TGF-β1在低氧诱导肺动脉内皮细胞向平滑肌样细胞转分化中的作用

目的研究低氧条件下肺动脉内皮细胞（PAEC）向平滑肌样细胞的转分化及转化生长因子β1（TGF—β1）在此转分化过程中的作用。方法将经免疫磁珠法（用血小板内皮细胞粘附分子1做免疫分选标记）纯化后的原代肺动脉内皮细胞分别在常氧（含21％O2、5％CO2、74％N2）和低氧（含1％O2、5％CO2、94％N2）条件下培养1、4、7d，用核酸干扰法（RNAi）阻断TGF—β1的表达，用逆转录-聚合酶链式反应法（RT—PCR）和Western blot分别检测各组细胞TGF—β1 mRNA和蛋白的表达，并用免疫细胞化学法检测平滑肌细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α—SM—actin）的表达，结合形态学观察从而判定有无平滑肌样细胞的转分化。结果低氧可增加肺动脉内皮细胞TGF—β1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．05），RNAi沉默TGF—β1基因表达后可明显降低其mRNA和蛋白含量（P〈0．05），随着低氧培养时间的延长，肺动脉内皮细胞转分化为平滑肌样细胞的比率逐渐增加（P〈0．05）；阻断TGF—β1表达后，平滑肌样细胞的转化率明显降低（P〈0．05）。结论肺动脉内皮中存在具有转分化为平滑肌样细胞潜能的细胞；低氧可明显促进转分化，TGF-β1在此转分化过程中起重要作用。     

HIF-1α在低氧刺激的气道平滑肌细胞中的表达及意义

目的:观察低氧状态下大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)增殖情况及低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表达变化,探讨ASMC低氧反应机制?方法:体外传代(5代)培养大鼠ASMC分3组:常氧状态下培养为正常对照组(A组),低氧状态下培养为单纯低氧组(B组),低氧 + HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME)为低氧2ME干预组(C组)?甲基甲苯基硫(MTS)法检测细胞增殖,荧光实时定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达,Western blot检测HIF-1α蛋白表达?结果:①大鼠ASMC增殖B组比A组更加明显(1.123 ± 0.006 vs 0.809 ± 0.003,P < 0.05),C组较B组明显受抑制(1.012 ± 0.005 vs 1.123 ± 0.006,P < 0.05);②HIF-1α mRNA和蛋白表达B组比A组表达明显增加(5.265 ± 0.040 vs 0.449 ± 0.017,P < 0.05和0.905 ± 0.013 vs 0.105 ± 0.008,P < 0.05),C组较B组表达明显减少(1.903 ± 0.044 vs 5.265 ± 0.040,P < 0.05和0.278 ± 0.012 vs 0.905 ± 0.013,P < 0.05)?ASMC增殖与HIF-1α mRNA表达呈正相关(r = 0.850),与HIF-1α蛋白表达呈正相关(r = 0.883)?结论:低氧刺激促进大鼠ASMC增殖,可能是由HIF-1α所介导?     

低氧对人胚肺成纤维细胞表型与增生的影响

采用单层细胞超薄切片技术和免疫细胞化学方法， 观察常氧（Ｎ）、低氧（Ｈ）、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液（ＮＥＣＣＭ 和ＨＥＣＣＭ） 等不同条件， 对肺血管外膜成纤维细胞的表型与增殖的影响。结果表明： （１） 仅ＨＥＣＣＭ 组成纤维细胞显示表型转变，胞浆内出现微肌丝、致密体、基膜等平滑肌细胞超微结构，粗面内质网明显减少；且此组细胞α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ） 表达较其余３ 组明显增高（Ｐ＜ ０． ０１）； （２） Ｈ 和ＨＥＣＣＭ 组增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ） 表达较Ｎ 和ＮＥＣＣＭ 组明显升高（Ｐ＜ ０． ０１）。结果提示： （１） 低氧可经肺动脉内皮细胞介导， 引起人胚肺成纤维细胞向平滑肌样细胞转化，而单纯低氧无此作用；（２） 低氧可直接或经内皮细胞介导，刺激人胚肺成纤维细胞增殖。     

低氧诱导猪肺动脉内皮细胞间质转化的鉴定及其生物学意义

目的原代培养猪肺动脉内皮细胞,探讨缺氧环境对肺动脉内皮细胞的影响,为肺部疾病提供体外研究模型。方法将猪原代肺动脉内皮细胞分为两组分别置于常氧和低氧环境中培养1、4和7 d,采用免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测各组细胞内皮细胞和间质细胞特异性标志蛋白及mRNA表达。结果常氧组肺动脉内皮细胞呈现典型的鹅卵石样排列,低氧培养的内皮细胞出现长梭形外观。免疫荧光法观察发现低氧培养的内皮细胞开始表达间质细胞抗原α-SMA,且随着低氧时间的延长,α-SMA表达量逐渐增多(P<0.01)。Western blot结果显示与常氧组相比,低氧组内皮细胞VE-cadhrein蛋白表达逐渐下降,α-SMA蛋白表达逐渐上升,RT-PCR结果与此一致。结论低氧促进内皮细胞向间质细胞转化,可能参与体内多种疾病的发生。     

低氧对肺血管周细胞转化生长因子TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响

应用细胞培养、核酸分子原位杂交、免疫细胞化学、图像分析技术研究低氧对肺血管周细胞转化生长因子TGF－β1mRNA及蛋白表达的影响,探讨低氧条件下肺血管周细胞增殖、向平滑肌样细胞分化的机制。结果发现低氧（H）组周细胞内TGF－β1mRNA及蛋白表达量分别是常氧（N）组的1．35倍和1．23倍,差异均有显著意义（均为P＜0．01）。研究表明,低氧可促进脉血管周细胞TGF－β1mRNA及蛋白表达增高。TGF－β1表达增高可能是低氧诱导肺血管周细胞增殖、向平滑肌样细胞分化的机制之一。     

Semaphorin 3A对低氧导致人肾小球内皮细胞转分化的影响

目的 探讨Semaphorin 3A对低氧导致人肾小球内皮细胞转分化的影响.方法 将人肾小球内皮细胞(HGECs)常氧组(21％ O2)、低氧组(1％O2)、低氧干预组(1％ O2+外源性Sema3A)培养5天后进行如下实验:(1)在倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;(2)用ELISA法检测细胞上清液中Sema3...     

α-硫辛酸对H9 c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其机制探讨

目的：探讨α-硫辛酸(α-LA)对H9c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制。方法研究包括H9 c2心肌细胞低氧实验和低氧/复氧实验两部分,分成常氧组、低氧组或低氧/复氧组、LA组、乙醛脱氢酶抑制剂异黄酮苷(Daidzin)组(Daidzin组)、二甲亚砜(DMSO)溶剂对照组( DMSO组)。采用噻唑蓝( MTT)比色法检测心肌细胞存活率;微量酶标法测定乳酸脱氢酶( LDH)活性;ELISA法检测心肌细胞乙醛脱氢酶2(ALDH2)活性;硫代苯巴比妥酸法检测丙二醛( MDA)水平。结果与常氧组比较,低氧组及低氧/复氧组细胞存活率均下降(P<0．01),LDH活性及MDA含量均升高(P<0．01);与低氧组或低氧/复氧组比较, LA组细胞存活率上升( P <0．01)、ALDH2活性增加( P <0．05)、LDH活性及MDA含量降低(P<0．01);LA组、Daid-zin组、DMSO组3组比较, LA组与DMSO组间存活率、AL-DH2、LDH、MDA比较差异均无统计学意义( P>0．05);Daid-zin组与LA组、DMSO组比较,细胞存活率及ALDH2活性降低(P<0．05),LDH活性及MDA含量升高(P<0．05),差异均有统计学意义( P<0．05)。结论α-LA可通过上调AL-DH2活性并减少过氧化终产物形成,最终减轻心肌细胞低氧及低氧/复氧过程中的氧化损伤。     

腺苷A2A受体基因敲除致小鼠肺动脉高压及低氧的诱导作用

目的 研究腺苷A2A受体基因敲除小鼠肺动脉压力变化、肺血管重构情况,及慢性低氧环境对其的影响,探讨A2A受体在肺动脉高压发生发展中的调节作用.方法 将A2A受体基因敲除小鼠(KO)及野生型小鼠(WT)随机分为常氧组和低氧组,低氧组置于低氧舱内(O2:9％～10％).2周后检测右心室收缩压(RVSP)、体循环压(SBP)、右心室/左心室加室间隔质量比(右心肥大指数)、肺组织HE染色、弹力纤维染色、透射电镜观察及免疫组化检测肺阻力血管平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况.结果 常氧环境下,与WT相比A2ARKO小鼠呈现:①RVSP升高,右心肥大指数增加;②肺阻力血管壁增厚,管腔减小;③血管壁PCNA阳性细胞增多,α-SMA表达增强;④肺细小动脉内皮细胞活化,平滑肌细胞、成纤维细胞肥大,胶原纤维大量沉积.低氧2周后,KO小鼠RVSP升高及肺阻力血管重构程度进一步加重.结论 A2AR在肺动脉高压及肺血管重构发生发展过程中起重要的调节作用,慢性低氧可诱导肺动脉高压及肺血管重构进一步加重.     

低氧培养的SW480细胞中NDRG1和MMP-2的表达

目的观察低氧对结肠癌SW480细胞中NDRG1、MMP-2蛋白表达的影响。方法分别在常规(常氧组)和低氧(低氧组)条件下培养结肠腺癌SW480细胞。运用免疫细胞化学染色法检测2组NDRG1蛋白表达,并用图像分析仪测光密度值(OD值);ELISA法检测MMP-2表达。结果低氧组细胞NDRG1呈强阳性表达,而常氧组表达较弱,低氧组细胞NDRG1蛋白表达水平(0．1634-4-0．0079)显著高于常氧组(0．1358±0．0027)(P<0．05);MMP-2表达也显著高于常氧组(P<0．01)。结论低氧诱导了SW480细胞NDRG1、MMP-2表达上调。     

慢性低氧大鼠肺动脉内皮素mRNA的表达及定位

目的：探讨慢性低氧大鼠肺动脉内皮素－1基因表达及分布。方法：采用生物素标记cRNA探针，对Wistar大鼠肺动脉进行原位杂交。结果：低氧1周组及低氧2周组大鼠大部分肺动脉内皮细胞ET－1mRNA表达呈阳性信号，而对照组大鼠仅极少数阳性信号（P＜0．01）；低氧1周组大鼠部分显示强阳性信号。低氧1周组及低氧2周组大鼠部分肺动脉平滑肌细胞呈现ET-1mRNA表达阳性信号，而对照组大鼠则无阳性信号表达（P＜0．01及0．05）。结论：慢性低氧对大鼠肺动脉ET－1分泌的影响是在基因转录水平进行，且主要细胞定位在肺动脉内皮细胞，此外还包括肺动脉平滑肌细胞。     

肺动脉内皮细胞缺氧时内皮型一氧化氮合酶基因表达的变化及蛋白激酶C亚型的作用

目的　研究蛋白激酶C(PKC)及其亚型对缺氧引起的肺动脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因表达变化的调控作用。方法　将原代培养的猪肺动脉内皮细胞置于缺氧 (5 %O2 )条件培养 2、6、12、2 4、4 8h ,用RT PCR的方法检测eNOSmRNA的含量。用蛋白质免疫印迹技术检测eNOS和 8种PKC亚型的表达水平。加入选择性PKC抑制剂BIMⅠ (1μmol/L)和G 6 983(1μmol/L) 后观察其对 5 %O2 所引起的eNOSmRNA水平变化的影响。采用瞬时转染的方法 ,通过荧光素酶报告基因实验检测eNOS基因转录起始点上游长 1 6kb启动子区域的活性。加入转录抑制剂放线菌素D后比较不同时间点常氧培养组和 5 %O2 培养组eNOSmRNA的含量。结果　 5 %O2培养 12h可使肺动脉内皮细胞eNOS表达增加 ,2 4h达高峰。缺氧 2 4h组eNOSmRNA和蛋白质水平分别是常氧组的 171%± 18% (P <0 0 1)和 16 6 %± 2 1% (P <0 0 5 )。BIMⅠ和G 6 983可抑制缺氧 2 4h引起的eNOSmRNA表达上调。缺氧时新型蛋白激酶Cε(nPKCε)发生了膜转位。报告基因实验表明 ,缺氧 2 4h肺动脉内皮细胞eNOS基因启动子活性明显增加 ,为常氧组的 (2 2 9± 0 73)倍。放线菌素D实验表明缺氧对肺动脉内皮细胞eNOSmRNA的稳定性无明显影响。结果表明 ,缺氧上调eNOSmRNA是由于基因转录增强     

硫化氢对低氧性肺动脉高压中氧化应激的调节作用

目的:探讨硫化氢(H2S)对低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)形成中氧化应激的调节作用.方法:选取体重180～200 g的健康雄性Wistar大鼠20只,随机分为对照组、低氧组、低氧+硫氢化钠(NaHS)组.建立低氧模型21 d后,监测其血液动力学变化;应用比色法检测肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、丙二醛(malondiadehyde, MDA)、羟自由基(hydroxy radical,[·OH)]的含量;应用实时荧光定量PCR的方法检测SOD基因转录水平的变化.结果:经3周低氧处理,大鼠形成HPH和肺血管结构重构,表现为平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)明显增加[(23.7 ±2.2) mm Hg vs. (16.3±3.7) mm Hg, P《 0.01],右室重量与左室及室间隔重量的比值[RV/(LV+SP)]升高(P《[ 0.01);]给予外源性H2S供体NaHS后,可以降低肺动脉压力[(16.3 ±2.8) mm Hg vs. (23.7 ±2.2) mm Hg, P《0.01],减少RV/(LV+SP) (P《0.01);H2S供体可以提高T-AOC 18.8%(P《0.01),减少GSSG的含量23.2%(P《[0.01)],但对SOD的活性及基因转录水平无明显影响.结论:H2S在HPH形成中的氧化应激过程中发挥抗氧化作用,其作用机制部分是通过减少GSSG的含量,从而提高机体的抗氧化能力.     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小片段干扰RNA(siRNA)对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z,并分成正常氧状态培养组(20%)和低氧(1%)培养组。采用脂质体(LF2000)将VEGFsiRNA转染两组细胞,并采用RT-PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGFmRNA和蛋白质表达的差异。结果与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达(P<0.01);正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下:未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为:423.92、419.68和328.86pg/mL;低氧状态下VEGF165的含量分别为:813.62、799.89和500.96pg/mL,转染VEGFsiRNA组VEGF的表达下调。结论VEGFsiRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGFmRNA和蛋白质的表达,因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

钙蛋白酶介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构

目的：研究钙蛋白酶(calpain)在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制。方法：SD大鼠随机分为低氧模型组和常氧对照组。插管法测定大鼠右心室收缩压及平均肺动脉压,右心室/(左心室+室间隔)比值评价右心肥厚指数,HE染色检测血管重构情况,分别采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测肺动脉calpain-1,-2和-4 mRNA和蛋白的表达。原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞分为4组：常氧对照组、常氧对照+ MDL28170(calpain抑制剂)组、低氧模型组、低氧模型+MDL28170组。MTS及流式细胞术观察细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测Ki-67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA) mRNA表达情况。结果：与常氧对照组大鼠比较,低氧模型组大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压及右心肥厚指数显著增加,肺动脉血管显著重构;同时,低氧模型组大鼠肺动脉中calpain-1,-2,-4 mRNA和蛋白表达也显著上调。与常氧对照组细胞比较,低氧模型组细胞显著增殖,MDL28170可显著抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,同时逆转低氧诱导的Ki-67和PCNA mRNA表达上调。结论：calpain介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构,其机制可能与介导低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖有关。     

Effects of 3, 4-Dihydroxyacetophenone on Cytosolic Calcium in Pulmonary Artery Endothelial and Smooth Muscle Cells during Acute Hypoxia

Summary: The effects of 3, 4-Dihydroxyacetophenone (3. 4-DHAP) on cytosolic free calcium[Ca^2 ], in pulmonary artery endothelia (PAECs) and smooth muscle cells (PASMCs) during acute hypoxia were studied. Porcine pulmonary artery endothelial and smooth muscle cells (PASMCs)were cultured primarily, and they were divided into 4 groups: groups incubated under normoxia or hypoxia and those with or without treatment with 3. 4-DHAP. The [Ca^2 ]i of both PAECs and PASMCs was measured by determining the fluorescence of fura 2 AM on spetrofluorometer. Our results showed that hypoxia caused significant elevation of [Ca^2 ]i. in both PAECs and PASMCs,3, 4-DHAP could attenuate the hypoxic elevation of [Ca^2 ]i only in PASMCs but not in PAECs. It is concluded that 3, 4-DHAP decreases the hypoxic elevation of [Ca^2 ]i in PASMCs. This might contribute to its inhibitory effect on hypoxic pulmonary vasoconstriction.     

内源性NO对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨内源性一氧化氮(NO)对低氧下离体肺动脉平滑肌细胞( PASMCs)增殖的影响.方法 原代培养Wistar大鼠PASMCs,分常氧组(21％O2,5％CO2)和低氧组(1％ O2,94％N2,5％ CO2)进行培养,分别应用非选择性一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NG-nitro-arginine methyl ester,L- NAME)进行干预,用细胞计数和四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖水平.结果 低氧下的肺动脉平滑肌细胞2天后明显增殖,与常氧组相比有显著性差异(P＜0.01),5天后细胞数达到峰值.L - NAME低氧干预组细胞增殖水平明显高于低氧组和常氧组(P＜0.01).结论 L-NAME抑制内源性NO的产生进而促进低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖.     

骨髓间充质干细胞对氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对缺氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用及可能机制。方法 分离培养成年大鼠MSC和乳鼠心肌细胞,将培养的乳鼠心肌细胞进行缺氧处理后,加入MSC或其条件培养液继续在无氧（95％N2＋5％CO2,持续缺氧组）或正常氧（缺氧／复氧组）条件下共培养72h,采用Hoechst细胞核染色,计算凋亡细胞百分率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果持续缺氧可以诱导心肌细胞凋亡,凋亡率为51．6％±2．4％,与MSC或其条件培养液共培养,心肌细胞凋亡率显著减低,分别为15．1％±5．4％和24．0％±4．2％（均P〈0．01）;缺氧／复氧损伤可以引起心肌细胞凋亡,凋亡率为20．9％±2．7％,心肌细胞与MSC共培养,凋亡率显著减低（11．5％±3．7％,P〈0．05）;心肌细胞与MSC条件培养液共培养,凋亡率略有减低（20．1％±4．2％,P〉0．05）。蛋白质免疫印迹显示凋亡时心肌表达Bax水平较高,与MSC或其条件培养液共培养时,Bax表达水平呈不同程度降低,与心肌细胞凋亡发生率减低一致,Bcl-2无明显变化。结论 MSC对体外缺氧诱导的心肌细胞的凋亡有保护作用,其作用机制可能是通过细胞间直接接触和旁分泌细胞因子,影响了Bcl-2家族部分蛋白分子在心肌细胞的表达。