量子点标记自杀基因靶向脂质体在肝癌诊治一体化中的应用研究

【目的】 自杀基因/前体药物系统抗肿瘤作用效果显著,但自杀基因肿瘤靶向识别性差而限制其临床应用。基于叶酸偶联脂质体(FL)的生物相容性及靶向性、量子点(QD)荧光标记的高灵敏性及光稳定性、HSV-tk自杀基因独特的旁观者效应,本研究拟开发多功能纳米载体-叶酸靶向量子点标记的HSV-TK基因脂质体(FL/QD-TK),并检测此载体系统在肝癌诊治一体化中作用。 【方法】 构筑FL/QD-TK并进行表征后,利用MTT法、激光共聚焦荧光显微镜、活体荧光成像仪及裸鼠移植瘤模型等方法对其体内外靶向性成像和治疗肝癌的作用及生物安全性进行研究。 【结果】 多功能纳米载体FL/QD-TK合成方法稳定,形貌均一,对叶酸受体高表达的Bel-7402肝癌细胞表现出较强的选择性杀伤作用,而对叶酸受体低表达的HepG2细胞靶向杀伤作用较弱。FL/QD-TK可实时示踪TK基因在Bel-7402荷瘤裸鼠体内的运输与分布,实现了在肿瘤部位的靶向富集,系统性给药并联合GCV取得了良好的抗肿瘤效果,同时对各脏器组织形态学和血清学指标无影响。 【结论】 新型多功能纳米载体FL/QD-TK可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,在体内可视化示踪TK基因治疗肿瘤并具备了较好的生物安全性,FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米药物有望应用于肝癌的诊治一体化。     

基于肝脏靶向的水飞蓟素固体脂质纳米粒的构建及评价

【立论依据】 肝纤维化及肝硬化是各种慢性肝病的最终共同转归,减缓或阻止肝纤维化进程是重要的治疗对策,开展抗纤维化治疗有重大意义。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化形成过程中发挥关键作用,是肝纤维化时ECM的主要来源细胞。因此,肝纤维化的主要效应细胞HSC成为抗纤维化治疗的“靶细胞”。临床上常用的水飞蓟素制剂为国产益肝灵片或德国进口的利肝隆胶囊剂,但由于水飞蓟素的低溶解性问题影响了其临床疗效,可采用固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)来提高难溶性药物的生物利用度和增加靶向性。本实验旨在探讨不同粒径分布的水飞蓟素固体脂质纳米粒载药体系的肝靶向性,并探讨水飞蓟素在TGF-β1刺激HSC-T6增殖中对TGF-β1/Smads信号转导通路的作用。 【设计思路】 (1)通过星点设计效应面法优化水飞蓟素固体脂质纳米粒的制备工艺并探讨粒径与靶向性之间的相关性;(2)体内实验观察该载药体系对肝纤维化的保护作用;(3)探讨水飞蓟素的抗肝纤维化的分子机制。 【实验内容】 以水飞蓟素为模型药物,制备固体脂质纳米粒,通过处方优化制备合适粒径的SIL-SLN并具备较好的趋肝性;复制肝纤维化动物模型,比较SIL与SIL-SLN的治疗作用;体外培养大鼠肝星状细胞评价细胞增殖情况;进行细胞凋亡与相关蛋白的表达的检测。 【材料】 AnnexinV FITC 试剂盒;ALT、AST试剂盒、TGF-β1、Smad2/3、Smad7等抗体。 【可行性】 前期采用Box-behenken效应面实验设计优化了水飞蓟素固体脂质纳米粒的处方,并对所制备的固体脂质纳米粒进行了形态表征,结果显示所制备的固体脂质纳米粒平均粒径在230 nm左右,为固体脂质纳米粒的应用提供了依据。 【创新性】 (1)构建不同粒径分布的固体脂质纳米粒载药体系,考察粒径与静脉注射吸收程度的相关信息,探讨肝靶向的影响因素。(2)研究载药固体脂质纳米粒在肝星状细胞的转运机理以及细胞转运与靶向性的内在联系,并通过药效学实验和分子水平检测进行验证,为中药抗肝纤维化药物新剂型开发提供实验依据。     

新型可显影复合栓塞微球的制备与评价

【立论依据】 我国肝癌发病率高,确诊时多为晚期,而且伴有严重的肝硬化,手术切除率低,迫切需要非手术治疗方法。化疗药物的疗效与肿瘤所在部位药物的有效血浓度及药物与肿瘤接触的时间呈正相关关系。而原发性肿瘤的血液供应90%~95%来自肝动脉,这就为TACE(transcatheterarter arterial chemoembolization)治疗肝癌提供了解剖学基础。肝癌的局部化疗使肝癌组织内药物浓度高出常规给药的10~30倍,全身副作用明显减少,疗效增加。如能与栓塞结合,使肝癌组织缺血,则两者之间有协同作用。因此,TACE是对不能手术切除的肝癌最有效的治疗方法之一。鉴于TACE疗法在现今临床的治疗比重逐步提升,栓塞化疗开始在肝癌治疗中普及,我们认为研发一款成本较为低廉、更宜被人体耐受且能自带显影功能的栓塞微球,能够在肝癌介入治疗的广泛普及中起到重要的作用。 【设计思路】 利用水相油相互不相溶的原理,选取价格低廉的生物医学上常用的胶质明胶和卡拉胶,以油-水-油结构制备可显影复合栓塞微球,并通过原位家兔肝癌模型评价栓塞微球的疗效。 【实验内容】 (1)制备结构为油-水-油/水,对应功能为稳定隔水-塑型载药-显影的两种带有不同显影剂和不同复合水溶胶的三相栓塞微球;(2)体外测定栓塞微球的性能:包括载药率、溶胀率、显影强度、生物利用率以及体外释药曲线;(3)建立原位家兔肝癌模型;(4)进行栓塞微球TACE试验,观察家兔肿瘤变化及存活率,进行体内栓塞微球自然降解时间、释药曲线、家兔对微球排异反应强度等的测定,并根据动物试验情况对栓塞微球的制备条件进行微调整。 【材料】 明胶、卡拉胶、石蜡、乳化剂、交联剂、脱水剂、碘化物显影剂。 【可行性】 (1)前期实验基础:已成功研制出油-水-油相微球,并且进行了多次载药率、溶胀率的测定,并将微球直径筛分成0~200 μm、200~300 μm、300~450 μm、450~1 200 μm四组微球。(2)实验平台:纳米生物纳米材料江苏省重点实验室。 【创新性】 本研究制备的具有自主知识产权新型可显影复合栓塞微球,成本低廉、自备显影功能、为人体可降解材料,具有一定的临床应用前景。     

靶向肿瘤干细胞的双模态分子探针的制备与表征

【立论依据及设计思路】 肿瘤干细胞具有无限自我更新能力,与肿瘤的生长、转移和复发具有密切联系。CD133是目前研究最为广泛的肿瘤干细胞表面特异性标志物。前期研究结果已经证实胰腺癌组织与细胞中均存在CD133⁺肿瘤干细胞。本设计以胰腺癌干细胞为着眼点,以其特异性标志物CD133 为靶点,制备表面耦连抗CD133单克隆抗体, 以稀土上转换发光纳米材料(UCNPs)、顺磁氧化铁(SPIO)为显像剂,涵盖MRI和光学两种成像信号的多模态分子影像探针,并通过体内外实验验证其生物安全性及靶向性。 【实验内容】 (1)改良化学共沉淀法制备SPIO并通过修饰将二羧基PEG连接到表面;(2)热分解及配体交换法制备UCNPs并修饰;(3)通过SPIO表面羧基与UCNPs表面氨基的酰胺化反应,制备SPIO/UCNPs复合纳米材料;(4)MTT,溶血实验、微核实验、半数致死量实验等评价 SPIO/UCNPs的生物安全性;(5)酰胺化反应将抗CD133抗体耦联到SPIO/UCNPs纳米复合物表面,得到最终的双模态探针;(6)双模态分子影像探针(CD133mAb-SPIO/UCNPs)的表征及亲和力、体内代谢、体内分布、体内外靶向实验。 【材料】 氯化钇、氯化镱、氯化铒、正硅酸四乙酯、氟化铵、聚丙烯酸、CD133抗体、二羧基聚乙二醇、十六烷基三甲基溴化铵、人胰腺癌细胞系PANC-1、NOD-SCID小鼠。 【可行性】 (1)前期工作:已熟练掌握UCNPs及SPIO的制备与修饰方法,并已完成SPIO/UCNPs复合纳米材料的制备及部分生物安全性评价实验。(2)实验平台:依托教育部分子影像重点实验室。 【创新性】 (1)利用多模态分子影像技术追踪肿瘤干细胞,是一种可以在活体条件下进行的、无创、动态、高分辨率的特异性靶向检测方法,为肿瘤的早期诊断、治疗决策、疗效监测、预后评估等问题提供了新的解决思路;(2)经文献查新检索,表面耦连抗CD133单克隆抗体, 以SPIO、UCNPs为显像剂,涵盖MRI和光学两种成像信号的双模态分子影像探针,国内外未见报道。     

靶向/促穿膜双功能肽介导的肿瘤靶向基因递送系统的构建及其抗肿瘤作用研究

【立论依据】 基因治疗(gene therapy)现已成为攻克肿瘤最具潜力,也是研究最活跃的领域,许多学者为基因治疗能成功应用于临床进行了大量相关研究。要成功地实施基因治疗,必须具备3个关键因素:针对性的治疗基因;基因传递系统;基因表达调节系统。基因传递系统是基因治疗的核心技术,而转染效率与细胞毒性相矛盾、稳定性与穿膜能力相矛盾以及靶向性差,是基因递送系统存在的3个关键问题。本课题旨在为肿瘤的基因治疗寻找到一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的基因递药系统。 【设计思路】 首选通过将低分子量聚乙烯亚胺(LMW-PEI)连接到能形成单分子聚合物胶束的普朗尼克(Pluronic)表面,制得PEI衍生物;然后采用固相法合成兼具靶向和促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),其中DR5短肽对正常细胞无毒副作用、对肿瘤细胞具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性,TAT是具有促细胞穿膜作用的穿膜肽;再利用SMCC法将D21与Pluronic-PEI偶联,构建肿瘤靶向纳米基因载体递送系统(D21-Pluronic-PEI),并对其体内外性能进行评价。 【实验内容】 (1) Pluronic-PEI的合成,DNA/Pluronic-PEI纳米胶束的制备及其性能考察;(2) D21-Pluronic-PEI的构建及其性能考察; (3)载p53的靶向纳米非病毒基因给药系统 (p53/D21-Pluronic-PEI)的制备及其体内靶向特性和抗肿瘤效果评价 【材料】 分支状聚乙烯亚胺Pluronic 123 (Mw=2000 Da),DR5短肽,细胞穿膜肽TAT,p53等。 【可行性】 项目组有一定的专业基础,具有较强的创新意识和研究探索精神,具备开展该项目的素质与能力。该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,具有可靠的实施条件,可以保证该训练计划实施成效。项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题拟采用不同PO/EO比的Pluronic连接低分子量PEI,并在此基础上合成具有可实现肿瘤靶向和具促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),将其与所得的PEI衍生物偶联,得到高效、低毒的新型基因靶向载体系统 (D21-Pluronic-PEI),该研究国内外尚未见报道。(2)重组人p53腺病毒注射液已应用于临床,但该药选择的载体为病毒基因载体-5型腺病毒,本课题拟采用高效,低毒且可主动靶向肿瘤细胞的新型聚阳离子载体系统(D21-Pluronic-PEI)作为p53载体,拟为p53的应用开辟新途径,国内外未见相关报道,具有潜在的应用价值。     

壳聚糖耦联杂大环Cu(II)配合物的制备及其催化释放NO性能

【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。     

探讨苯并吲哚荧光标记的2-脱氧-D-葡萄糖的设计合成及其在肿瘤糖代谢的应用

【立论依据】 代谢改变是肿瘤的重要特征之一,其与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞无论在有氧或无氧条件下,均需通过糖酵解(glycolysis)途径吸收大量的葡萄糖产生能量,满足快速生长需求,肿瘤细胞的这一代谢特点是肿瘤细胞具有的普遍现象和规律,被称为Warbrug效应。基于上述效应和系列研究工作基础,采用光稳定性好的苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记并在体内外评价其对肿瘤的靶向成像能力,考察肿瘤在体内的转移情况及治疗效果,从而为肿瘤检测和评估治疗效果提供一个新型检测探针。 【设计思路】 在新型苯并吲哚类荧光探针光稳定好以及肿瘤组织中存在异常旺盛的无氧葡萄糖酵解现象的基础之上,将苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记,设计合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,探讨其在肿瘤糖代谢方面的应用。 【实验内容】 拟合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,采用NMR、IR光谱及质谱表征苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物的化学结构和纯度,测定其理化特性,细胞毒性、生物相容性和体外细胞的荧光成像性能,评价其在活体动物内的光学成像能力,并通过肿瘤组织的免疫荧光病理检查,证实在体内肿瘤组织位置。 【材料】 1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚,4-甲醛基苯甲酸,无水乙醇和醋酸铵,二氯甲烷,2-脱氧-D-葡萄糖。 【可行性】 前期研究和预实验结果表明苯并吲哚类荧光染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性, 而且在细胞内具有较强的荧光。这类染料的合成非常简单, 收率高,基于苯并吲哚类染料的荧光探针,并成功地将其用应用于活细胞荧光成像为本课题核心假设的提出奠定了重要的理论和实验基础。 【创新性】 新型的苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物:(1)光稳定性好;(2)可通过葡萄糖靶向介导作用,实现主动靶向介导内吞;(3)能够示踪肿瘤细胞是否发生转移及其治疗效果,是应用于检测动物实验肿瘤转移模型的最佳标记物。     

鳖甲煎丸含药血清对肝癌细胞Bel-7402增殖的影响及其可能机制

【立题依据及设计思路】 原发性肝癌是一种常见恶性肿瘤,探索行之有效的治疗方法,是一个亟待解决的问题。鳖甲煎丸是医圣张仲景所创,研究表明具有较好的抑制肝癌生长,防止肝癌转移的作用,但其机制不明。本实验拟观察鳖甲煎丸含药血清对肝癌Bel-7402细胞生长的影响,从细胞凋亡和肿瘤血管新生角度探讨其抗癌机制,为临床应用此方治疗肝癌提供理论与实验依据。 【实验内容】 (1)大鼠含药血清的制备;(2)MTT法检测不同剂量鳖甲煎丸含药血清对Bel-7402细胞增殖的影响;(3)流式细胞术检测含药血清对Bel-7402细胞凋亡情况;(4)蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、ERK1、p-ERK、JNK、p-JNK等相关凋亡蛋白含量的变化,探讨其影响MAPK信号通路传导,促进肿瘤细胞凋亡的作用机制;(5)蛋白质印迹法检测肿瘤细胞VEGF、Delta-4、NICD等蛋白表达变化,探讨鳖甲煎丸影响VEGF-D114-Notch信号通路传导,抑制肿瘤血管生成的作用机制。 【材料】 SD大鼠、胎牛血清、中药、5-FU、相关抗体等。 【可行性】 (1)鳖甲煎丸以活血、补益、散结为主,既有攻伐之效,亦含补益之功。课题组前期在体实验证明鳖甲煎丸具有较好的抑瘤功效。血清药理学对于中药复方制剂的复杂化学成分能更好的反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程,在理论上具可行性。(2)课题组成员已掌握相关实验技术。(3)科研中心仪器设备能满足实验所需。 【创新性】 中药在抑制肝癌细胞增殖、控制瘤体生长等方面具有独特的优势。目前对中药抗肿瘤的研究仍以单味药或药物单体成分及临床经验方为主,而中医经典复方对肿瘤相关信号通路影响的研究则相当少见。本课题在前期鳖甲煎丸抑制S180实体瘤研究的基础上,通过体外实验观察其对人肝癌细胞Bel-7402的影响,并运用血清药理学、形态学、流式细胞术、MTT、蛋白质印迹等方法,试图从促进肿瘤细胞凋亡及阻碍瘤体内血管生成两方面,探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的可能机制。本研究在思路上,将传统中医药理论与现代医学分子生物学理论相结合,探讨中药复方治疗肝癌机制。为中医经典复方治疗肿瘤提供理论基础。     

去甲斑蝥素N-乳糖酰壳聚糖纳米粒的制备及其特性研究

目的 合成N-乳糖酰壳聚糖作为肝靶向载体,制备去甲斑蝥素纳米粒。方法 通过碳二亚胺缩合法制备N-乳糖酰壳聚糖,并以之为载体,采用离子诱导法制备去甲斑蝥素N-乳糖酰壳聚糖纳米粒。以粒径分布、包封率、载药量为综合指标,正交试验设计优化载药纳米粒的制备工艺,并考察其体外释放特性。结果 合成的N-乳糖酰壳聚糖的取代度为8.92%。优化工艺制备的N-乳糖酰壳聚糖载药纳米外观圆整,平均粒径(118.7±8.84) nm,包封率(57.92±0.40)%,载药量(10.38±0.06)%,其体外释药遵循Higuchi方程。结论 半乳糖修饰壳聚糖载药纳米粒具有良好的缓释特性。     

脑靶向紫杉醇纳米胶束的体外实验研究

目的 研发一种新型的治疗乳腺癌脑转移的靶向递药系统。方法 采用薄膜水化法制备载药胶束,将胶束与脑靶向分子Angiopep-2连接,使胶束具有脑靶向功能。结果 体外细胞实验证实该胶束具有良好的靶向性。结论 连接有靶向分子Angiopep-2的纳米胶束具有良好的脑靶向功能。     

C.novyi-NT抗肝癌细胞作用的实验研究

【立论依据】 2001 年Dang等通过研究Clostridium novyi(C.novyi)对结直肠肿瘤、黑色素瘤的作用发现,它能够引起广泛的肿瘤细胞坏死;为了减少其致病性,C.novyi 中编码外毒素的基因被去除,成为C.novyi-NT(Nontoxicgenenic C.novyi)菌株。研究人员将C.novyi-NT 芽胞通过尾静脉给予荷瘤裸鼠,有趣的是,C.novyi-NT除了在肿瘤中生长外,却并不累及其它正常组织;实验结果表明C.novyi-NT在肿瘤低氧区域弥散分布,并引起该区域肿瘤细胞明显坏死,整体上缩小肿瘤体积,且具有约30%的治愈率。C.novyi-NT对肿瘤的杀伤作用被证实与引起机体免疫反应有关,但具体机制仍不清楚。随后C.novyi-NT芽胞被用来联合抗肿瘤药物、放射疗法,均表现出令人振奋抗肿瘤协同作用。目前C.novyi-NT的抗肿瘤研究已进入I期临床试验,以评估其安全性。 【设计思路】 基于已有的研究基础,我们提出C.novyi-NT对肝癌具有治疗作用,且是通过诱导机体产生免疫炎性反应起到杀伤作用;另外,通过联合索拉菲尼、紫杉醇等化疗药物,能够起到协同作用。 【实验内容】 (1)建立鼠肝癌H22荷瘤小鼠模型:观察肿瘤生长情况,统计小鼠存活天数;(2)C.novyi-NT 芽胞的制备:诱导C.novyi菌株芽胞形成,通过物理方法去除毒力基因,得到C.novyi-NT芽胞;(3)C.novyi-NT抗肝癌作用的研究:将C.novyi-NT芽胞通过尾静脉注入荷瘤小鼠,观察肿瘤生长变化、测量肿瘤体积,统计小鼠治愈率、死亡率,检测血管生成指标及免疫指标;联合C.novyi-NT与肿瘤化疗药物索拉非尼、紫杉醇处理荷瘤小鼠,观察抗肿瘤效果并检测血管生成、免疫指标。 【材料】 C.novyi;H22鼠肝癌细胞株;BALB/c小鼠;索拉菲尼;紫杉醇。 【可行性】 本项目立论依据充分,有大量的相关研究工作作为基础;实验设施及实验环境均满足本项目要求,并受到微生物学教研室主任李明远教授指导;项目研究团队均为基础医学基地班学生,通过平时各类科研训练,已有一定的实验基础。 【创新性】 此项目为肿瘤学、微生物学、免疫学等多学科交叉,并与转化医学紧密结合。此项目将首次揭示C.novyi-NT对肝癌的治疗作用及具体机制,并通过C.novyi-NT联合肿瘤化疗药物对肝癌的协同治疗作用,为耐药性肿瘤的治疗提供新的治疗策略。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

OX26/ApoE共修饰的载小檗碱介孔二氧化硅纳米粒药动学研究

[目的] 制备羧基功能化介孔二氧化硅纳米载体颗粒（MSNs-COOH）,通过表面偶联转铁蛋白受体单克隆抗体（OX26）和载脂蛋白E（ApoE）,增加包载小檗碱（BBR）的介孔二氧化硅纳米颗粒透过血脑屏障并靶向于脑部能力。[方法] 采用模板剂法制备MSNs-COOH,碳二亚胺法偶联OX26和ApoE,浸渍法将BBR包载于孔道内。通过透射电子显微镜（TEM）、激光粒度分析仪、氮气吸脱附法等对载体进行表征,透析袋法考察制剂在体外释放特性,尾静脉注射给药后测定大鼠血浆及脑组织中药物浓度,计算药动学参数,评价制剂脑部靶向性。[结果] 制备的MSNs-COOH在透射电镜下为有序孔道的球形颗粒,平均粒径为（129.8±1.3）nm,载药量为（10.71-20.39）%,体外释放结果显示该载体具有缓释特性,药动学参数表明制剂组的AUC与BBR溶液组有显著性差别,脑靶向指数大于1。[结论] 所构建的OX26/ApoE共修饰的小檗碱介孔二氧化硅纳米载体能改善药物口服吸收差的缺点,实现药物的脑部靶向治疗,具有一定的脑靶向性。     

SHP2/Hook1通过上皮间质转化调控肺肿瘤转移的机制研究

【立论依据】 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的最主要原因,而上皮间质转化在肿瘤转移的起始过程中发挥重要作用。原癌基因ptpn11表达的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤中存在突变或高表达现象,提示SHP2参与肿瘤的发生与进展。本项目的前期研究发现SHP2促进上皮间质转化过程,且需要其酶活性的参与;新发现的SHP2相互作用蛋白Hook1在上皮间质转化中具有相反的抑制作用,而Hook1与SHP2的催化结构域结合。 【设计思路】 本项目对Hook1是SHP2的内源酶抑制剂这一假设进行研究,并探究SHP2与Hook1形成的蛋白复合物通过调节上皮间质转化过程影响肺肿瘤转移的可能性。 【实验内容】 (1)原核表达与纯化带有His标签的SHP2和Hook1蛋白,通过测定SHP2蛋白磷酸酶的活性探讨Hook1能否抑制SHP2的酶活性;(2)定量PCR、蛋白质印迹方法比较侵袭能力不同的肺上皮细胞中SHP2和Hook1在mRNA与蛋白水平上的差异;(3)miRNA干扰或过表达方法改变两种蛋白的表达水平,观察其对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响;(4)构建破坏SHP2与Hook1相互作用的截短或点突变质粒,探究Hook1对上皮间质转化以及细胞侵袭的影响是否需要SHP2的参与;(5)体内实验验证改变SHP2或Hook1的表达是否影响肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。 【材料】 原核表达质粒PET21a,His亲和纯化树脂,非小细胞性肺癌细胞株A549,SHP2siRNA,pCDNA3.1-SHP2及突变体表达载体,Hook1siRNA,pCDNA3.1-Hook1及突变体表达载体,抗SHP2、Hook1抗体,4组(每组9只,共36只)NOD/SCID小鼠。 【可行性】 前期研究发现SHP2的蛋白酪氨酸磷酸酶活性能够促进肺上皮细胞的上皮间质转化过程;SHP2的催化结构域相互作用蛋白Hook1则抑制上皮间质转化过程。在此基础上我们推测SHP2和Hook1通过上皮间质转化从而对肿瘤的转移产生影响,并且Hook1的作用需要SHP2的参与。故本研究具有较强的可行性。 【创新性】 新发现的与SHP2催化结构域相互作用的Hook1有可能成为首个SHP2的内源抑制蛋白。明确SHP2/Hook1复合物在上皮间质转化以及肿瘤转移中的作用,有助于认识SHP2与肿瘤转移的关系,所揭示的分子机制有望为肿瘤转移的早期诊断及临床治疗提供新的潜在靶点。     

脑卒中改变肝脏CYP2B代谢环磷酰胺功能的研究

【立题依据】 中枢神经系统损伤是否影响肝脏药物代谢能力,尚不清楚。脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见疾病之一。临床资料和实验室的前期工作均提示,脑卒中急性期可明显影响甲状腺激素分泌。文献报道,甲状腺激素对肝脏药物代谢酶(如CYP2B)具有调控作用。恶性肿瘤是引发脑卒中的多见原因,同时肿瘤患者需按疗程连续服用抗肿瘤药物,故研究脑卒中时抗肿瘤药物的代谢变化,可为指导临床用药提供重要实验数据。 【设计思路】 环磷酰胺为临床上最常用的烷化剂类抗肿瘤药,主要经肝脏CYP2B代谢生成具有抗肿瘤活性的磷酰胺氮芥。研究拟观察脑卒中能否通过影响甲状腺激素改变肝脏CYP2B表达,并探讨环磷酰胺药物代谢动力学变化。 【实验内容】 (1)采用线栓法制备大鼠短暂缺血型脑卒中模型,结合细胞实验,通过多种分子生物学手段分析甲状腺激素水平与肝脏甲状腺激素受体表达量、穿核能力,以及与CYP2B启动子结合能力之间的关系,从而阐明中枢神经系统对肝脏CYP2B调控作用机制。(2)利用脑卒中动物模型,分析单次环磷酰胺给药后活性代谢物磷酰胺氮芥的血药浓度变化的时间曲线,从而为临床制定用药方案提供参考。 【材料】 Wistar雄性大鼠,环磷酰胺,和RT-PCR,蛋白质印迹,EMSA,ChIP,CoIP等实验相关材料,以及高效液相色谱仪等设备。 【可行性】 (1)文献及前期结果提示,甲状腺激素可能是脑卒中时肝脏CYP2B代谢能力改变的信号传递分子。(2)已具备建立大鼠脑卒中模型。(3)实验室具备相应的器材及设备。 【创新性】 通过研究脑组织损伤时机体药物代谢变化,将阐明内源性激素可能作为重要信号传递分子,介导中枢神经系统调控肝脏药物代谢功能的作用机制。研究选择临床多发病脑卒中为代表探讨药物代谢变化,具有理论和实际的研究价值。     

探索薄层色谱法在桉叶油含药血清制备中的应用

【立项依据及设计思路】 跟随指导教师做实验发现,所制备的桉叶油含药血清品质因为没有相关检测数据而不能保证,甚至是否真的含有研究的药物都值得怀疑。查阅文献发现液/气-质联用法可以检测,但仪器昂贵,上机样品要求高,需要专业技术人员,且桉叶油成分复杂使得检测所需的标准品难以配置而放弃此方法检测。在《有机化学》学习中了解到薄层色谱法(TLC)是一种快速分离和定性分析少量物质的实验技术,其优点是操作方便、设备简单、结果显示快速。结合其原理,与指导教师讨论其应用于判定桉叶油含药血清品质及指导桉叶油含药血清制备方案选择的可行性。拟探索TLC定性和半定量检测性能能否满足桉叶油含药血清制备过程中判定血清中是否含有原药成分和新生成分,指导给药剂量、方式和采血时间的选择的实验要求。 【实验内容】 (1)TLC能否制备桉叶油浓度比色卡。(2)TLC能否检测出桉叶油含药血清中是否含有原药成分和新生成分,并运用液相色谱检测验证实验结果。(3)TLC半定量检测性能能否满足指导桉叶油含药血清制备过程中给药剂量、方式及采血时间选择的实验要求。 【材料】 清洁级小鼠,薄层硅胶板,液相色谱仪,桉叶油。 【可行性】 (1)研究者具有较强的动手能力和灵敏的思维能力,指导教师多年从事桉叶油研究,有丰富的科研经历,可以保证实验顺利开展。(2)预实验和实验结果表明:①TLC可以定性检测桉叶油含药血清含有原药成分。②其他条件一致,不同时间点收集的血清TLC显色存在颜色梯度差。③其他条件一致,不同剂量桉叶油灌胃所制备血清TLC显色也存在颜色梯度差。提示TLC可以用于指导桉叶油含药血清制备的方案选择和血清品质的定性鉴定,满足了实验要求。 【创新性】 用实验验证了经济、简便、快速易行的TLC可以取代液/气-质联用技术,满足桉叶油含药血清制备中血清制备的方案选择和血清品质的定性鉴定的实验要求,也为TLC推广应用到制备其他中药含药血清提供了参考方法和实验依据。     

探究3C蛋白酶切割p51在B组柯萨奇病毒致病毒性心肌炎中的作用

【立题依据】 B组柯萨奇病毒(CVB)是病毒性心肌炎的主要病原体,可引发扩张型心肌病,尚无治疗药物。CVB的3C蛋白酶切割前体蛋白形成结构蛋白,完成病毒复制,也通过切割宿主蛋白发挥致病作用。我们发现宿主细胞中一个长约51kDa的蛋白质(其功能尚不清楚,暂称为p51)有3C蛋白酶的特异性酶切位点,推测p51是CVB的作用靶点之一,3C蛋白酶切割p51可能是CVB致病的新机制。 【设计思路】 通过蛋白质过表达和沉默等分子生物学技术,在细胞和动物实验中证实CVB 3C蛋白酶可以切割p51,并通过通过切割p51发挥致病作用。 【实验内容】 本实验设计通过以下4方面研究CVB通过其3C蛋白酶切割p51致病的作用机制:(1)构建真核表达载体质粒pEGFP-p51;(2)细胞实验确定3C蛋白酶通过特异性位点切割p51;(3)细胞实验确定CVB通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用;(4)动物实验确定3C蛋白酶可以切割p51并在CVB致病毒性心肌炎中发挥作用。 【材料】 HeLa细胞;Balb/c小鼠;CVB3,嗜心肌CVB3 H3株;质粒:pEGFP-C1,pEGFP-2A,pEGFP-3C;干扰RNA:通过商业渠道购买。 【可行性】 本实验设计有充分依据表明p51有CVB 3C蛋白酶的酶切位点,CVB可能通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用,从而导致病毒性心肌炎和扩张型心肌病。 【创新性】 通过本实验,我们可能揭示CVB致病的新机制,能够更加全面地了解CVB致病毒性心肌炎的分子机制,为研发抗CVB药物提供新靶点,为临床治疗提供新方向,有广泛的应用前景。     

磁性白蛋白纳米球作为基因载体的研究

目的 制备载基因的磁性白蛋白纳米球,评估磁性白蛋白纳米球作为基因载体的可行性及体外的磁靶向性。方法 采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,分别运用透射电镜（TEM）、动态光散射分析（DLS）对其形态、粒径进行表征。应用绿色荧光蛋白基因系统（pGFP）,观察载基因磁性白蛋白纳米球体外释放基因速率的情况及转染细胞的情况。运用普鲁士蓝染色法观察磁性纳米球的体外磁靶向性。结果 载基因磁性纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在载基因磁性纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。DLS显示载基因免疫磁性纳米球的水合粒径约为209nm。体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料13h释放基因为95.25%,曲线平缓;转染实验结果显示载基因磁性纳米球能够有效转染SMMC-7721细胞,且转染效率高于载基因纳米球。普鲁士蓝染色实验结果显示磁靶向组细胞内的铁颗粒明显多于非靶向组。结论 成功制备了载基因磁性白蛋白纳米球,具有缓释基因的作用,并且能高效转染人肝癌细胞SMMC-7721。磁性白蛋白纳米球基因载体具有体外靶向性,有望作为一种潜在的靶向基因载体应用到生物医学领域。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。     

针对肝癌化疗耐药的多靶标siRNA的构建和功能鉴定

【立论依据】 肿瘤耐药机制复杂多样,是多基因,多步骤综合作用的结果,仅使用单一阻断的方法,尚不能取得令人满意的逆转效果。因此,针对肝癌多种耐药机理,设计和构建能降低肝癌细胞化疗耐药性的新型纳米药物是改善肝癌药物治疗效果的关键科学问题。近年来韩国科学家Dong-Ki Lee构建了一种可同时靶向4个癌基因(Survivin、β-catenin、STAT3、MET)的,由4个RNA双螺旋组成的四聚体RNAi(quadruple interfering RNAs, qiRNA),其转染效率和干扰效率优于传统的siRNA。 因此,本项目拟采用该策略,针对肝癌细胞膜上固有的高表达ABC蛋白和肝脏独特的代谢解毒机制以及肝癌干细胞的耐药机制,选取了4个多药耐药相关的关键基因:编码细胞膜上ABC转运蛋白的MDR1基因、参与肝细胞解毒功能的谷胱甘肽转移酶基因-GST pi、抑制细胞凋亡的Survivin基因和参与肝癌干细胞“干性”维持的Snail基因,将其构建成四合一的四聚体qiRNA;采用肝癌细胞耐长春新碱(VCR)耐药株(SMMC7721/VCR)作为多药耐药细胞,通过观察转染四聚体qiRNA后各个靶基因的表达情况以及细胞增殖、细胞凋亡和瘤体抑制率的变化,以评价四聚体qiRNA对改善肝癌细胞耐药性的效果。 【设计思路】 本项目围绕着降低肝癌化疗耐药性的科学问题,设计和构建针对肝癌不同耐药基因和信号通路的多靶点RNAi药物,并在细胞水平上检测其靶基因的干扰效率及肝癌耐药株细胞耐药性的改变,试图获得有效降低肝癌化疗耐药性的新型多聚siRNA,为开发新型的多靶点抗肿瘤药物奠定基础。 【实验内容】 (1)肝癌多药耐药相关基因siRNA序列的筛选。(2)多聚siRNA的构建与表征。(3)jetPEI介导多聚siRNA的抗肿瘤活性评价。 【材料】 肝癌药物敏感细胞株SMMC7721及肝癌耐长春新碱细胞株SMMC7721-VCR,qiRNA或NC序列的合成由广州瑞博生物有限公司完成。其他常规试剂实验室都有储存。 【可行性】 该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题首次构建一种新型的多靶点的单一多聚siRNA制剂。(2)课题组首次获得有效降低肿瘤多药耐药性的多靶点siRNA分子。