p53基因治疗与放疗联合作用对卵巢癌细胞的杀伤效果

目的：探讨外源性p53基因转染与放疗联合作用对人卵巢癌细胞的杀伤效果。方法：用脂质体介导的转染技术，将人野生型p53基因的真核表达载体及不含p53基因的空载体分别导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中，经G418筛选，Northern blot及Western blot鉴定后，观察X射线照射对其集落形成的影响。结果：外源性p53基因在转染细胞中有效表达。经X射线照射后，转染p53基因组的SKOV-3细胞的集落形成数与转染空载体组及未转染的SKOV-3细胞组相比，明显降低。结论：外源性p53基因能增加卵巢癌细胞对放射线的敏感性，2者联合作用能更有效地杀灭肿瘤细胞。     

外源性p53基因抑制卵巢癌细胞的增殖并增加其对放疗的敏感性

目的　探讨外源性p5 3基因转染对人卵巢癌细胞系SKOV - 3的生物学行为及放疗敏感性的影响。方法　用脂质体介导的方法 ,将p5 3基因的真核细胞表达载体 (PcDNA -p5 3)导入不表达p5 3的人卵巢癌SKOV - 3细胞中 ,经G4 1 8筛选 ,Northernblot及Westernblot鉴定后 ,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化 ;观察p5 3基因转染与放疗联合作用对细胞集落形成的影响。结果　外源性p5 3基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长及集落形成能力 ,使细胞阻滞于G1 期。p5 3基因与放疗联合作用明显抑制了卵巢癌细胞的集落形成。结论　外源性p5 3基因能抑制卵巢癌细胞的生长 ,并增加卵巢癌细胞对放疗的敏感性     

野生型p53,GM-CSF和B7-1基因转移对卵巢癌细胞系SKOV-3增生的影响

目的研究人野生型p53、GM-CSF和协同刺激因子B7-1基因共转染对卵巢癌细胞增生的影响。方法以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体转染卵巢癌细胞系SKOV-3,荧光显微镜观察,流式细胞计数计算转染效率;以携带野生型p53、GM-CSF和B7-1基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,RT-PCR检测目的基因表达,观察转染前后细胞形态的变化,绘制细胞生长曲线。结果当腺病毒的感染强度达到400 pfu/细胞时,转染率可达到81%;以携带目的基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,能检测到相应基因表达;转染后SKOV-3细胞形态发生改变,增生减缓。结论腺病毒载体能介导目的基因转入卵巢癌细胞,并有效表达;人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因共转染能减缓卵巢癌细胞的增生。     

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

外源性p53基因转导对食管癌细胞株Eca109的生长抑制

本文首扶报道了逆转录病毒载体介导的外源性p53基因导入对食管癌细胞株Eca 109的生长抑制敢应。我们将野生型p53基因全长编码医克隆进逆转录病毒载休pDOR-Neo中，构建了重组病毒pDORp53．转染Eta 109细胞后，获得G418抗性细胞克隆Eca-p53。细胞生物学行为研究显示：生长曲线压低42%；GO／G1期细胞比侧显著增加；细胞增殖指数(PI)降低36.3%；软琼脂中集落形成能力受抑；对裸鼠的致瘤性丧失，结果证明，外源性野生型p53基因转导，对抑制食管癌细胞的恶性行为具有显著的生物学意义。     

野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的：观察野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用。方法：以逆转录病毒为载体将野生型p53基因导入胃癌细胞系MKN28和BGC823，检测p53对肿瘤细胞的影响。结果：p53在转染细胞中表达水平提高。外源性p53的导入使肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）水平明显降低；G0／G1期细胞数增加，S期降低。转染p53基因的MKN28细胞探鼠体内成瘤能力明显下降。结论：野生型p53基因参与调节DNA复制及细胞周期，抑制癌细胞过度增殖。     

Replacement of the p16 gene in human ovarian cancer cells

目的　研究逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系CAOV3生长与致瘤性的抑制作用。方法　用脂质体介导法将外源野生型p16基因转染不表达p16的人卵巢癌细胞系CAOV3,对转染后细胞DNA、RNA和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果　外源性野生型p16基因已整合入细胞并获稳定表达 ,表达有外源p16基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见G1期增加 ,S期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论　p16基因在卵巢癌发生、发展过程中起重要作用 ,为用p16基因转染对卵巢癌患者进行基因治疗提供了实验依据。     

人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用

目的: 构建含人孕酮受体膜组分（progesterone receptor membrane component,PGRMC）1的重组表达质粒,转染人卵巢癌细胞,研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法: 以卵巢癌细胞为模板,采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列,插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体;然后,将重组载体pST PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3,采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF mRNA的变化,用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果： 重组表达载体pST PGRMC1构建成功,重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达;PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成VEGF,并且促进体外血管的形成。结论： 重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用,可能促进卵巢癌细胞的远处转移。     

逆转录病毒介导的p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的 :观察人类野生型 p5 3(wtp5 3)基因对人食管癌细胞系的抑制作用。　 方法 :用逆转录病毒为载体 ,将外源性wtp5 3基因导入人食管癌细胞系ECA10 9,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及其对肿瘤的抑制作用。　结果 :p5 3在转染细胞ECA10 9/p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使ECA10 9细胞的生长速度减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低 ,调亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。　结论 :逆转录病毒载体介导的外源性wtp5 3基因能够抑制人食管癌细胞生长     

P53病毒增强型质粒-脂质体复合物对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的p53基因对血管平滑肌细胞（VSMC）的作用,探讨其用于防治冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄等心血管内外科疾病的可能性。方法：构建了野生型p53基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体,通过阳离子脂质体Dosper介导,体外转染杂VSMC。聚合酶链技术检测的基因表达。应用细胞计数及DNA合成分析技术,测定p53基因对VSMC增殖的抑制效应。结果：外源性p53基因可有效导入VSMC并表达;p53基因导入可显著抑制细胞生长,DNA合成减少。结论：野生型p53基因腺相关病毒增强型质粒载体转染VSMC可有效地抑制细胞增殖。     

卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建

目的 :本实验构建了人野生型 p53基因与真核表达载体 pc DNA3的重组体 ,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础。方法 :利用分子生物学基因克隆技术从质粒 p GEX-p53中用双酶切下目的片段 ,挤压法回收与 pc DNA3构成重组体。结果 :成功的构建了人野生型 p53基因真核细胞表达质粒。结论 :带有两个不同的酶切位点的目的片段定向克隆的方法使重组体的构建高效简便 ,挤压法回收目的片段经济有效。     

敲减EEF1D的人卵巢癌细胞的构建及其药物敏感性研究

目的 探讨 RNA 干扰真核生物翻译延长因子1δ (EEF1D)基因表达对人卵巢癌耐药细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响.方法 针对人EEF1D基因设计并筛选出下调基因表达效果最佳的 siRNA,构建 shRNA 序列表达载体pLJM1-shRNA.通过慢病毒表达载体构建稳定转染pLJM1-shRNA-EEF1D的SKOV3、SKOV3/DDP 细胞株. RT-PCR 和Western blot检测稳定转染细胞株EEF1D基因的表达情况, MTT法测定PGPIPN、DDP、DDP/PGPIPN对稳定转染细胞株的增殖抑制率.结果 成功构建重组慢病毒载体 pLJM1-shRNA-EEF1D. RT-PCR 和 Western blot 法均证实在 SK-OV3、SKOV3/DDP细胞中成功敲减 EEF1D 的表达.此外, MTT结果显示,与对照组和非特异性转染组相比,DDP/PG-PIPN细胞的增殖均明显受到抑制,差异有统计学意义( P＜0.05).结论 通过敲减EEF1D基因表达可以明显增强人卵巢癌SKOV3/DDP细胞对DDP/PGPIPN的敏感性.     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

人重组Oct3／4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株（SKOV3）,观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418（neomycin）筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量（10.225±0.987）显著高于转染对照组（1.713±0.896）和阴性对照组（校正值为1）（P＜0.01）.结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

野生型p53基因调控膀胱移行细胞癌中心体异常的实验研究

 目的研究野生型p53基因抑制膀胱癌细胞中心体异常的作用。方法将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞T24,应用免疫荧光化学法检测膀胱癌细胞中心体异常变化情况。结果野生型p53基因可抑制膀胱移行细胞癌T24细胞中心体异常。结论p53基因可能是膀胱移行细胞癌中心体异常的一个重要调控因子,p53基因失活可能引起肿瘤细胞染色体不稳,从而促进肿瘤的发生和发展。