组分别转染照NC与miR-543模拟剂,空白组不进行转染。MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell检测细胞转移与侵袭比率,Western blot检测蛋白表达水平。结果转染后24 h与48 h,与NC组与空白组相比,miR-543组的细胞增殖抑制率显著增加(P0. 05),细胞凋亡率显著增加(P 0. 05),细胞转移与侵袭相对数显著降低(P 0. 05),SDF-1、CXCR7蛋白相对表达量显著降低(P 0. 05),NC组与空白组比较差异无统计学意义(P 0. 05)。且miR-543对细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞转移与侵袭、SDF-1和CXCR7蛋白相对表达量的影响均不具有时间依赖性。结论 miR-543能抑制调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,且不具有时间依赖性,其作用机制可能与抑制SDF-1/CXCR7表达有关。     

miR-133b在前列腺癌中的表达及其对肿瘤细胞增殖的影响

目的检测miR-133b在前列腺癌患者癌组织中的表达水平及其对前列腺癌细胞增殖的影响。方法提取30例手术切除的前列腺组织癌和配对癌旁组织中的总RNA,并逆转录为c DNA,实时荧光定量PCR检测癌组织及癌旁组织中miR-133b的表达水平,并分析其与患者临床病理参数之间的相关性;用脂质载体将miR-133b模拟物转染入PC-3细胞中,检测PR结构域结合因子16(PRDM16)表达情况;CCK8实验检测转染miR-133b模拟物后PC-3细胞增殖变化情况。结果前列腺癌组织中miR-133b的表达水平(16.85±0.939)×10~(-4)低于癌旁组织(22.95±1.567)×10~(-4),差异有统计学意义(t=3.335,P0.01)。PC-3细胞转染miR-133b模拟物后,模拟物转染组中PRDM16表达水平较对照组明显降低,差异有统计学意义(0.371±0.031vs 1.000±0.022,t=12.53,P0.01);转染miR-133b模拟物72 h后,模拟物转染组的PC-3细胞增殖能力低于阴性对照组,差异有统计学意义(t=6.811,P0.01);而PRDM16抑制剂转染PC-3细胞72 h后的细胞增殖能力也低于阴性对照组(t=9.048,P0.01)。结论 miR-133b在前列腺癌组织中的表达下调,其可能通过PRDM16控制前列腺肿瘤细胞增殖。     

长链非编码RNA MALAT1对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制

目的探究长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子1(MALAT1)对口腔鳞癌细胞(OSCC)的增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法转染小干扰MALAT1(si-MALAT1)至TSCCA细胞分为空白组、si-NC组、siMALAT1组;转染小干扰对照(si-NC)、si-MALAT1、抑制剂对照(inhibitor-NC)、miR-218inhibitor至TSCCA细胞分为空白组、si-NC+inhibitor-NC组、si-MALAT1+inhibitor-NC组、si-NC+miR-218inhibitor组、si-MALAT1+miR-218inhibitor组。qRT-PCR、WB法检测MALAT1、miR-218、Fbxw8表达; MTT法检测细胞增殖情况;平板细胞克隆形成试验检测菌落形成; Transwell检测细胞迁移、侵袭能力;荧光素酶活性检测MALAT1、miR-218、Fbxw8三者靶向调控关系。结果与正常HIOE细胞系相比,TSCCA细胞系中MALAT1、Fbxw8表达均升高,miR-218表达均降低(P 0. 05)。与空白组、si-NC组相比,si-MALAT1组MALAT1表达、细胞菌落、迁移、侵袭数量降低,miR-218表达、细胞抑制率升高,差异均有统计学意义(P 0. 05)。在MALAT1 3'UTR-Mut细胞中,miR-218 mimis组荧光素酶活性低于miR-218NC组(P 0. 05)。与空白组、si-NC+inhibitor-NC组、si-MALAT1+miR-218inhibitor组相比,si-NC+miR-218inhibitor组MALAT1表达、菌落、细胞侵袭、迁移数量、Fbxw8蛋白表达升高,miR-218表达降低; si-MALAT1+inhibitor-NC组MALAT1表达、菌落、细胞侵袭、迁移数量、Fbxw8蛋白表达降低,miR-218表达升高(P 0. 05)。在Fbxw83'UTR-Mut细胞中,miR-218 mimis组荧光素酶活性低于miR-218 NC组(P 0. 05)。结论在OSCC中MALAT1、Fbxw8表达上调,miR-218表达下调,MALAT1可能通过miR-218介导Fbxw8调控OSCC的增殖、迁移和侵袭。     

miR-208b对小鼠HL-1房颤细胞钙超载的影响及其机制分析

目的探讨miR-208b对小鼠HL-1房颤细胞钙超载的影响,并分析其作用机制。方法将小鼠HL-1心房肌细胞随机分为3组:对照组、起搏组和miR-208b组。后两组建立快速起搏HL-1房颤细胞模型,然后将miR-208b模拟物转染至miR-208b组细胞,将模拟物阴性对照转染至起搏组细胞,对照组不处理。全细胞膜片钳技术检测动作电位时程(APD)及L型钙电流(I_(Ca,L))的电流密度,实时荧光定量PCR及Western Blot检测钙通道蛋白mRNA及蛋白的表达。结果与对照组相比,起搏组和miR-208b组细胞中miR-208b表达显著增加(P 0. 05),且miR-208b组高于起搏组(P 0. 05)。与对照组相比,起搏组和miR-208b组APD50、APD90、I_(Ca,L)的电流密度、CACNA1C mRNA、CACNB2 mRNA、CaV1. 2蛋白、SERCA2 mRNA及SERCA2蛋白的表达均显著降低(P 0. 05),且miR-208b组低于起搏组(P 0. 05)。结论 miR-208b在小鼠HL-1房颤细胞中高表达,其可通过抑制L型钙通道蛋白的表达和功能以及抑制肌浆网Ca~(2+)摄入,导致胞内Ca~(2+)超载,诱发AF。     

Sox1过表达对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭及Wnt通路的影响

目的研究性别决定区域Y盒1(Sox1)过表达对口腔鳞癌细胞增殖、迁移以及Wnt通路的影响。方法荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测人正常口腔组织细胞系及口腔鳞癌细胞系HN4中Sox1 mRNA表达。采用Lipofectamin 2000试剂进行转染,分为三组:空白组、Sox1 NC组、Sox1 mimics组,每孔别按照不添加、0. 7μl 20μmol/L的p CMV6空载体、0. 7μl 20μmol/L的p CMV6-Sox1的水平加入相应试剂。检测Sox1 mRNA和蛋白水平,通过MTT试剂盒检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭能力,免疫印迹(Western blot)法检测Wnt通路相关蛋白表达水平。结果与正常细胞相比,口腔鳞癌细胞中Sox1 mRNA、Sox1蛋白表达水平显著降低(P 0. 05);空白组与Sox1 NC组Sox1 mRNA、蛋白表达差异无统计学意义(P 0. 05),与空白组、Sox1 NC组相比,Sox1 mimic组Sox1 mRNA、蛋白表达显著升高(P 0. 05); MTT试验显示,Sox1 NC组与空白组相比,0 h、24 h、48 h、72 h、96 h,OD值差异无统计学意义(P0. 05),与Sox1 NC组和空白组相比,Sox1 mimic组转染后72 h后OD值显著降低(P 0. 05); Western blot检测结果显示,空白组与Sox1 NC组相比Wnt、GSK-3β、β-Catenin、cyclin D1蛋白表达无显著差异(P 0. 05),与空白组、Sox1 NC相比,Sox1 mimic组Wnt、β-Catenin、cyclin D1蛋白表达明显下降(P 0. 05),GSK-3β表达量上升(P 0. 05)。结论口腔鳞癌组织中Sox1低表达,Sox1过表达通过Wnt通路降低口腔鳞癌细胞增殖、侵袭能力。     

miR-30b在膀胱癌中表达的临床意义及对膀胱癌细胞生物学特性影响研究

目的探讨miR-30b在膀胱癌组织细胞中的表达及临床意义,并研究其对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响。方法采用实时定量PCR检测32例膀胱癌及癌旁非肿瘤组织中miR-30b的表达水平,采用外源性转染使miR-30b水平上调,研究miR-30b水平上调对膀胱癌T24细胞的增殖、侵袭、凋亡等生物学特性的影响。结果肿瘤组织中miR-30b的表达水平低于癌旁组织(P 0. 05),临床分期与miR-30b的表达水平差异无统计学意义(P 0. 05);转染miR-30b的T24细胞在48 h内的存活率及侵袭数均低于阴性对照组(P 0. 05)。结论 miR-30b水平与膀胱癌的发生发展可能有关,miR-30b导入膀胱癌细胞后,能够显著抑制癌细胞的侵袭能力,加速癌细胞的凋亡。     

miR-1调控胃癌细胞SGC-7901迁移能力的实验研究

目的探讨微小RNA-1(miR-1)对胃癌细胞系SGC-7901迁移能力的调控作用。方法脂质体转染寡核苷酸片段NCmimics及miR-1-mimics、NC-inhibitor及miR-1-inhibitor至SGC-7901细胞,定量RT-PCR检测转染后SGC-7901细胞中miR-1的表达水平,Transwell实验观察转染后细胞迁移能力,western blot检测转染后细胞上皮间质转化(EMT)指标。结果miR-1-mimics转染组miR-1的表达水平(900.10±240.40)明显高于NC-mimics转染组(1.01±0.18),差异有统计学意义(t=6.48,P0.01)。miR-1-inhibitor转染组miR-1的表达水平(0.65±0.04)明显低于NC-inhibitor转染组(1.01±0.14),差异具有统计学意义(t=4.19,P0.05)。miR-1-mimics转染组迁移细胞数量[(362±10)个]明显高于NC-mimics转染组[(112±10)个],差异有统计学意义(t=21.65,P0.01)。miR-1-inhibitor转染组迁移细胞数量[(64±8)个]明显低于NC-inhibitor转染组[(133±14)个],差异有统计学意义(t=17.07,P0.01)。与NC-mimics转染组比较,miR-1-mimics转染组上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)表达减弱(t=19.28,P0.01),神经钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达增强(t=5.43,P0.01;t=23.14,P0.01);与NC-inhibitor转染组比较,miR-1-inhibitor转染组E-cadherin表达增强(t=6.14,P0.01),N-cadherin和Vimentin表达减弱(t=6.78,P0.01;t=7.94,P0.01)。结论 miR-1过表达可促进胃癌细胞的迁移;miR-1低表达能可抑制胃癌细胞的迁移;miR-1可能通过EMT转化增强胃癌细胞的迁移能力。     

上调miRNA-22表达对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭的影响及与VEGF和P53蛋白表达的关系研究

目的研究上调miRNA-22表达对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭的影响及与血管内皮生长因子(VEGF)和P53蛋白表达的关系。方法前瞻性收集新疆维吾尔自治区人民医院的卵巢癌组织标本112例(A组)、卵巢癌旁组织标本85例(B组)及正常卵巢组织标本75例(C组)。采用实时荧光定量PCR法对三组标本中的miRNA-22表达量进行检测。将卵巢癌SKOV-3细胞株分为转染miRNA-22-mimic(转染组)、miRNA-22-NC(空白载体组)及正常对照组。采用实时荧光定量PCR法对各组细胞中的miRNA-22表达量进行测定,通过Transwell小室法对各组细胞的侵袭能力进行检测,并用Western blot法对各组细胞中的P53及VEGF蛋白表达情况进行检测。结果 A组miRNA-22表达量较B、C组均明显下降(P 0. 05),而B、C组miRNA-22表达量的比较,并无显著差异(P 0. 05)。相比正常对照组与空白载体组,转染组细胞中的miRNA-22表达量明显升高(P 0. 05),而正常对照组与空白载体组细胞中miRNA-22表达量的比较,无显著差异(P 0. 05)。Transwell小室法检测结果发现,转染组卵巢癌SKOV-3细胞株侵袭能力较正常对照组与空白载体组明显减弱(P 0. 05),而正常对照组与空白载体组侵袭细胞数的比较,无显著差异(P 0. 05)。Western blot法检测结果发现,转染组细胞中P53和VEGF蛋白表达水平较正常对照组与空白载体组明显下降(P 0. 05),而正常对照组与空白载体组细胞中P53和VEGF蛋白表达水平的比较,无显著差异(P 0. 05)。结论上调miRNA-22表达可起到阻滞卵巢癌SKOV-3细胞株侵袭的作用,其机制可能与P53和VEGF蛋白表达水平下降密切相关。     

miR-34a-3p通过靶基因YAP1调控黑色素瘤A375细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR-34a-3p通过靶基因YAP1调控黑色素瘤A375细胞的增殖和凋亡。方法通过荧光定量PCR检测miR-34a-3p在黑色素瘤和正常皮肤组织中的表达,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-34a-3p的靶基因,黑色素瘤A375细胞转入miR-34a-3p模拟剂(miR-34a-3p mimics组),转入对照物miR-NC(对照组miR-NC),miR-34a-3p mimics组转染YAP1表达载体(miR-34a-3p mimics+YAP1组)。通过MTT和流式细胞术分别检测miR-34a-3p和YAP1对黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响,并通过Western blot检测miR-34a-3p对YAP1蛋白表达的影响。结果黑色素瘤组中的miR-34a-3p的表达量(0. 67±0. 21)低于正常皮肤组织(1. 35±0. 47),差异具有统计学意义(P 0. 05)。双荧光素酶报告基因显示,miR-34a-3p mimics与YAP1 3'UTR WT载体共转染组荧光强度(0. 39±0. 11)明显低于对照miR-NC与WT载体共转染组(0. 98±0. 35),差异具有统计学意义(P 0. 05)。而miR-34a-3p mimics与YAP1 3'UTR MUT载体共转染组(1. 31±0. 23)与其对照miR-NC与MUT载体共转染组(1. 22±0. 21)之间的荧光强度无显著差异(P 0. 05)。在培养24 h、48 h和72 h后,miR-34a-3p mimics组细胞细胞活力低于对照组miR-NC,差异具有统计学意义(P 0. 05); miR-34a-3p mimics+YAP1组细胞活力高于miR-34a-3p mimics组,差异具有统计学意义(P 0. 05)。miR-34a-3p mimics组细胞的凋亡率高于对照组miR-NC,差异具有统计学意义(P 0. 05)。miR-34a-3p mimics+YAP1组细胞凋亡率低于miR-34a-3p mimics组,差异具有统计学意义(P 0. 05)。与对照组miR-NC比,miR-34a-3p mimics组细胞的YAP1蛋白表达量显著降低,cleaved caspase 9表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P 0. 05)。而与miR-34a-3p mimics组比较,miR-34a-3p mimics+YAP1组细胞凋YAP1蛋白表达量显著增加,cleaved caspase 9表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P 0. 05)。结论miR-34a-3p能够通过调控靶基因YAP1的表达,抑制黑色素瘤A375细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

C／EBPα-Per2信号通路对K562细胞相关基因的调控机制

目的：探索Per2在CCAAT增强子结合蛋白α（C／EBPα）参与调控的慢性粒细胞白血病（CML）发生、发展中的作用。方法通过脂质体介导将真核表达载体pGenesil-3-SiPer2和空载体pGenesil-3-HK转染到pEGFP-C／EBPα-K562细胞,利用新霉素筛选稳定干扰Per2的pEGFP-C／EBPα-K562单克隆细胞株。利用 RT-PCR 和 Western blot 分别检测转染组、空载组、对照组细胞p53、c-myc 、cyclinB1的mRNA及蛋白表达水平的改变。结果成功构建稳定干扰Per2表达的pEGFP-C／EBPα-K562细胞株。与对照组和空载组细胞相比,转染组pGenesil-3-SiPer2-K562细胞的p53 mRNA及蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0．01）,而cyclinB1和c-myc基因的mRNA及蛋白表达水平则显著升高,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 Per2基因在C／EBPα参与调控的CML发生发展中起重要作用,该通路的发现对于研究CML的发生及调控机制具有重要意义。     

长链非编码RNA HOTAIR靶向调控miR-206对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA HOTAIR对人胃腺癌细胞(AGS)增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测正常胃上皮细胞(GES-1)与胃癌AGS细胞中HOTAIR的表达水平,以及si-RNA HOTAIR(si-HOTAIR)转染胃癌AGS细胞后HOTAIR及微小RNA-206(miR-206)的表达水平。生物信息学预测HOTAIR与miR-206的结合位点,荧光素酶报告实验验证二者靶向关系。将细胞分为对照组、si-HOTAIR组、si-HOTAIR+miR-206抑制剂组,采用CCK-8、平板克隆形成实验检测各组细胞的活性和增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平,免疫印迹实验检测相关抗凋亡蛋白CDK9的表达水平。结果与正常人胃黏膜上皮GES-1细胞相比,AGS细胞中HOTAIR的表达量显著增高(P 0. 001),miR-206的表达水平显著降低(P 0. 01)。转染si-HOTAIR的AGS细胞中HOTAIR表达量显著降低(P 0. 01),miR-206表达水平显著增高(P 0. 01)。实验结果显示,miR-206模拟物(miR-206 mimics)能显著降低野生型HOTAIR质粒的荧光素酶活性(P 0. 01)。与对照组相比,si-HOTAIR组细胞增殖能力显著降低,凋亡能力显著提高(P 0. 001);与si-HOTAIR组相比,si-HOTAIR+miR-206抑制剂组细胞增殖能力显著增高,凋亡能力显著降低(P 0. 01)。实验结果显示,si-HOTAIR能显著降低CDK9的蛋白水平表达,miR-206抑制剂能显著减弱si-HOTAIR对CDK9表达的抑制作用。结论 HOTAIR能通过靶向调控miR-206促进胃癌细胞的增殖,抑制胃癌细胞的凋亡。     

microRNA-206对低氧诱导心肌细胞凋亡的作用及其可能机制

目的探讨microRNA-206(miR-206)在低氧诱导的原代心肌细胞凋亡中的作用及可能的作用机制。方法将心肌细胞分成六组,正常组、低氧组、miR-206模拟物组、miR-206模拟物-NC组、miR-206抑制剂组和miR-206抑制剂-NC组,其中正常组心肌细胞未转染,正常培养,低氧组心肌细胞未转染,经过低氧处理,miR-206模拟物组、miR-206模拟物-NC组心肌细胞经低氧处理后分别转染miR-206模拟物及其阴性对照序列,miR-206抑制剂组和miR-206抑制剂-NC组心肌细胞在低氧处理后分别转染miR-206抑制剂及其阴性对照序列。设置不同低氧处理时间(0 h、12 h、24 h和48 h)处理心肌细胞,同时正常组细胞正常培养,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况,qRT-PCR检测miR-206表达情况,采用流式细胞术、免疫组化检测和Western blot法检测细胞凋亡情况。MTT检测六组心肌细胞增殖变化情况,流式细胞术检测细胞凋亡改变情况,qRT-PCR检测表皮生长因子受体(EGFR)-低氧诱导因子1α(HIF-1α)信号通路mRNA表达情况,Western Blot检测EGFR-HIF-1α信号通路蛋白表达情况。结果 MTT结果显示心肌细胞随低氧处理时间增加增殖呈下降趋势,低氧处理24 h和48 h细胞增殖显著低于正常组(P 0. 05);免疫组化检测结果可知,低氧诱导48 h后,心肌细胞内凋亡蛋白cleaved-caspas3显著增加;流式细胞仪检测结果可知低氧诱导24 h、48 h后细胞凋亡呈时间依赖性增加; Western blot鉴定并证实细胞凋亡相关蛋白表达增加及抗凋亡蛋白表达的下降;心肌细胞随低氧处理时间增加miR-206表达呈上升趋势,处理24 h和48 h的miR-206表达量显著高于正常组(P 0. 05)。miR-206模拟物转染组细胞增殖显著增加,凋亡明显下降,miR-206抑制剂组增殖显著下降,凋亡显著增加(P 0. 05)。qRT-PCR法检测发现干扰后各组EGFR、HIF-1α和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的mRNA水平无变化,但Western blot结果显示miR-206模拟物组较其阴性对照组EGFR和HIF-1α蛋白表达水平降低,而miR-206抑制剂组较其阴性对照组EGFR和HIF-1α蛋白表达水平升高。结论 MiR-206在缺氧的心肌细胞中会异常增高,高表达的miR-206可通过负调控EGFR-IGF-1-HIF-1α信号通路影响心肌细胞的增殖和凋亡。     

核PTEN诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨核PTEN外源性表达对人胃癌细胞株凋亡的影响。方法从4种人胃癌细胞(人胃癌细胞AGS、HGC-27、MGC803和SGC-7901)中通过定量PCR选取低表达PTEN胃癌细胞株,通过构建核PTEN过表达慢病毒和阴性对照病毒载体,转染至低表达PTEN的胃癌细胞株,荧光法检测转染情况,应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果筛选PTEN表达低的HGC-27胃癌细胞株,构建PEGFP-NLS-PTEN载体,转染至HGC-27胃癌细胞,核内荧光效率接近100%,进行细胞凋亡检测发现,核PTEN过表达组(OE组)细胞凋亡数明显增多,相比阴性对照组(NC组)差异具有统计学意义(P 0. 05)。结论将携带NLS-PTEN基因的重组病毒LV-PTEN感染胃癌细胞株后,核内表达充分,核PTEN外源性表达影响胃癌细胞株的凋亡。     

HIF-1α对K562细胞血管生成相关因子的影响

目的:通过在K562细胞过表达和干扰HIF-1α后检测K562细胞分泌血管生成相关因子的水平,探讨慢性白血病血管生成的机制。方法:应用携带和干扰HIF-1α基因的慢病毒转染K562细胞,将转染携带和干扰HIF-1α基因的K562细胞分别纳入过表达组、干扰组,同时以空载病毒转染K562细胞纳入对照组。3组细胞在常氧状态下培养72 h后收集细胞,通过荧光显微镜观察3组转染效率,采用RT-PCR法检测HIF-1α和血管相关生成因子mRNA表达水平,ELISA法检测培养上清中血管相关细胞因子的浓度。结果:慢病毒转染K562细胞最佳转染复数(MOI)为10,转染效率为50%左右;经过嘌呤霉筛选后转染阳性细胞达90%以上。干扰组ANG-I、ANG-II、TGF-α和VEGF mRNA表达均低于过表达组,而干扰组TGF-β1 mRNA表达高于过表达组。干扰组ANG-I、VEGF mRNA表达低于对照组;培养上清中未检测到TGF-α,干扰组ANG-I和TNF-α水平低于过表达组,而干扰组VEGF水平高于过表达组;过表达组和干扰组TGF-β1水平均低于对照组,过表达组VEGF水平低于对照组,干扰组VEGF水平高于过表达组和对照组,上述差异具有统计学意义(P 0.05)。结论:通过嘌呤霉素筛选获得慢病毒转染K562细胞阳性细胞,HIF-1αmRNA正向调控K562细胞ANG-1、ANG-2、TGF-α、VEGF mRNA的表达,促进ANG-I和TNF-α自身分泌的能力,而不刺激TGF-α的自分泌,HIF-1α上调可抑制K562细胞TGF-β1的表达并抑制TGF-β的自分泌。