缓释BCNU对GL261胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的 研究BCNU-PLGA 对GL261 胶质瘤细胞凋亡的作用机制.方法 利用溶剂挥发萃取法制备BCNU-PLGA 缓释微球.将24 只C57BL/6 小鼠随机等分为治疗组与非治疗组,借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261 胶质瘤细胞接种于小鼠颅内,行MR 检查掌握颅内成瘤情况.治疗组于术后第2 周立体定位植入BCNU-PLGA 缓释片剂,观察小鼠生存期,MRI 了解瘤体变化.获取标本行HE 染色,并行GFAP、Bax、Bcl-2 免疫组化检查检测其表达情况,相关数据采用统计学方法 进行分析.结果 治疗组与对照组生存期有明显差异(P ＜0.05),治疗组与对照组凋亡相关基因Bcl-2 免疫组化检查提示明显差异性(P ＜ 0.05),Bax 基本无改变,Bax/Bcl-2 比值明显增加.GFAP 表达为阳性.结论 BCNU-PLGA 局部缓释制剂通过下调Bcl-2 蛋白表达,上调Bax/Bcl-2 的比值,从而使胶质瘤细胞发生凋亡.     

BCNU缓释微球稳定性的影响因素

目的 探讨用于脑胶质瘤间质内化疗的BCNU-PLGA缓释微球稳定性的影响因素.方法 以溶剂挥发萃取法制备BCNU-PLGA缓释微球,HPLC测定微球内成分,并与空白PLGA微球比较.结果 微球冷藏贮存6个月后,外观形态无明显变化,以高效液相色谱方法测定微球溶解后BCNU色谱峰,发现与新鲜配制的BCNU标准品出峰时间和形态一致,微球溶解后BCNU色谱峰表现为单一尖锐峰形,表明药物在微球内部保持结构和成分的稳定.结论 BCNU-PLGA缓释微球具有良好的稳定性,可以满足间质内缓释化疗的需要.     

MGMT VEGF在脑胶质瘤中的表达及临床意义分析

目的分析MGMT、VEGF在脑胶质瘤中的表达及临床意义。方法 270例脑胶质瘤患者为肿瘤组,行颅脑外伤手术治疗的250例患者为对照组。取肿瘤组患者脑胶质瘤标本及对照组正常脑组织标本,检测MGMT、VEGF的阳性表达率。同时,统计并对比分析肿瘤组患者不同病理分级、肿瘤类型生存质量及预后下MGMT和VEGF的阳性表达率。结果肿瘤组患者MGMT和VEGF的阳性表达率依次为68.52%、77.78%,对照组依次为12%、28%,2组比较差异具有统计学意义(P0.05)。肿瘤组患者在MGMT和VEGF的阳性表达率上,高级别胶质瘤组患者高于低级别胶质瘤组(P0.05);KPS≤70分组患者高于KPS≤70分组(P0.05);术后12个月内死亡组患者高于术后12个月后存活组(P0.05)。而不同类型胶质瘤组患者中,MGMT和VEGF的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 MGMT、VEGF的表达与脑胶质瘤的发生、发展密切相关,可作为脑胶质瘤治疗效果评价、病情判断及生存质量、预后评估的重要参考依据。     

高压氧对脑内种植GL261胶质瘤C57小鼠尼莫司汀化疗后生存期的影响

目的观察高压氧辅助治疗对脑内种植GL261胶质瘤细胞系C57小鼠尼莫司汀(嘧啶亚硝脲)化疗后平均生存期的影响。方法于C57小鼠右侧尾状核种植GL261胶质瘤细胞,术后第7天分别接受单纯高压氧或单次尼莫司汀化疗或高压氧与尼莫司汀联合治疗,观察不同治疗方法对荷瘤鼠生存期的影响。结果大体标本观察显示,不同处理组荷瘤鼠肿瘤体积均较大、占位效应明显,正常脑组织受压严重、中线结构偏移,但不同处理组肿瘤体积比较差异无统计学意义(F=0.602,P=0.618)。平均生存期(F=12.177,P=0.000)评价和Kaplan-Meier生存曲线分析(χ2=13.604,P=0.003)显示,单纯高压氧治疗(χ2=0.365,P=0.546)和单次尼莫司汀化疗(χ2=0.884,P=0.347)对荷瘤鼠生存期无明显影响;高压氧联合尼莫司汀化疗(χ2=9.962,P=0.002)可延长荷瘤鼠生存时间,且疗效优于单纯高压氧治疗(χ2=6.925,P=0.008)和单次尼莫司汀化疗(χ2=7.152,P=0.007)。结论高压氧对颅内种植GL261胶质瘤细胞系的C57小鼠生存期和生长无明显影响和促进作用,联合尼莫司汀化疗则可使荷瘤鼠平均生存期明显延长,提示高压氧对尼莫司汀化疗具有增效作用。     

恶性脑胶质瘤MGMT基因启动子甲基化状态与患者临床预后的相关性

目的 探讨恶性脑胶质瘤组织O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化状态及MGMT蛋白表达与患者生存预后的关系,评价MS-MLPA技术检测MGMT基因启动子甲基化状态对脑胶质瘤化疗的意义. 方法 选择自2006至2010年南方医科大学珠江医院神经外科手术治疗且病理证实为恶性脑胶质瘤(WHOⅢ级、Ⅳ级)的39例患者为研究对象,应用免疫组化染色法检测肿瘤组织MGMT蛋白表达,应用MS-MLPA技术检测MGMT基因启动子甲基化状态,并观察患者化疗后总生存时间. 结果 肿瘤组织中MGMT蛋白表达阳性、弱阳性者与表达阴性者生存时间比较差异有统计学意义(P=0.003),MGMT蛋白表达阳性者比表达阴性者预后更差.肿瘤组织中MGMT基因启动子未甲基化者、低度过甲基化者、中度过甲基化者、高度过甲基化者生存时间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05),MGMT基因启动子过甲基化率越高者预后越好.MGMT蛋白表达与MGMT基因启动子甲基化状态存在统计学相关性(r=0.697,P=0.000),基因甲基化程度越高者蛋白表达越低. 结论 MGMT蛋白表达与MGMT基因启动子甲基化状态均可以作为接受烷化剂化疗的恶性胶质瘤患者生存期的预测指标.MS-MLPA技术是一种可靠的检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法.     

血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平与脑胶质瘤患者预后的关系

目的探讨血清胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平与脑胶质瘤患者预后的关系。方法选取75例脑胶质瘤患者为观察组,50例健康体检者为对照组,对比两组血清中GFAP、HIF-1α、VEGF水平差异,根据治疗效果和3年生存情况进行分组,观察不同临床疗效及预后患者血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平检测结果。结果观察组血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平显著高于对照组(P0.05);观察组中病理分级Ⅲ-Ⅳ级患者血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平高于Ⅰ-Ⅱ级患者(P0.05)。不同疗效等级患者血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平存在显著差异(P0.05);死亡组患者血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平明显高于生存组(P0.05)。血清GFAP、HIF-1α、VEGF高表达患者生存率均小于低表达患者(P0.05)。结论脑胶质瘤患者血清GFAP、HIF-1α、VEGF水平明显升高,其表达量与肿瘤病理学分级、临床治疗效果以及患者预后均存在密切联系。     

MGMT在恶性胶质瘤中的表达对替莫唑胺化疗预后的影响

目的 通过检测肿瘤组织O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)的表达,探讨其对恶性胶质瘤替莫唑胺化疗预后的影响,以期为个体化化疗方案的选择提供临床依据.方法 经病理学确诊为恶性胶质瘤患者60例,使用免疫组织化学方法检测肿瘤组织MGMT表达,根据表达情况分为MGMT阴性组和MGMT阳性组;所有患者均接受手术治疗及术后常规放射治疗和替莫唑胺化疗,并对其长期随访,进行无进展生存时间、实体肿瘤客观疗效和药物安全性的评定.结果 肿瘤组织MGMT表达阴性者(-～±)为33例,MGMT表达阳性者(+～++)为27例;应用替莫唑胺化疗6个疗程末,MGMT阴性组客观有效率(CR+PR)为20/33,明显高于MGMT阳性组的5/27;MGMT阴性组平均无进展生存时间为(18±6.42)个月,明显长于MGMT阳性组的(9.0±1.91)个月,两组间差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 替莫唑胺化疗方案的疗效与MGMT在肿瘤组织中的表达程度密切相关,MGMT的检测对于指导恶性胶质瘤患者制定个体化化疗方案具有重要意义.     

MGMT基因对脑胶质瘤患者启动子甲基化变化的价值研究

目的探究MGMT基因表达、启动子甲基化与脑胶质瘤患者预后间的关联性。方法择取我院2012-06-2014-09收治的82例行脑胶质瘤个体化综合治疗的恶性胶质瘤患者为研究对象,依据脑胶质瘤MGMT基因表达与启动子甲基化状况进行分组,术后予以同步放化疗,分析各组患者近期疗效、安全性及无进展生存时间。结果 MGMT蛋白表达与恶性胶质瘤MGMT基因启动子甲基化状态呈负相关(P0.05),MGMT基因启动子甲基化组近期疗效(79.54%vs75.00%)高于MGMT蛋白低表达组(P0.05),MGMT甲基化低表达组1、2、3a生存率(90.62%vs 75.00%;56.25%vs41.66%;31.25%vs 16.66%)明显高于MGMT甲基化高低表达组(P0.05)。结果 MGMT基因表达、启动子甲基化与脑胶质瘤患者预后密切相关,临床上应引起足够重视。     

恶性脑胶质瘤组织MGMT的表达及临床意义

目的探讨恶性脑胶质瘤组织O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的表达与临床意义。方法选取2012年11月至2014年4月收治的166例恶性脑胶质瘤患者为研究对象,分为50岁组86例,≤50岁组80例,采用免疫组化技术检测所有肿瘤组织MGMT蛋白表达情况。比较不同年龄患者MGMT蛋白表达情况及MGMT表达水平与患者生存时间的相关性。结果166例中,MGMT阴性表达82例,弱阳性表达40例,强阳性表达42例;MGMT阴性表达、弱阳性表达、强阳性表达患者生存时间分别为(24.15±3.27)、(17.35±3.16)、(13.25±1.34)个月,两两比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论恶性脑胶质瘤组织MGMT表达水平与患者预后存在一定相关性,MGMT表达水平越高,患者预后越差。     

三种鼠脑胶质瘤模型的建立与比较

目的 ;建立GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠、C6胶质瘤细胞SD大鼠及BALB/c小鼠皮下动物模型,比较其肿瘤生长特点。方法借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261、大鼠C6胶质瘤细胞分别接种于C57BL/6小鼠及SD大鼠右侧尾状核区,C6胶质瘤细胞接种于BALB/c小鼠左前肢皮下。接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,颅内模型于接种后7d、14d、21d、28d进行MRI检查,皮下模型测量体积,并绘制生长曲线。解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋(GFAP)免疫组化检查。结果 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型较之后两种模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤,而且颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好。结论 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。     

6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶和P53在人脑胶质瘤中的表达与病理级别和预后关系的研究

目的：探讨6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和P53在脑胶质瘤中的表达及意义。方法：采用免疫组化法检测133例肿瘤组织中MGMT蛋白和P53蛋白的表达情况,分析MGMT和P53与胶质瘤临床病理特征、预后及两者之间的相互关系。结果：不同级别胶质瘤间MGMT阳性表达率差异无统计学意义（P=0.158）;MGMT阳性表达水平差异也无统计学意义（P=0.138）,但MGMT表达水平与患者生存时间密切相关（P=1.07×10-6）。不同级别胶质瘤间P53阳性表达率差异无统计学意义（P=0.306）,而表达水平则在胶质瘤不同级别间差异有显著统计学意义,且呈正相关关系（r=0.187,P=0.032）;P53表达水平与患者生存时间密切相关（P=2.08×10-14）;MGMT和P53间无相关性（P=0.065）。结论：MGMT蛋白表达与胶质瘤病理分级无明显关系,P53蛋白表达水平与胶质瘤病理分级有关,两者都与生存时间密切相关。     

GDNF mediates glioblastoma-induced microglia attraction but not astrogliosis

High-grade gliomas are the most common primary brain tumors. Their malignancy is promoted by the complex crosstalk between different cell types in the central nervous system. Microglia/brain macrophages infiltrate high-grade gliomas and contribute to their progression. To identify factors that mediate the attraction of microglia/macrophages to malignant brain tumors, we established a glioma cell encapsulation model that was applied in vivo. Mouse GL261 glioma cell line and human high-grade glioma cells were seeded into hollow fibers (HF) that allow the passage of soluble molecules but not cells. The glioma cell containing HF were implanted into one brain hemisphere and simultaneously HF with non-transformed fibroblasts (controls) were introduced into the contralateral hemisphere. Implanted mouse and human glioma- but not fibroblast-containing HF attracted microglia and up-regulated immunoreactivity for GFAP, which is a marker of astrogliosis. In this study, we identified GDNF as an important factor for microglial attraction: (1) GL261 and human glioma cells secret GDNF, (2) reduced GDNF production by siRNA in GL261 in mouse glioma cells diminished attraction of microglia, (3) over-expression of GDNF in fibroblasts promoted microglia attraction in our HF assay. In vitro migration assays also showed that GDNF is a strong chemoattractant for microglia. While GDNF release from human or mouse glioma had a profound effect on microglial attraction, the glioma-induced astrogliosis was not affected. Finally, we could show that injection of GL261 mouse glioma cells with GDNF knockdown by shRNA into mouse brains resulted in reduced tumor expansion and improved survival as compared to injection of control cells.     

Microglial Exosome miR-7239-3p Promotes Glioma Progression by Regulating Circadian Genes

Glioma-associated microglial cells, a key component of the tumor microenvironment, play an important role in glioma progression. In this study, the mouse glioma cell line GL261 and the mouse microglia cell line BV2 were chosen. First, circadian gene expression in glioma cells co-cultured with either M1 or M2 microglia was assessed and the exosomes of M2-polarized and unpolarized BV-2 microglia were extracted. Subsequently, we labeled the exosomes with PKH67 and treated GL261 cells with them to investigate the exosome distribution. GL261 cell phenotypes and related protein expression were used to explore the role of M2 microglial exosomes in gliomas. Then a specific miR-7239-3p inhibitor was added to verify miR-7239-3p functions. Finally, the mouse subcutaneous tumorigenic model was used to verify the tumorigenic effect of M2 microglial exosomes in vivo. Our results showed that in gliomas co-cultured with M2 microglia, the expression of the BMAL1 protein was decreased (P < 0.01), while the expression of the CLOCK protein was increased (P < 0.05); opposite results were obtained in gliomas co-cultured with M1 microglia. After treatment with M2 microglial exosomes, the apoptosis of GL261 cells decreased (P < 0.001), while the viability, proliferation, and migration of GL261 cells increased. Increased expression of N-cadherin and Vimentin, and decreased E-cadherin expression occurred upon treatment with M2 microglial exosomes. Addition of an miR-7239-3p inhibitor to M2 microglial exosomes reversed these results. In summary, we found that miR-7239-3p in the glioma microenvironment is recruited to glioma cells by exosomes and inhibits Bmal1 expression. M2 microglial exosomes promote the proliferation and migration of gliomas by regulating tumor-related protein expression and reducing apoptosis.Supplementary InformationThe online version contains supplementary material available at 10.1007/s12264-020-00626-z.     

幼年和成年大鼠C6脑干胶质瘤侵袭性差异的比较

目的探讨幼年和成年Wistar大鼠脑干胶质瘤侵袭性的差异。方法 50只幼年和成年Wistar大鼠随机分4组,A组（n=15）和C组（n=15）分别将大鼠C6胶质瘤细胞注射到幼鼠和成鼠脑桥,B组（n=10）和D组（n=10）大鼠分别注射等体积生理盐水到幼鼠和成鼠脑桥。2周后MRI观察肿瘤生长情况并测量体积,常规行苏木精-伊红染色观察肿瘤组织形态学变化,免疫组织化学染色检测细胞侵袭相关因子基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和β-catenin的表达。记录4组大鼠生存时间。结果 MRI检查结果：A、C组在脑桥均发现肿瘤,肿瘤平均体积分别为（49.63±8.34）mm3和（52.07±7.77）mm3,两者无统计学差异（P〉0.05）;B、D组无肿瘤生长。A、C组大鼠平均生存时间分别为（19.47±2.23）d和（21.47±2.23）d,统计学比较有显著性差异（P〈0.05）;B、D组大鼠至另2组大鼠全部死亡时仍存活。A、C组肿瘤形态观察及MMP-2、MMP-9、β-catenin的表达无明显差异（均P〉0.05）。结论成功建立幼年和成年大鼠脑干胶质瘤动物模型,但二者肿瘤侵袭性无明显差异。     

冷冻联合全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤增殖的实验研究

目的探讨冷冻联合全反式维甲酸（ATRA）抑制大鼠c6脑胶质瘤细胞的增殖及其机制。方法在120只Wistar大鼠建立c6脑胶质瘤模型,并随机将其平均分为冷冻治疗、ATRA治疗、冷冻联合ATRA治疗及对照组。接种c6细胞第22天MRI检测10只动物的胶质瘤体积的变化,每组并处死10只动物取肿瘤组织,采用免疫组化法检测p27kipl蛋白的表达;观察余下10只荷瘤鼠的生存期。结果各治疗组较对照组肿瘤体积明显缩小（P〈O．05）,大鼠生存期明显延长,p27kipl蛋白的表达水平明显增多,以联合治疗组最为显著（P〈0．05）;p27kipl蛋白的表达与肿瘤体积呈明显负相关（P〈0．05）,与大鼠生存期呈明显正相关（P〈O．05）。结论与单一治疗相比,冷冻联合ATRA治疗能显著抑制大鼠c6胶质瘤细胞增殖,其机制可能与其表达p27kipl蛋白的上调有关。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性

目的探讨胶质瘤细胞异柠檬酸脱氢酶1（IDHl）基因突变对替莫唑胺（TMZ）细胞毒性的影响。方法将培养的U87胶质瘤细胞分组转染含空载体（空载体组）、野生型IDHl基因（野生组）和R132H突变型IDHl基因（突变组;IDHl第132位的精氨酸被组氨酸所取代）质粒,利用液相色谱串联质谱法检测细胞上清液中2-羟基戊二酸（2-HG）水平、噻唑蓝法检测细胞增殖活性、实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测细胞caspase3mRNA和蛋白质表达;将含三种不同质粒的U87细胞接种大鼠建立荷瘤大鼠模型并观察大鼠经TMZ治疗后60d存活率。结果与空载体组和野生组比较,突变组细胞上清液中2-HG水平、细胞caspase3mRNA和蛋白质表达水平均显著升高（P〈0．05）,而细胞增殖活性显著下降（P〈0．05）;TMZ治疗后60d,突变组大鼠存活率显著升高（P〈O．05）;空载体组和野生组之间均无统计学差异（P〈0．05）。结论IDHlR132H基因能够增加TMZ对神经胶质瘤细胞的细胞毒性作用并提高其治疗荷瘤大鼠的存活率。     

EGFR和MGMT在原发性与继发性胶质母细胞瘤中的表达及意义

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在原发性与继发性胶质母细胞瘤(GBM)中的表达及意义.方法 应用免疫组织化学法检测32例原发性GBM和15例继发性GBM中EGFR和MGMT的表达情况;比较两者在原发性与继发性GBM中的表达差异,分析EGFR与MGMT表达的相关性及其与预后的关系.结果 原发性和继发性GBM中EGFR的阳性表达率和表达强度差异均有统计学意义(P＜0.01);而MGMT在原发性和继发性GBM中的表达无明显差异(P＞0.05).原发性和继发性GBM中,MGMT与EGFR表达无相关性(P＞0.05).EGFR和MGMT均阳性和均阴性的GBM病人中位生存期分别为11个月和25个月,两者差异有统计学意义(P＜0.05).结论 EGFR过表达多见于原发性GBM,MGMT表达与GBM分型和EGFR表达无相关性.联合检测EGFR和MGMT有助于预测GBM病人的预后.     

替莫唑胺胶囊治疗恶性脑胶质瘤30例疗效分析

目的评价替莫唑胺胶囊（TMZ）治疗人脑恶性胶质瘤的临床疗效及不良反应。方法2005年1月至2008年1月对一个单位30例术后确诊的恶性脑胶质瘤且使用TMZ化疗的患者进行随访,观察近期治疗反应、生存期,并分析常规病理和分子病理对治疗效果的影响。结果TMZ治疗结束时,30例患者客观有效率和疾病控制率分别为53．3％和80．0％,O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）对近期疗效无明显影响（P〉0．05）,而不同病理类型的近期疗效存在明显差异（P〈0．05）。随访期间共有12例患者死亡,生存期为0．7～3．7年,中位生存期为1．5年。MGMT阳性和阴性患者的中位生存期分别为1．3年和1．5年,无明显差异（P：0．31）。胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤的中位生存期分别为1．3年和2．0年,亦无明显差异（P=0．28）。不良反应包括厌食、便秘等消化道症状11例（36．7％）,白细胞减少3例（10．0％）,假性进展2例（6．7％）。结论TMZ对恶性胶质瘤患者有较好的临床疗效,不良反应少,耐受性好,治疗方案简便,是一种理想的恶性胶质瘤术后辅助化疗药物。