葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

高糖环境下FGF-21对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究高糖环境下成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）骨向分化的作用及其机制。方法 取健康成人骨髓,分离培养hBMSCs,成骨、成脂诱导分化后,茜素红、油红O染色鉴定,流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD105、CD90、 CD73和CD44水平。将hBMSCs分为对照组〔以葡萄糖（Glu）浓度5.5 mmol/L模拟正常生理状态糖浓度〕,Glu A、B、C高糖浓度梯度组（Glu 16.5、25、40 mmol/ L）,FGF-21干预组(Glu 5.5 mmol/ L+ FGF-21),高糖环境FGF-21干预组(Glu B+FGF-21)和Glu B+FGF-21干预+细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号转导阻断剂（包括PD98059、SP600125、SB203580）组。成骨诱导第14天,检测碱性磷酸酶（ALP）活性;成骨诱导第21天,以RT-PCR检测骨向分化的相关因子ALP、骨钙素（OCN）、Runx2的mRNA水平,以Western blot检测MAPK通路中细胞外信号调节激酶(ERK1/ 2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平。结果 ①分离培养得到的hBMSCs成骨、成脂诱导后茜红素、油红O染色阳性,hBMSCs被成功地诱导向成骨细胞（OB）和脂肪细胞分化。流式细胞仪鉴定为hBMSCs。②与对照组相比,高糖组的骨向分化标志物ALP、OCN、Runx2的mRNA水平明显增加,MAPK通路中ERK、P38、JNK磷酸化水平表达增加。③与Glu B组相比,Glu B+FGF-21组的ALP、OCN、Runx2的mRNA水平降低,ERK、P38和JNK的磷酸化水平降低。④与Glu B+FGF-21组相比,Glu B+FGF-21+MAPK信号转导阻断剂组的ALP、Runx2的mRNA水平进一步降低,且相应的ERK、JNK和P38及其磷酸化水平进一步降低。结论 高糖能促进hBMSCs的骨向分化。高糖环境下FGF-21具有抑制hBMSCs的成骨分化或矿化作用。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞
过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2 的拮抗剂noggin 及Smad1 小干扰
RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt
相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增
高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化
Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到
高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表
达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。
     

姜黄素促进炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

目的 研究姜黄素对炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法 分离、培养大鼠BMSCs,以10 ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发细胞炎症反应,用不同浓度姜黄素处理细胞,CCK-8检测细胞增殖以便筛选出实验所需姜黄素适宜浓度;实验分组为正常组、炎症组和炎症+姜黄素组;碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨分化,实时荧光定量PCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达。结果 成功分离培养BMSCs;低浓度的姜黄素无细胞毒性,1μmol/L为适宜浓度;炎症降低大鼠BMSCs成骨相关基因BSP、Runx2表达,且ALP染色变浅、矿化结节减少;而姜黄素则可以逆转这种趋势,促进炎症状态下成骨相关基因 BSP、Runx2的表达(P＜0.05),较炎症组ALP染色加深,矿化结节增多。结论 姜黄素可以促进炎症微环境下BMSCs成骨分化。     

靶向抑制 PI3K 对PDK-1/Akt信号通路调控成骨细胞分化的影响

目的 通过观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002在成骨细胞分化过程中的影响,探讨PI3K通过调控PDK-1 /Akt信号通路对成骨细胞分化影响的分子机制。方法 采用体外培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)。通过CCK-8检测LY294002的最大安全浓度。对照组使用成骨细胞诱导培养基(OBM)处理BMSC,干预组在OBM中添加LY294002。检测两组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和细胞矿化能力,并分别采用Western-Blot和RT-PCR检测PDK-1 /Akt信号通路及下游蛋白和转录因子基因的表达水平。结果 CCK-8结果提示,在3.2 μM及以下浓度对BMSC的增殖没有影响;LY294002对成骨细胞分化的影响呈剂量依赖性（P＜0.05）;干预组ALP阳性细胞和细胞外基质矿化较对照组明显减少 (P＜0.05); Western-Blot 检测结果显示,干预组p-PDK 1和p-Akt蛋白表达水平较对照组明显降低 (P＜0.05);RT-PCR 结果提示,干预组成骨细胞相关基因ALP和骨钙素（OCN）mRNA较对照组表达明显下降 (P＜0.05)。结论 靶向抑制PI3K可通过PDK-1 /Akt信号通路明显下调成骨细胞相关基因ALP和OCN的表达,并抑制成骨细胞的分化。     

盘龙七片通过调节Wnt/β-catenin通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察盘龙七片对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用并探讨其机制。方法 BMSCs细胞分为对照组和盘龙七片处理组。MTT检测细胞增殖并确定盘龙七片最佳浓度。RT-PCR和western blot分别检测Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。检测骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)及Wnt/β-catenin通路蛋白的表达水平。结果 盘龙七片促进BMSCs增殖,且随着质量浓度的升高增加更明显(P<0.05)。盘龙七片组细胞中Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达高于对照组(P<0.05),骨钙素水平和ALP活性高于对照组(P<0.05);Wnt3和β-catenin的蛋白表达高于对照组(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论盘龙七片能够促进BMSCs细胞成骨分化,且其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin通路产生的。     

双磷酸盐对高糖环境下BMSCs自噬相关因子Beclin1和LC3Ⅱ影响的研究

目的 研究双磷酸盐对高糖环境下骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）自噬相关因子Beclin1和微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅱ的影响。 方法 BMSCs体外分离与培养,进行成骨、成软骨及成脂三向分化诱导与鉴定,配置含浓度梯度10-6~10-9mmol/L双磷酸盐的高糖（30 mmol/L）培养基,采用CCK-8检测BMSCs的增殖活性后选定用于实验的双磷酸盐浓度为10-9 mmol/L。另取BMSCs分为3组:正常对照组（D-葡萄糖5.6 mmol/L）,高糖组（D-葡萄糖30 mmol/L）,高糖（D-葡萄糖30 mmol/L）+双磷酸盐（10-9 mmol/L）组。用real time -PCR检测3组细胞LC3和Beclin1的基因表达,Western blot检测3组细胞LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达水平,透射电镜观察自噬体。 结果 鉴定结果示所得BMSCs具有成骨、成软骨及成脂分化能力。高糖组LC3和Beclin1 mRNA、LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达较正常对照组增高（P<0.01）,而高糖组+双磷酸盐组较高糖组低（P<0.05）;透射电镜显示高糖组细胞中自噬体数量最多,高糖+双磷酸盐组其次,正常对照组最少。 结论 高糖环境下BMSCs自噬水平升高,而双磷酸盐能下调高糖环境下BMSCs自噬相关因子Beclin1和LC3Ⅱ的表达。     

胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响

目的探讨胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响以及机制。方法分离、培养胎鼠颅骨成骨细胞,分别给予不同浓度的胡椒碱处理,采用MTT法检测胡椒碱对成骨细胞毒性的影响;采用碱性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性检测试剂盒检测ALP活性;采用茜素红S染色评估成骨细胞成骨及矿化水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测ALP、I型胶原蛋白α1（COL1A1）、成骨相关转录因子蛋白（OSX）、骨桥蛋白（OPN）、runt相关转录因子2（Runx2）的mRNA表达水平;采用Western blot检测Wnt 1和β-catenin蛋白水平;采用免疫荧光检测β-catenin分布与表达;采用Wnt/β-catenin信号途径特异性拮抗剂IWR-1验证胡椒碱对成骨细胞成骨分化的信号通路。结果在0～60μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱对成骨细胞活力无明显影响（P>0.05）。在0～40μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱呈剂量依赖性促进成骨细胞ALP活性（P<0.01或P<0.001）和矿化结节形成（P<0.05或P<0.01）,促进ALP、COL1A1、OSX、OPN和Runx2的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,促进Wnt 1和β-catenin蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。用IWR-1预处理后,由胡椒碱诱导的成骨细胞的基质矿化受到明显抑制（P<0.01）。结论胡椒碱可通过增强Wnt/β-catenin信号促进成骨细胞的成骨分化。     

EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的初步研究

目的探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制。方法将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标。结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2(3.442 6±0.258 5)倍和Osterix(2.482 3±0.329 2)倍。EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍。以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P<0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100 ml]有进一步下降(P=0.008)。配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix的表达显著下降。结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制BMSC成骨分化。     

miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用

目的探讨在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,miR-144-3p表达的生理功能和作用机制,并预测其靶基因,为成骨细胞 分化的深入研究提供实验依据。方法采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并在体外诱导间充质干细的成骨分化,通过 qRT-PCR 检测成骨分化标志基因（Runx2, OCN）以及miR-144-3p 的表达;通过向BMSCs 株转染miR-144-3p mimic 以及 miR-144-3p inhibitor,检测miR-144-3p 表达对BMSCs分化的影响,并通过Western blot 以及qRT-PCR检测miR-144-3p 靶蛋 白在RNA水平以及蛋白水平的表达变化。结果在体外诱导BMSCs成骨分化过程中,成骨分化标志基因（Runx2, OCN）的 表达量逐渐升髙,而miR-144-3p 的表达量则逐渐降低,到诱导成骨第21 天表达水平最低;检测各组ALP活性发现,相比于 对照组miR-144-3p mimics 转染组ALP活性显著降低（P<0.05）,miR-144-3p inhibitor 转染组ALP活性显著升高（P<0.05）;运 用多种靶基因预测数据库TargetScan、microRNA.org和miRanda对miR-144-3p进行靶基因的预测分析发现,smad4最可能是 miR-144-3p的靶基因;qRT-PCR结果表明,smad4在各组中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;Western blot结果显示,smad4 在miR-144-3p mimics转染组表达显著下降,在miR-144-3p inhibitor转染组则显著升高,相比于对照组差异均有统计学意义（P< 0.05）。结论miR-144-3p参与调控大鼠BMSCs成骨分化,其抑制成骨分化的功能是通过降低smad4转录后的表达水平来实现。     

BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制

目的:探究骨形态发生蛋白内皮细胞前体来源调节因子（BMPER）在成骨分化中的生物学作用。方法:将MC3T3-E1细胞分为对照（control）组、成骨诱导（OM）组和成骨诱导+高糖高脂（OM+HG/PA）组。采用Western印迹法检测各组细胞Runt相关转录因子2（Runx2）、Ⅰ型胶原α1（Col1α1）、BMPER的表达。将空载体对照质粒及BMPER过表达质粒转染到MC3T3-E1细胞中,将细胞分为p-NC和p-BMPER组。使用Western印迹法检测各组细胞BMPER、Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。碱性磷酸酶（ALP）染色检测BMPER对成骨分化的影响。应用非特异性siRNA及合成的靶向沉默BMPER小干扰RNA（siRNA）转染MC3T3-E1细胞,将细胞分为si-NC组及si-BMPER组,使用Western印迹法检测各组细胞Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。结果:与OM组相比,OM+HG/PA组中Runx2、Col1α1、BMPER蛋白表达显著减少（t=7.572、 8.568、10.742,均P< 0.05）。与p-NC组相比,p-BMPER组Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin蛋白表达水平显著升高（t=9.816、8.331、8.413、14.343、9.156,均P<0.05）,ALP染色加深。与si-NC组相比,si-BMPER组Wnt1、Wnt3a、active β-catenin的表达显著下调（t=10.807、8.678、10.167,均P<0.05）。结论:BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

新型胰岛素增敏剂对急性心肌梗死患者炎症因子的抑制作用

目的 探讨新型胰岛素增敏剂(吡格列酮)对急性心肌梗死患者炎症因子热休克蛋白60 (HsP60)和C反应蛋白(CRP)水平的影响.方法 选择2型糖尿病伴急性心肌梗死患者38例,随机分为吡格列酮组(19例)和非吡格列酮组(19例),吡格列酮组应用吡格列酮(艾汀)15mg/d及诺和灵30R皮下注射,非吡格列酮组只应用诺和灵3...