白藜芦醇抑制膀胱癌细胞体外侵袭能力的研究

目的探讨白藜芦醇对膀胱癌T24细胞体外迁移与侵袭能力的影响及可能的机制。方法采用划痕试验检测白藜芦醇对T24细胞体外迁移能力的影响,Transwell实验检测白藜芦醇对T24细胞体外侵袭能力的影响,Real-time PCR与Western检测白藜芦醇对MMP-2与MMP-9蛋白表达水平变化的影响。结果 30μmol/L白藜芦醇处理T24细胞24h与48h后,划痕试验发现白藜芦醇可抑制T24细胞体外迁移能力,Transwell实验证实白藜芦醇可抑制膀胱癌T24细胞体外侵袭能力。Real-time PCR与Western结果表明,白藜芦醇可从mRNA与蛋白水平抑制MMP-2与MMP-9的表达,且呈时间依赖性。结论白藜芦醇可能通过下调MMP-2与MMP-9的表达而抑制膀胱癌T24细胞体外迁移与侵袭能力,可能成为治疗膀胱癌的新策略。     

NORE1基因在肾透明细胞癌细胞迁移侵袭和血管生成中的作用及相关机制的研究

目的探讨NORE1基因过表达对肾透明细胞癌细胞迁移侵袭及血管生成的影响及其分子作用机制。方法利用NORE1过表达质粒和对照组质粒,分别转染人肾透明细胞癌786-O和ACHN细胞,Western blot检测细胞转染效率,Transwell细胞迁移实验和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭的能力,体外血管生成实验观察其血管生成能力,Western blot检测NORE1基因过表达后肾癌细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白表达水平。结果转染NORE1过表达质粒后,肾透明细胞癌786-O、ACHN细胞中NORE1表达量增加。NORE1基因过表达后肾透明细胞癌细胞迁移及侵袭能力减弱,血管生成能力减弱,差异均具有统计学意义(P0.001)。NORE1过表达组肾透明细胞癌细胞中MMP-9表达较对照组显著下降,而两组间MMP-2表达水平无显著性差异。结论肾透明细胞癌细胞中NORE1基因可以通过调节MMP-9的表达影响细胞的迁移侵袭及血管生成。     

CD74基因调控CXCR4抑制肾癌786-O细胞的侵袭作用

目的探讨抑制人CD74基因后影响肾癌786-O细胞侵袭能力的作用机制。方法通过慢病毒lentivirus-CD74转染肾癌786-O细胞后,MTT法观察细胞活力变化,Transwell实验观察细胞侵袭能力的变化,应用Westernblot技术检测CD74、CXCR4蛋白的变化情况。结果抑制CD74蛋白表达水平后肾癌786-O细胞活力降低,侵袭能力降低,同时伴有CXCR4蛋白的表达降低。结论通过慢病毒转染抑制CD74的表达可以抑制肾癌细胞的侵袭能力,CD74基因可能是通过调控CXCR4蛋白的变化影响细胞侵袭能力的。     

姜黄素通过上调miR-637抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨姜黄素对肾癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法体外培养人正常肾小管上皮细胞HK-2和肾癌786-O细胞, 将786-O细胞分为对照组、低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组、miR-NC组、miR-637组、高剂量姜黄素+anti-miR-NC组、高剂量姜黄素+anti-miR-637组。分别进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、MTT、Transwell和蛋白质印迹(Western blot)实验来检测各组的miR-637表达量、细胞活力、迁移侵袭能力和相关蛋白表达水平。结果与人正常肾小管上皮细胞HK-2比较, 肾癌786-O细胞中miR-637的表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较, 中、高剂量姜黄素组786-O细胞的活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2及MMP-9表达水平均显著降低, p21表达显著升高, miR-637的表达水平均显著升高(均P<0.05)。与miR-NC组比较, miR-637组的miR-637表达水平提高, miR-637组的细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP...     

二甲双胍通过调节组蛋白乙酰化抑制肾癌细胞786-O迁移和侵袭

目的研究二甲双胍抑制肾癌细胞迁移和侵袭的机制。方法采用transwell迁移和matrigel侵袭实验检测10 mM和20 mM二甲双胍对786-O细胞迁移和侵袭的影响;Western blot实验检测二甲双胍对E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9以及组蛋白H3K9、H4K12和H4K16乙酰化水平的改变;组蛋白乙酰转移酶抑制剂C646与二甲双胍联用,通过transwell实验观察二甲双胍调控组蛋白乙酰化对786-O细胞迁移的影响。结果 10 mM和20 mM二甲双胍均能显著抑制786-O细胞迁移和侵袭(P0.05);二甲双胍上调E-cadherin,下调vimentin、MMP-2、MMP-9的表达(P0.05),同时显著增加组蛋白H3K9、H4K12和H4K16的乙酰化水平(P0.05);C646和二甲双胍联用能显著阻止二甲双胍引起的迁移抑制作用(P0.05)。结论二甲双胍通过上调组蛋白乙酰化水平抑制肾癌细胞786-O的迁移和侵袭。     

NNMT在肾透明细胞癌的表达及对肾癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究NNMT在肾透明细胞癌中的表达情况及对肾癌细胞侵袭能力的影响。方法:采用RT-PCR和Western blot方法检测正常肾小管上皮细胞株HKC、肾癌细胞株786-O及30例肾透明细胞癌组织、相应癌旁组织中NNMT的mRNA和蛋白的表达水平,并分析NNMT的mRNA水平与临床病理参数的关系。化学合成针对NNMT特异的siRNA序列,应用脂质体Lipofectamine 2000将其转染进786-O细胞中,利用RT-PCR和Western blot法检测NNMT在786-O细胞中的表达水平,用Transwell小室法检测肾癌细胞786-O侵袭能力的变化。结果:NNMT在肾癌细胞786-O中的mRNA和蛋白表达水平显著高于正常肾小管上皮细胞株HKC(P<0.001);肾透明细胞癌组织和对应的癌旁组织中NNMT的mRNA相对表达量分别为(1.582±0.2145)、(0.1269±0.04279),两组比较P<0.001。NNMT的mRNA水平与肿瘤大小、临床分期有关(P<0.05);Tran-swell法检测结果显示降低NNMT的表达后786-O细胞的侵袭能力明显下降。结论:NNMT在肾透明细胞癌组织和细胞中表达升高,可能在肾癌发生、发展过程中发挥重要作用。     

shRNA靶向抑制CD74基因对人肾透明细胞癌细胞786-O生物学行为的影响

目的探讨抑制人CD74基因后对肾透明细胞癌786-O细胞生长和侵袭能力的影响。方法通过慢病毒lentivirus-CD74转染肾透明细胞癌786-O细胞后,MTT法检测786-O细胞活力的变化,利用流式细胞学检测肿瘤细胞的凋亡变化情况,Transwell小室实验检测786-O细胞侵袭能力改变情况,采用Westernblot方法检测转染前后786-O细胞CD74及相关蛋白的变化情况。结果慢病毒转染786-O细胞后细胞中CD74蛋白水平表达明显低于对照组(P0.05),抑制CD74蛋白表达水平后786-O细胞生长明显受到抑制,细胞活力降低,凋亡增加,细胞侵袭能力降低,且Survivin、MMP-2、MM-9蛋白也随之下降,其与对照组结果对比差异具有统计学差异(P0.05)。结论利用慢病毒转染技术抑制CD74的表达可以抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增值和侵袭能力,CD74基因可能作为癌基因在肾透明细胞癌中起作用。     

MiR-134通过靶向调节KRAS抑制786-0肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程

目的探索miR-134在肾癌组织中的表达并研究其对肾透明细胞癌细胞786-0上皮间质转化的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-134在20对肾癌组织和786-0细胞中的表达情况;miR-134模拟物转染786-0后,划痕实验和Transwell实验分别检测肾癌细胞迁移和侵袭能力的改变情况,Western blot检测细胞中靶蛋白KRAS及其相关信号通路蛋白表达情况;双荧光素酶报告基因检测miR-134与KRAS 3′-UTR结合情况。结果 MiR-134在20对肾癌组织和786-0细胞中明显低表达(P0.01);miR-134模拟物转染后能够抑制肿瘤细胞侵袭(P0.01)和迁移的能力(P0.05),显著降低肿瘤细胞中KRAS蛋白的水平(P0.05)并抑制RAS/MAPK/ERK通路中关键蛋白p-ERK的表达(P0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-134能与KRAS 3′-UTR结合,显著降低荧光值(P0.05)。结论 MiR-134在肾透明细胞癌中显著低表达,能通过靶向抑制KRAS表达调控下游RAS/MAPK/ERK通路活性,阻滞786-0细胞上皮间质转化过程,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化的研究

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVc）对肝癌细胞信号转导子和转录激活子3（stat3）通路及上皮间质转化（EMT）的影响。 方法将含HCVc基因序列的重组质粒pEGFP-N3-HCVc转染人肝癌细胞HepG2,Real-Time PCR和Western blotting检测HCVc、总stat3、磷酸化stat3（p-stat3）及EMT指标蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail的表达,划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。 结果划痕实验及Transwell实验结果显示,过表达HCVc可增强HepG2细胞的迁移和侵袭能力;stat3通路抑制剂AG490处理可抑制HepG2细胞的侵袭能力。RT-PCR和Western blotting结果显示,过表达HCVc后,HepG2细胞中p-stat3、Vimentin及Snail在表达升高,E-cadherin表达下降;AG490处理可下调p-stat3、Vimentin及Snail表达,增强E-cadherin表达。 结论HCVc可活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化,增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力。     

长链非编码RNA MALAT-1通过EZH2-β-catenin信号通路调控肾癌细胞的增殖、凋亡及侵袭

目的探究长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子1(LncRNA MALAT-1)在肾癌组织及肾细胞癌(RCC)细胞株中的表达情况及其在调控RCC细胞增殖、凋亡及侵袭过程中的作用机制。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测正常和RCC组织以及HK-2、786-O、ACHN及Caki-1细胞中MALAT-1的表达情况;将786-O细胞随机分为3组,分别转染MALAT-1-siRNA沉默载体(si-MALAT-1组)及MALAT-1-siRNA阴性表达载体(si-NC组),空白对照组加入PBS(Blank组)。采用CCK-8法、流式细胞术法、Transwell法检测细胞增殖、凋亡及侵袭能力;利用Western blot法检测Zeste基因同源物增强子2(EZH2)及β-catenin的蛋白表达水平。结果与正常组织及细胞株HK-2相比,肾癌组织及细胞株786-O、ACHN及Caki-1中MALAT-1的表达水平明显增加(P<0.05);与Blank组和si-NC组相比,si-MALAT-1组RCC细胞活性和侵袭能力明显降低、细胞凋亡率明显增加、EZH2及β-catenin的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论LncRNA MALAT-1在肾癌组织及RCC细胞中表达上调;抑制MALAT-1的表达能够抑制RCC细胞的增殖和侵袭,促进凋亡,其机制可能与下调EZH2-β-catenin信号通路的表达有关。     

白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭的影响

目的 探讨白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭能力的影响.方法 实验分为空白对照组,0.1%DMSO组,白藜芦醇组(50、100、200 μmol/L).MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化;Transwell侵袭小室检测白藜芦醇对细胞侵袭的影响;荧光实时定量PCR和Western blot检测白藜芦醇对细胞Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达的影响.数据以-x±s表示,多组比较采用方差分析.结果 (1)空白对照组抑制率为0;0.1%DMSO组细胞抑制率为3.25%±0.42%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞抑制率为13.23%±1.68%;白藜芦醇100μmol/L组细胞抑制率为42.25%±3.20%;白藜芦醇200μmol/L组细胞抑制率为56.94%±5.31%.各组比较,差异有统计学意义(F=460.10,P<0.05).(2)空白对照组细胞凋亡率为0.05%±0.03%;0.1%DMSO组细胞为凋亡率为3.39%±1.77%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞凋亡率为6.92%±1.85%;白藜芦醇100 μmol/L组细胞凋亡率为19.05%±2.01%;白藜芦醇200 μmol/L组细胞凋亡率为27.17%±6.43%.各组比较,差异有统计学意义(F=38.84,P<0.05).(3)0.1%DMSO组对细胞周期无显著影响.白藜芦醇引起PANC-1细胞G0/G1期和S期阻滞,G2/M期细胞减少.(4)空白对照组平均穿膜细胞数为61±13;0.1%DMSO组为54±13;白藜芦醇50 μmol/L组为48±15;白藜芦醇100 μmol/L组为23±6;白藜芦醇200 μmol/L组为18±7.各组比较,差异有统计学意义(F=69.08,P<0.05).(5)白藜芦醇可使PANC-1细胞Bax表达升高,Bcl-2表达下调.MMP-2、MMP-9的表达明显受到抑制,mRNA和蛋白水平变化一致.结论 白藜芦醇可明显抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制其侵袭能力.     

miRNA-138与EZH2在肾透明细胞癌发生发展中作用机制的研究

目的:探讨miRNA-138及其调控靶基因EZH2在肾透明细胞癌(RCC)发生发展中的相关作用机制。方法:利用第二代大规模平行测序技术对10例RCC及对应癌旁组织进行全基因组测序,在肾癌组织中筛选出表达显著上调的miRNA-138;其次在人肾癌细胞株786-O、ACHN、Caki-1、769-P、os-rc-2及对照细胞人胚肾细胞293T中对miRNA-138进行转染,采用划痕实验检测miRNA-138对细胞株侵袭和迁移能力的影响;进而用多种预测软件预测靶基因,对预测的候选靶基因EZH2进行PCR验证。结果:发现miRNA-138在RCC中表达上调,并能够显著促进人肾癌细胞株786-O、ACHN的迁移;而其候选靶基因EZH2的表达在临床组织标本中显著上调;相应蛋白变化需要进一步验证。结论:EZH2表达在RCC中明显高于正常组织,提示EZH2可能是RCC一个敏感的生物学标志。推测miRNA-138与其靶基因EZH2可能参与肿瘤代谢和细胞凋亡等信号通路,在RCC的发生发展中发挥重要作用。     

缺氧调控人肝癌细胞核转录因子NF-κBp65/基质金属蛋白酶9表达相关机制的研究

目的探讨缺氧调控人肝癌细胞(HepG2)核转录因子NF-κBp65/基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达相关机制。 方法采用CoCl₂模拟低氧环境处理细胞,MTT法检测细胞的增殖,Western blotting法测定胞质蛋白NF-κBp65、MMP-9蛋白的表达。 结果低氧处理后胞质NF-κBp65、MMP-9的活性增加,当CoCl₂浓度在50~200 μmol/L时MMP-9表达呈现剂量依赖性,当CoCl₂浓度超过200 μmol/L后,MMP-9的表达不再增加;而NF-κBp65的表达继续增加,并且细胞迁移侵袭能力增加与MMP-9的表达呈正相关。 结论一定的低氧环境下肝癌细胞(HepG2)NF-κBp65、MMP-9的表达增加,并且细胞迁移侵袭能力增加与MMP-9的表达呈正相关。     

连接粘连分子3对肾癌细胞迁徙和凋亡的作用机制

目的研究连接粘附分子3(JAM3)在肾癌细胞中的表达情况以及在调控肾癌细胞迁徙和凋亡过程中的可能作用及机制。方法①RT-qPCR和Western-blot检测JAM3的表达水平;②siRNA、流式细胞仪、细胞划痕实验及细胞迁移实验分析其对RCC迁移和凋亡的影响;③Western-blot检测E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、整合素β1和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达水平,初步探究JAM3影响癌细胞迁移的可能机制。结果①与正常肾小管上皮细胞相比,人肾癌细胞中的JAM3表达显著上调(P<0.05);②JAM3敲除可促进肾癌细胞的凋亡(P<0.05)及抑制肾癌细胞迁移(P<0.05);③JAM3基因敲除后,肾癌细胞中E-粘连蛋白的表达增加,N-粘连蛋白、整合素β1、MMP-2、Bcl-2的蛋白水平下降(P<0.05)。结论 RCC中JAM3表达上调,并可能通过调控E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、整合素β1、MMP-2表达水平抑制癌细胞凋亡和促进其迁移。     

Sprouty2蛋白表达对肾癌细胞功能影响的实验研究

目的研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响。方法采用RNAi技术,构建质粒转染肾癌细胞系786-O,建立Sprouty2低表达细胞株,通过MTT、Transwell等技术研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。结果成功构建Sprouty2低表达肾癌细胞系。当Sprouty2表达水平下调后,肾癌细胞的增殖、侵袭能力增强,与对照组及空质粒转染组比较差异有显著性（P〈0.05）。结论 Sprouty2的表达对肾癌细胞的功能有一定影响,Sprouty2表达越低,肾癌细胞的增殖及侵袭力越强。     

苦参碱对喉鳞癌细胞株Hep-2侵袭转移的影响

目的:研究不同浓度苦参碱对喉鳞癌细胞株Hep-2侵袭和转移的影响及其作用机制。方法:Hep-2细胞体外培养,经0g/L、0.1g/L、0.2g/L和0.3g/L苦参碱分别处理1h、8h及48h,细胞黏附实验检测细胞黏附力,细胞迁移实验检测细胞运动力,细胞侵袭实验检测细胞侵袭力,RT-PCR法检测Hep-2细胞MMP-2和MMP-9mRNA的表达。结果:不同浓度苦参碱与对照组比较,苦参碱能有效抑制Hep-2细胞的黏附力、运动力和侵袭力(P<0.01),且能下调Hep-2细胞MMP-2和MMP-9mRNA的表达(P<0.01)。结论:苦参碱能抑制Hep-2细胞的浸润转移能力,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9mRNA的表达使Hep-2细胞的黏附力、运动力和侵袭力下降有关。     

miR-195-5p通过靶向ROCK1抑制肾癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化

目的探讨miR-195-5p对肾癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响。方法通过转染miR-195-5p mimics或inhibitors分别过表达或抑制肾癌细胞中miR-195-5p的表达,转染靶向Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)的小干扰RNA敲低肾癌细胞中ROCK1的表达量,利用细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测肾癌细胞的迁移和侵袭能力。通过双荧光素酶报告实验验证miR-195-5p对ROCK1的靶向调控作用,利用免疫印迹试验检测ROCK1及上皮-间质转化相关蛋白的表达水平。结果过表达miR-195-5p可显著抑制肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化,而抑制miR-195-5p的表达可明显促进肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化(P<0.05)。miR-195-5p可通过靶向ROCK1调控其在肾癌细胞中表达。敲低ROCK1后可部分抵消miR-195-5p inhibitors对肾癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响。结论miR-195-5p可通过靶向ROCK1抑制肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化。