裸鼠体内人腺样囊性癌细胞凋亡的研究

目的　在人涎腺腺样囊性癌 (salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC)裸鼠移植瘤模型上 ,观察重组人肿瘤坏死因子α(recombinedhumantumornecrosisfactor α ,rhTNF α)诱导凋亡的形态学特征及bax、bcl 2蛋白的表达情况。方法　将 6× 10 10 /L的SACC细胞悬液接种于裸鼠皮下建立动物模型后 ,按rhTNF α 10 0× 10 4IU /kg或 10× 10 4IU /kg瘤体内直接注射给药。采用光镜、电镜、流式细胞术及原位凋亡试剂检测盒观察凋亡的形态学变化 ;采用免疫组织化学观察bax、bcl 2的表达情况。结果　移植瘤细胞凋亡率明显高于对照组 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。凋亡细胞核消失后出现钙盐沉积 ,形成砂粒小体。凋亡细胞对bax、bcl 2蛋白的表达明显上升 (P <0 .0 5 )。结论　砂粒体钙化是TNF α诱导的SACC裸鼠移植瘤细胞凋亡的特征和归宿 ;TNF α诱导的细胞凋亡能够特异性增强bax、bcl 2基因蛋白的表达     

涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的动物实验

目的　检测不同剂量的重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF -α)对涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的体内诱导。方法　利用人涎腺腺样囊性癌细胞株 (SACC - 83)建立裸鼠移植瘤动物模型 ,局部肿瘤内直接注射rhTNF -α,选用两个不同剂量 (1 0 0× 1 0 4 IU/kg和 1 0× 1 0 4 IU/kg) ,观察对肿瘤的抑制作用 ,并采用流式细胞术定量检测体内细胞凋亡及细胞周期的变化情况。结果　①A实验组的抑瘤率为 52 .1 6 % ,B实验组的抑瘤率为 73 .0 1 %。②用药后三组瘤体体积的变化有显著性差异。③三组流式细胞周期的变化及凋亡率有显著性差异。结论　①rhTNF -α可抑制裸鼠SACC移植瘤生长 ,使细胞增殖在G1 期发生阻滞。这种抑制主要通过细胞凋亡来实现的。②本文低剂量的rhTNF -α诱导凋亡的效果优于高剂量的rhTNF -α ,为临床SACC治疗提供了参考剂量     

Bax促凋蛋白在抗DDP的人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:探讨Bax促调蛋白与人涎腺腺样囊性癌细胞(SACC)化疗耐受的关系。方法:用浓度为1.0mg/L的顺铂作用于腺样囊性癌细胞,每次作用时间48h,经6个月后形成在该药物浓度下生长良好的耐顺铂细胞(SACC/DDP)。用AO荧光染色检测四种化疗药物甲氨喋呤(MTX)、平阳霉素(PYM)、长春新碱(VCR)、丝裂霉素(MMC)对两种细胞凋亡率的影响,用免疫组化SP法检测Bax促凋蛋白表达的变化。结果:经过6个月的诱导,形成了在顺铂作用环境下生长稳定的细胞株SACC/DDP,较之母本细胞SACC,对四种化疗药物均产生了不同程度的抗性,凋亡率明显下降,Bax促凋蛋白阳性表达率为20.7%(P<0.01),明显弱于母本细胞。结论:经顺铂周期性诱导,人涎腺腺样囊性癌细胞的凋亡率下降,Bax促凋蛋白表达降低。     

六亚甲基二乙酰胺对MEC—1细胞凋亡及bcl—2基因表达的影响

目的：研究分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺（hexamethylene bisacetamide,HMBA)诱导人粘液表皮样癌细胞系MEC－1细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响。方法：用2mmol/LHMBA和1mg/L5-FU对培养的MEC－1细胞进行体外诱导72h后,分别采用光镜。TUNEL染色、免疫组化,原位杂交、图像分析等方法进行凋亡指数、bcl-2蛋白及mRNA表达水平的检测。结果：HMBA诱导的MEC－1细胞凋亡指数为68．5％,明显高于对照组和5－FU组（P＜0．01）;bcl-2蛋白及mRNA的表 度均显著高于其它组（P＜0．01）。结论：HMBA对人粘液表皮样癌MEC－1细胞具有明显的诱导凋亡作用,其作用机制可能与减弱了凋亡相关基因bcl-2的负调控作用有关。     

抗癌药5-FU联合α-IFN与ATRA对SACC-83细胞株作用的研究

目的:探讨诱导分化剂联合抗代谢药物对人涎腺腺样囊性癌(SACC)细胞的作用效能，寻找治疗SACC的新途径。方法：应用全反式维甲酸(ATRA)、α-干扰素(α-IFN)和5-氟尿嘧啶(5-FU)，分别以单用、双用和联用对涎腺腺样囊性癌-83(SACC-83)细胞株作用，用MTT法、软琼脂集落形成、BrdU掺入法和形态学观察的方法观察细胞的形态和功能变化。结果：①随着单用、双用和联用，SACC细胞的抑制率逐渐升高、平板克隆形成率逐渐下降、DNA合成受抑制。②癌细胞异型性逐渐消失，成熟细胞特征逐渐增多。③药物作用后细胞凋亡现象明显，可见大量凋亡小体。结论：3种药物联合使用时可对SACC细胞产生显著的抑制增殖、诱导分化和促凋亡作用。联合抗代谢药物诱导分化对SACC细胞有明显的抗肿瘤作用。     

重组人肿瘤坏死因子与维甲酸诱导涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨重组人肿瘤坏死因子α（recombined human tumor necrosis factor-α，rhTNF-α）和全反式与维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA)对涎腺腺样囊性癌SACC细胞凋亡的诱导作用。方法：应用光镜，电镜观察凋亡细胞形态学的改变，采用流式细胞术检测用药后细胞凋亡率及细胞周期的变化，结果：在采用rhTNF-α或ATRA诱导72h后,光镜观察发现癌细胞核缩小，染色质呈新月状；电镜观察发现癌细胞胞核固缩，染色质边集，出现死亡的形态学改变，流式细胞术检测发现，用药24h后凋亡峰开始形成，72h后细胞凋亡率最高。结论：rhTNF-α与ATRA可诱导体外SACC细胞发生凋亡。     

分化诱导剂对粘液表皮样癌增殖和凋亡相关基因表达的影响

目的 探讨分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HBMA)对人粘液表皮样癌细胞系MEC-1细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。方法 用0．002mol/L HMBA对培养的MEC－1细胞进行体外诱导72h后，分别采用光镜、免疫组化、原位杂交、图像分析等方法进行增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear,PCNA)，bax,bcl-2蛋白及mRNA表达水平的检测。结果 经HMBA诱导的MEC－1细胞中PCNA的表达较对照组明显下降（P＜0．01），同时MEC－1细胞的凋亡相关基因bax,bcl-2蛋白及mRNA表达均明显上升（P＜0．01）。结论 HMBA对MEC－1细胞的增殖基因PCNA有明显的负调控作用，从而可抑制其增殖；并且它能够特异性地上调bax和bcl-2基因的表达，发挥了促进凋亡的作用。     

涎腺肿瘤中P53,Bcl-2与细胞凋亡关系的研究

目的 :探讨涎腺肿瘤中细胞凋亡及其调控基因 p5 3 ,bcl 2间的关系。 方法 :采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)技术、免疫组织化学染色和HE染色 ,对 18例多形性腺瘤和5 2例恶性涎腺肿瘤中细胞凋亡和Bcl 2 ,P5 3蛋白表达进行观察和比较。结果 :恶性涎腺肿瘤的凋亡细胞指数和增殖细胞指数明显高于多形性腺瘤 (P <0 .0 5 ) ;恶性涎腺肿瘤中Bcl 2 ,P5 3蛋白表达率和表达强度明显高于多形性腺瘤 (P <0 .0 5 )。结论 :在恶性涎腺肿瘤中 ,增殖细胞和凋亡细胞明显增多且伴有P5 3的过度表达 ;Bcl 2蛋白在涎腺肿瘤中可抑制细胞凋亡     

抗癌药5-FU联合a-IFN与ATRA对SACC-83细胞株作用的研究

目的：探讨诱导分化剂联合抗代谢药物对人涎腺腺样囊性癌(SACC)细胞的作用效能，寻找治疗SACC的新途径。方法：应用全反式维甲酸(ATRA)、a-干扰素(a-IFN)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)，分别以单用、双用和联用对涎腺腺样囊性癌-83(SACC-83)细胞株作用．用MTT法、软琼脂集落形成、BrdU掺入法和形态学观察的方法观察细胞的形态和功能变化。结果：①随着单用、双用和联用，SACC细胞的抑制率逐渐升高、平板克隆形成率逐渐下降、DNA合成受抑制。②癌细胞异型性逐渐消失，成熟细胞特征逐渐增多。③药物作用后细胞凋亡现象明显，可见大量凋亡小体。结论：3种药物联合使用时可对SACC细胞产生显著的抑制增殖、诱导分化和促凋亡作用。联合抗代谢药物诱导分化对SACC细胞有明显的抗肿瘤作用。     

多西紫杉醇对腺样囊性癌SACC-83细胞增殖的影响

目的 :研究多西紫杉醇对涎腺腺样囊性癌SACC 83细胞增殖能力的影响。方法 :用细胞计数法、软琼脂克隆形成法、流式细胞术等研究药物对细胞增殖的抑制作用。结果 :多西紫杉醇对SACC 83细胞具有浓度依赖性和时间依赖性生长抑制作用 ,药物作用 2 4、48、72h的IC3 0 (nmol/L)分别为 1.3 9、1.2 6、0 .47,IC50(nmol/L)分别为 13 .0 2、3 .3 4、1.2 6,相对抗肿瘤活性 (RAA)值分别为 3 3 0、12 98、3 42 6;药物作用于细胞 72h后 ,对照组G1、S、G2 期细胞 ( % )为 73 .8、19.8和 6.4,IC3 0 组为 65 .0、2 9.5和 5 .5 ,IC50 组为 5 7.6、42 .4和 0 ;对照组、IC3 0 组、IC50 组克隆形成率 ( % )分别为 3 6.0± 0 .5、8.3± 2 .5和 0 .5± 0 .3。结论 :多西紫杉醇对腺样囊性癌ACC细胞增殖有明显的抑制作用。     

紫杉醇及β-榄香烯对人涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-LM细胞毒作用的研究

目的：研究紫杉醇及β-榄香烯联合应用对体外培养人涎腺腺样囊性癌细胞株SACC—LM的细胞毒作用。方法：应用药物敏感性MTT测定法、流式细胞术和透射电子显微镜观察等方法，探讨紫杉醇与β-榄香烯(浓度比1：1)联合应用诱导SACC—LM细胞凋亡及其与G，期阻滞关系。结果：1)应用MTT比色法，紫杉醇与β-榄香烯联合(浓度比1：1)作用SACC—LM细胞24h后，其抑制率呈现出明显协同效应。2)流式细胞仪分析，25μg／mL紫杉醇与25μg／mL β-榄香烯协同用药作用SACC—LM细胞24h后诱导SACC—LM细胞发生凋亡，并将细胞周期阻滞在G1期。3)电镜观察，协同用药对SACC—LM细胞作用24h后，具有典型的凋亡细胞特征。结论：紫杉醇与β-榄香烯(浓度比1：1)对SACC—LM细胞的抑制有协同作用，并诱导其产生凋亡，G1期阻滞能诱导SACC—LM细胞凋亡。     

Genistein对腺样囊性癌细胞SACC-83中细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的：研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein诱导人唾液腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞凋亡的分子机制。方法：用Genistein处理体外培养的SACC-83细胞,采用Western印迹技术检测bax、bcl-2和survivin蛋白的表达,并利用电泳凝胶成像分析软件,对其结果进行量化分析,采用SPSS11.5软件包对结果进行方差分析。结果：随着Genistein作用时间的延长和浓度的增加,bax蛋白的表达明显增加,bcl-2和survivin蛋白的表达明显减少。SACC-83细胞经220μmol/LGenistein作用3d,其bax蛋白的表达量是对照组的3.43倍（P〈0.01）,而bcl-2和survivin蛋白的表达量分别是对照组的85%（P〈0.05）和35%（P〈0.01）。结论：Genistein诱导SACC-83细胞凋亡,与其上调bax蛋白的表达,以及下调bcl-2和survivin蛋白的表达有关。     

三氧化二砷诱导涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人涎腺腺样囊性(SACC)细胞的作用机制,寻找治疗SACC的新途径.方法 应用As2O3对SACC细胞株作用,以 MTT、软琼脂集落形成和形态学分析法观察细胞的变化.结果 三氧化二砷作用后,癌细胞异形性逐渐消失,细胞凋亡现象明显,可见凋亡小体.结论 As2O3对SACC细胞株具有显著的抑制增殖、诱导分化和促进凋亡作用.     

Ezrin基因在人涎腺腺样囊性癌中的表达及对转移细胞增殖侵袭性的影响

目的 检测Ezrin基因在人涎腺腺样囊性癌(salivary gland adenoid cystic carcinoma,SACC)中的表达,探讨Ezrin基因对SACC肺高转移细胞(adenoid cystic carcinoma,ACC)-M增殖、凋亡及侵袭活性的影响和作为SACC基因治疗靶点的可行性.方法 采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)检测石蜡包埋的43例SACC、40例涎腺多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)及15例正常涎腺组织中Ezrin的表达.设计并合成Ezrin特异性经化学修饰的双链siRNA和双链SiRNA阴性对照组,经脂质体介导转染人ACC-M,将细胞分为实验组、阴性对照组、空白对照组.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学分析各组细胞中Ezrin基因的mRNA及蛋白表达变化;甲基噻唑基四唑(MTT)法绘制细胞生长曲线,检测各组细胞体外增殖能力;流式细胞术测定细胞周期及凋亡情况;Transwell实验检测各组细胞侵袭能力差异.结果 15例正常涎腺组织Ezrin表达阳性4例,40例PA中23例、43例SACC中37例,Ezrin表达阳性依次升高,差异有统计学意义(P<0.05).Ezrin特异性siRNA转染ACC-M后,Ezrin基因mRNA及蛋白表达水平均降低,细胞增殖活性受抑制,细胞凋亡增加,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 Ezrin的高表达可能在SACC的发生、发展及转移中发挥一定作用,Ezfin特异性siRNA能有效沉默ACC-M细胞Ezrin基因,使体外培养的ACC-M细胞在一定程度上增殖受抑制并诱导细胞凋亡及降低侵袭能力.     

短发夹状RNA沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的 探讨H-ras基因对涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)生物学特性的影响以及作为SACC基因治疗靶点的可行性.方法 构建H-ras靶向H-ras-shRNA质粒及阴性对照HK-shRNA质粒,经脂质体介导转染SACC-M细胞,G418筛选建立稳定转染细胞株,将细胞分为H-ras-shRNA转染组、HK-shRNA转染组及未转染细胞组.绘制细胞生长曲线检测细胞体外增殖能力;反转录聚合酶链法分析各组细胞中H-ras基因mRNA表达变化;荧光蛋白定量分析H-ras蛋白表达水平;流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况;裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力,分析H-ras沉默对细胞增殖及凋亡的影响.结果 成功构建重组质粒并导入SACC-M细胞,建立稳定表达质粒的细胞株.H-ras-shRNA质粒能有效降低SACC-M细胞中H-ras表达,H-ras基因抑制率为61.80%,H-ras蛋白表达抑制率为62.76%.细胞增殖活性明显受抑,G0G1期比例增加;流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率为30.82%,显著高于阴性对照组及空白对照组的4.29%和4.16%.H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.结论 H-ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC-M细胞中H-ras基因及蛋白水平的表达,降低细胞体内外的增殖活性,并能有效诱导细胞凋亡.     

地西他滨上调唾液腺腺样囊性癌细胞系细胞hMLHl的表达

目的：通过检测地西他滨（decitabine）对体外培养人唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cvstic carcinoma,SACC）细胞系细胞hMLHl的影响．探讨DNA甲基化转移酶抑制剂应用于SACC治疗的可行性及可能机制。方法：采用不同浓度的decitabine处理SACC细胞系SACC-83和SACC—LM细胞．观察细胞形态变化。选取5Ixmol／L的decitabine处理细胞后,分别使用甲基化特异性PCR、蛋白免疫印迹法、流式细胞技术检测用药前、后hMLHl基因启动子甲基化状况、hMLHl蛋白表达和细胞周期、凋亡的变化。应用SPSSl3．0软件包对数据进行独立样本t检验。结果：经decitabine处理后,SACC-83和SACC—LM细胞中hMLHl基因启动子甲基化水平降低,hMLHl蛋白表达水平分别升高1．582倍和1．977倍（P〈0．05）。用药后G0／G1期细胞比例显著减少．S期细胞比例显著增加（P〈0．05）．2种细胞系细胞晚期凋亡比例显著增加,差别有统计学意义（P〈O．05）。结论：DeCitabine可通过改变hMLHl基因启动子甲基化水平,上调蛋白表达;使SACC细胞阻滞于S期,Decitabine有可能作为SACC化疗药物或与顺铂联合使用,增强顺铂的效果．     

涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的诱导与P53基因的修复

目的　探讨涎腺腺样囊性癌 (salivaryadenoidcysticcarcinoma) p5 3基因的突变以及重组人肿瘤坏死因子α(recombinedhumantumornecrosisfactor-α ,rhTNF -α)诱导凋亡过程中 p5 3基因的修复。 方法　①在裸鼠移植瘤模型上 ,采用TNF -α 10 0× 10 4IU/kg或 10× 10 4IU/kg瘤体内注射 ,诱导腺样囊性癌移植瘤细胞凋亡 ;②采用DNA核酸序列测定方法 ,对移植瘤及凋亡诱导后的肿瘤分别进行 p5 3基因 6、7、8外显子的测定。 结果　发现腺样囊性癌移植瘤 p5 3基因第 8外显子的第 2 73、2 80号位点有点突变 ,其中 2 73位点为GCA→GCG ;2 80位点为GAG→GAC。第 6、7外显子未见突变。采用TNF -α治疗后 ,第 8外显子的第 2 80号突变位点得以修复正常 ,GAC→GAG ;而 2 73号突变位点未被修复。第 6、7外显子序列无变化。结论　①涎腺腺样囊性癌发生中 p5 3基因的第2 73、2 80号密码子有点突变 ;②TNF -α可以修复p5 3基因突变中的C :G配对的点突变 ,不能修复A :G碱基的突变 ;③TNF -α对正常基因序列没有影响。     

反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用

目的　探讨与 bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义 bcl-2寡脱氧核苷酸 ( oligodeoxynucleotide,ODN)对 Bca-CD885细胞内源性 bcl-2表达的阻断作用。方法　以脂质体 Lepofectin为载体 ,一过性转染 2 0 μmol/L 反义及正义 bcl-2 ODN于 Bca CD885细胞中 ,FCM-抗体观测转染后 2 4h、3 6h、48h细胞内 bcl-2基因蛋白表达变化 ,RT-PCR技术检测转染后 2 4h bcl-2 m RNA的表达变化。结果　转染反义 bcl-2 ODN后 2 4h、3 6h、48h Bca CD885细胞内 bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降 ( P<0 .0 5 ) ,而正义组与对照组无差异 ( P>0 .0 5 ) ;正反义组 bcl-2m RNA与对照组相比无明显变化 ( P>0 .0 5 )。结论　反义 bcl-2 ODN能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性 bcl-2蛋白表达     

流体剪切力对成骨细胞凋亡及bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响

目的:探讨流体剪切力对成骨细胞凋亡及相关蛋白bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响.方法:对培养的第3代新生大鼠成骨细胞分别加载0(对照组)、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 Pa流体剪切力1h后,静止培养24h.应用TUNEL法检测凋亡.采用免疫组化法检测bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白.采用SPSS11.5软件包对数据进行单因素方差分析.结果:在0、0.6、1.0、2.0 Pa组,细胞凋亡及bcl-2、Caspase-3表达量无显著差异,P＞0.05.3.0、4.0、5.0 Pa组间,随剪切力增大,细胞凋亡增加,Bcl-2表达量减少,Caspase-3增加,P＜0.05.所有实验组间Bax无显著差异,P＞0.05.结论:生理范围的流体剪切力对成骨细胞凋亡无影响,而过大力值导致bcl-2表达减少,进而活化caspase-3,成骨细胞凋亡增加.     

三氧化二砷对舌鳞癌细胞凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的　研究三氧化二砷(As2O3)对舌鳞癌细胞株(Tca8113)增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERT mRNA)的作用,并初步探讨三氧化二砷的作用机制。方法　以舌鳞癌细胞株(Tca8113)为研究对象,采用噻唑蓝 (MTT)、Annexin V/碘化丙锭(PI)染色法检测细胞生长抑制率和细胞凋亡率;采用Western blot检测细胞hTERT蛋白 的表达;采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果　As2O3能够明显抑制Tca8113细胞增殖,诱导 细胞凋亡,并有浓度、时间依赖性。5μmol/L As2O3组72 h细胞生长抑制率为83·40%±7·31%,细胞凋亡率为 26·40%±3·42%。As2O3能抑制hTERTmRNA的表达和翻译,随As2O3作用时间、浓度增加,细胞hTERTmRNA和蛋 白表达减弱,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0·05)。结论　As2O3可以明显抑制Tca8113细胞增殖, 诱导舌癌细胞凋亡,并抑制端粒酶催化亚基基因的表达,诱导细胞凋亡和抑制hTERT转录和翻译可能是其作用机 制之一。