实时荧光定量PCR检测尿液CK20方法的建立

目的:建立一种简便、快速、灵敏度和特异性较好的定量检测尿液CK20方法,用于膀胱移行细胞癌(Transitional cell ear-cinoma of the bladder,TCCB)早期诊断、预后及复发的评估.方法:培养膀胱癌T24细胞,针对CK20基因保守序列设计合成两对引物和Taqman探针,将PCR扩增产物片段克隆,作为定量检测的标准品,优化反应条件,建立快速检测CK20mRNA的实时荧光定量PCR方法,并进行方法学评价.结果:荧光定量PCR检测尿液CK20方法能较好的定量枪出尿液CK20mRNA,检测范围为102～102copies/μ1,灵敏度为102 copies/μ1,特异性好,批内、天间重复性(Coefficient of variation,CV)分别为0.89%和2.45%.结论:成功建立了快速检测尿液CK20的荧光定量PCR方法,为进一步开发出用于TCCB早期诊断、预后及复发评估的定量检测试剂盒奠定了基础.     

膀胱癌患者尿脱落细胞CK20的表达及临床诊断意义

目的观察尿脱落细胞CK20在膀胱癌患者中的表达情况,探讨其临床价值及意义。方法采用RT-PCR检测方法检测35例膀胱癌患者尿脱落细胞CK20的表达情况,并与30例非肿瘤疾病患者CK20的表达情况进行对比分析。结果 35例膀胱癌患者尿脱落细胞CK20 mRNA阳性率为94.29%(33/35),而非肿瘤疾病患者阳性率仅为3.33%(1/30),两组CK20 mRNA阳性率比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。RT-PCR检测法检测尿脱落细胞CK20 mRNA的敏感性为94.26%,特异性为96.67%。不同膀胱癌病理分期、分级的尿脱落细胞CK20 mRNA表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论尿脱落细胞CK20在膀胱癌尿液中表达的敏感率及特异性较高,是目前较为理想的一种膀胱肿瘤标记物,RT-PCR检测法检测尿脱落细胞中CK20有助于膀胱癌的诊断。     

膀胱移行细胞癌患者外周血CK20表达的研究

目的：探讨CK20在膀胱移行细胞癌(TCCB)患者外周血的表达及其意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测63例TCCB患者和19例健康志愿者以及19例非肿瘤患者外周血CK20表达。以CAPDH作为内参照。结果：19例健康志愿者和19例非肿瘤患者外周血CK20的表达均为阴性；63例TCCB患者外周血CK20阳性表达率为25．4％(16／63)，其中T1期为0(0／31)，T2期为12．5％(2／16)，T3期为77．8％(7／9)，T4期为100％(7／7)，CK20阳性表达率随分期增加而增加，T3～4期明显高于T1期和T2期。对T1～3期33例患者随访6个月，其中外周血CK20阴性表达26例未发现远处转移；外周血CK20阳性表达7例中2例发生远处转移。结论：检测外周血CK20表达，可以提示癌细胞的血行播散，对判断预后以及指导治疗具有一定临床价值。     

定量RT-PCR检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达

目的:检测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)mRNA的表达水平,并探讨其临床价值.方法:采用实时荧光定量RT-PCR法检测51例经病理学确诊的结直肠癌患者和30例健康对照者外周血CK20 mRNA的表达水平.结果:结直肠癌患者中CK20 mRNA阳性率为27.45%,而健康对照组阳性率为6.67%,两者相比差异有统计学意义(P<0.025).随着临床分期的提高,患者外周血中CK20 mRNA的表达率随之提高,但各分期间阳性率相比无显著统计学意义(P>0.05).Dukes'C期与D期患者中>10拷贝/ml者高于A期与B期患者.结论:检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达水平可发现早期脱落的肿瘤细胞,对肿瘤微转移的诊断有一定的提示意义.     

巢式PCR检测肺癌患者外周血CK19 mRNA和LUNX mRNA的临床意义

目的 研究肺癌患者外周血中CK19 mRNA,LUNX mRNA的表达及其联合检测的临床意义.方法 采用巢式PCR技术检测50例肺癌患者、20例肺良性疾病患者和20例健康人外周血CK19 mRNA、LUNX mRNA的表达,结合肺癌患者常规病理检查、肿瘤类型、临床分期对临床检测结果的敏感性、特异性进行统计学分析.结果 50例肺癌患者外周血标本中CK19 mRNA阳性25例(50%),LUNX mRNA阳性29例(58%);20例肺良性疾病中CK19 mRNA阳性2例(10%),LUNX mRNA均为阴性;20例健康人外周血CK19 mRNA、LUNX mRNA的表达均为阴性.在肺腺癌、肺鳞癌中,CK19 mRNA的表达阳性率分别为42.8%,55.2%,LUNX mRNA的表达阳性率分别为66.7%,51.7%.Ⅲ,Ⅳ期肺癌CK19 mRNA和LUNX mRNA的表达阳性率高于Ⅰ,Ⅱ期.结论 CK19 mRNA,LUNX mRNA可作为检测肺癌患者外周血微转移的标记物,联合检测有助于提高准确性.     

胃癌患者外周血CK20 mRNA表达及其临床意义

目的:探讨胃癌患者外周血CK20 mRNA表达及临床意义。方法:应用Taq Man定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测58例胃癌患者(其中50例化疗2周期后复查CK20 mRNA)、20例健康对照者外周血CK20 mRNA表达;患者平均随访2年。结果:胃癌患者外周血CK20 mRNA阳性率为46.55%(27/58),显著高于健康对照组,二者差异有统计学意义(P<0.001);单因素分析胃癌患者外周血CK20 mRNA表达与远处转移(P<0.05)和临床分期相关(、期之间比较P<0.05);多因素Logistic回归分析表明:远处转移是影响胃癌患者外周血CK20 mRNA表达的独立因素;化疗2周期后CK20mRNA阳性率无显著下降,但近期疗效无效的患者外周血CK20 mRNA阳性率显著高于近期疗效有效的患者(P<0.05)。平均随访2年后,CK20 mRNA阳性患者与阴性患者的1年生存率分别为34.78%和64.29%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:外周血CK20 mRNA可作为检测胃癌患者肿瘤细胞微转移的分子标志;定期监测胃癌患者外周血CK20 mRNA表达有助于评估化疗疗效和预测预后。     

ΔNp63 mRNA在膀胱癌组织中的表达及意义

目的 探讨ΔNp63 mRNA在膀胱移行细胞癌(TCCB)中的表达及意义.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测48例TCCB患者肿瘤组织、10例对照膀胱组织ΔNp63 mRNA的表达,并分析ΔNp63 mRNA表达与TCCB临床分期、病理分级等的关系.结果 48例TCCB组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率为75.0%(36/48),对照组膀胱组织中ΔNp63蛋白表达阳性率为0.0%(0/10), TCCB组ΔNp63 mRNA表达阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).不同临床分期肿瘤组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率、各组间ΔNp63 mRNA表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).不同病理分级肿瘤组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率、各组间ΔNp63mRNA表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TCCB组ΔNp63 mRNA表达水平均明显高于对照组,提示ΔNp63与TCCB的发生密切相关,其可能为TCCB发生的重要促进因素,ΔNp63 mRNA表达水平和TCCB的临床分期、病理分级没有相关性,故ΔNp63在TCCB进展中的作用有待进一步研究.     

细胞角蛋白20和生存素基因在老年结肠癌患者外周血中的表达及其意义

目的 检测老年结肠癌患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)和生存素(survivin)基因的表达,探讨二者与肿瘤诊断、转移的关系.方法 选取老年结肠癌患者72例、癌前病变者54例及正常对照者42例,用实时定量反转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测CK20和生存素基因的转录,并分析二者与临床病理因素之间的关系.结果 正常对照组外周血中未检测到CK20和生存素mRNA的转录;癌前病变者外周血生存素mRNA的转录率为7.4%(4/42),平均拷贝数为(2.22±0.86);结肠癌患者外周血CK20和生存素mRNA转录率分别为47.2%(34/72)和73.6%(53/72),二者的转录量与Dukes分期及淋巴结转移有关.生存素mRNA高转录者5年生存率(58.6%)显著低于低转录者(90.7%),差异有统计学意义(P＜0.01).回归分析发现,生存素的表达、淋巴结转移及Dukes分期是影响患者预后的独立因素.结论 CK20 mRNA和生存素mRNA在老年结肠癌患者中过表达,可作为诊断微转移和评估预后的客观指标.     

肺癌患者外周血BJ-TSA-9,LUNX和CK19 mRNA的检测及其临床意义

目的 观察肺癌患者外周血循环中BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA的表达情况,并探讨BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA联合检测的临床意义.方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)技术检测84例肺癌患者、32例肺良性病变患者和20例健康人.结果 肺癌患者外周血中BJ-TSA-9,LUNX和CK19 mRNA阳性率分别为59.5%,40.4%和22.6%.32例良性病变者外周血中BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA阳性率分别为9.3%,12.5%和6.3%.20例健康志愿者外周血中无BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA表达.Ⅳ期肺癌患者BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA阳性率明显高于Ⅱ期和Ⅲ期(P<0.05).结论 BJ-TSA-9,LUNX和CK19 mRNA均可作为RT-PCR法检测肺癌患者外周血微转移的肿瘤标志物.BJ-TSA-9mRNA在有效率上优于LUNX mRNA和CK19 mRNA,肺癌患者外周血中检测出BJ-TSA-9 mRNA提示可能有血循环转移.     

非小细胞肺癌患者外周血CK19和LUNX mRNA的检测及意义

目的:检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者CK19 mRNA和LUNX mRNA的表达情况,探讨其作为微转移检测分子标志物的可行性。方法:选择初治的NSCLC患者62例,以肺部良性疾病10例和健康对照10例作为对照组,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR),检测患者外周血的CK19 mRNA和LUNX mRNA的表达。结果:62例NSCLC患者中外周血CK19 mRNA表达阳性率33.9%(21/62),明显高于非肿瘤组的5%(1/20)(P=0.012);NSCLC组外周血LUNX mRNA表达阳性率29.0%(18/62),明显高于非肿瘤组的0%(0/20)(P=0.007);外周血CK19mRNA和LUNX mRNA表达阳性率与病理分期、病理类型、肿瘤分化程度未见明显相关;外周血CK19 mRNA和LUNX mRNA表达未见明显相关(P=0.376)。结论:CK19 mRNA和LUNX mRNA可作为检测非小细胞肺癌患者微转移特异、敏感的分子标志物,可能有助于早期诊断肺癌转移,从而指导临床分期和治疗。     

CD24蛋白在膀胱癌中的表达及意义

目的探讨CD24蛋白在膀胱癌中的表达及其与膀胱癌临床特征的关系。方法采用免疫组化方法对43例膀胱肿瘤、10例正常膀胱组织中CD24的表达进行检测。结果CD24蛋白主要表达于膀胱恶性肿瘤细胞的细胞膜和胞浆中,其阳性例数为27例,阳性率为62．8％,在正常膀胱组织中1例阳性表达,阳性率10％。在43例膀胱肿瘤石蜡标本中,CD24表达强度与肿瘤分级和分期有关,恶性程度高的肿瘤阳性表达高于恶性程度低的肿瘤,浸润性癌也高于非浸润性癌（P〈0．05）。结论①CD24在膀胱癌中的表达明显高于在正常膀胱组织中的表达。②CD24高表达与膀胱移行细胞癌的分化和浸润性进展密切相关。③CD24高表达可能成为判断膀胱移行细胞癌预后的一个重要指标。     

膀胱移行细胞癌中S100A4蛋白和钙粘蛋白-E表达及意义

目的通过检测S100A4蛋白和钙粘蛋白-E在膀胱移行细胞癌组织中的表达,探讨其在膀胱移行细胞癌发生、发展中所起的作用。方法采用免疫组织化学方法检测S100A4蛋白和钙粘蛋白-E在38例膀胱移行癌组织及其相应癌旁组织中的表达。结果 S100A4蛋白在膀胱移行细胞癌及癌旁膀胱组织中的阳性表达率分别为55.3%（21/38）、0.0%（0/38）。膀胱移行细胞癌组织中S100A4蛋白水平明显高于癌旁膀胱组织（P〈0.05）,在膀胱移行细胞癌组织中的表达与肿瘤病理分级（P〈0.05）、临床分期（P〈0.05）呈正相关,与有无淋巴结转移相关（P〈0.05）。E-cad蛋白在膀胱移行细胞癌组织中及癌旁组织中的阳性表达率分别为47.4%（18/38）、81.6%（31/38）,有显著性（P〈0.05）。膀胱移行细胞癌组织中E-cad蛋白阳性表达率与患者病理分级、临床分期及淋巴结转移有关（P〈0.05）。膀胱移行细胞癌组织中,S100A4蛋白与E-cad蛋白的表达呈负相关（P〈0.05）。结论 S100A4蛋白及E-cad蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达变化与肿瘤的发生、进展、预后密切相关,是判断其生物学行为、预测转移趋势极具价值的指标。     

四连接素在膀胱移行细胞癌上的表达及意义

目的 分析四连接素在膀胱移行细胞癌中的表达及相关意义。方法采用免疫组化法检测30例正常膀胱组织及146例膀胱移行细胞癌组织中四连接素的表达,比较其在不同的临床分期和病理分级中的差别,并分析四连接素的表达与预后的关系。结果四连接素在膀胱移行细胞癌中的阳性表达明显高于正常者（P〈0．05）;不同临床分期中,T1～T4期患者四连接素阳性表达率均明显高于Ta期患者（均P〈0.05）,T2～T4患者四连接素阳性表达率均明显高于T1期患者（P〈0.05）;不同病理分级中,仅G3级别患者四连接素阳性表达率高于级别G1、G2患者,G1、G2级别患者四连接素阳性表达率并无明显差异（P〉0.05）。此外,四连接素在膀胱移行细胞癌中的阳性表达强度与预后呈负相关（P〈0.05）。结论四连接素参与了膀胱移行细胞癌浸润和转移的过程,是预测膀胱移行细胞癌预后的重要指标。     

喉癌患者外周血CK19mRNA及CK20mRNA的表达

目的研究喉癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA的表达,探讨其I临床意义。方法采用巢式RT-PCR技术检测喉癌患者术前外周血中CK19mRNA、CK20mRNA的表达。结果48例喉癌患者外周血中CK19mRNA阳性率为37．5％（18／48）,CK20mRNA阳性率45．8％（22／48）。10例肿瘤组织中CK19mRNA阳性率为100％（10／10）。CK20mRNA阳性率80％（8／10）;10例声带息肉患者外周血为阴性对照,CK19mRNA阳性率为10％（1／10）,CK20mRNA阳性率为0。结合临床病理资料,喉癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA表达与喉癌T分期、临床分期及淋巴结转移存在相关性,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论采用巢式RT—PCR技术,对喉癌患者外周血单个核细胞CK19mRNA和,或CK20mRNA的检测,在分子生物学水平对喉癌细胞对周围组织的浸润及局部扩散提供了参考,有助于指导临床治疗。     

葡萄糖和胰岛素对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA表达的影响

目的本试验模拟糖尿病病程不同阶段患者体内葡萄糖和胰岛素浓度的变化,研究不同浓度的葡萄糖和胰岛素对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA表达的影响。方法体外常规培养Colon 26肿瘤细胞。根据所用培养液外加葡萄糖和胰岛素浓度的不同,将实验所用细胞共分12组：A组（对照组）RPMI 1640培养液;B组加5 mmol/L葡萄糖;C组加10 mmol/L葡萄糖;D组加25 mmol/L葡萄糖;E组加5μIU/ml胰岛素;F组加25μIU/ml胰岛素;G组加125μIU/ml胰岛素;H组加5 mmol/L葡萄糖＋5μIU/ml胰岛素;K组加5 mmol/L葡萄糖＋125μIU/ml胰岛素;L组加25 mmol/L葡萄糖＋125μIU/ml胰岛素;M组加25 mmol/L葡萄糖＋5μIU/ml胰岛素;N组加25 mmol/L葡萄糖＋1.25μIU/ml胰岛素。每组设3个复孔,置37℃5%CO2饱和湿度的培养箱培养48 h,收集细胞后抽提总RNA,RT-PCR同时扩增目的片段TGF-β1和内参照β-actin,琼脂糖凝胶电泳,扩增产物在凝胶成像系统上扫描分析,计算TGF-β1 mRNA相对表达量。整个实验过程均重复3次。结果D组TGF-β1 mRNA的表达（0.768±0.017）高于A组（0.540±0.012）,差异有显著性（P〈0.01）;而B、C组TGF-β1 mRNA的表达（0.545±0.033、0.558±0.035）与A组相比均无显著性差别（P〉0.05）。E、F、G组对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达（分别为0.566±0.039、0.549±0.030、0.531±0.022）与A组相比无显著性差别（P〉0.05）。L、M、N组的TGF-β1 mRNA表达（分别为0.889±0.028、0.764±0.027、0.752±0.035）均高于A组（0.540±0.012）,差异有显著性（P〈0.01）;而H、K组的TGF-β1 mRNA表达（0.550±0.037、0.537±0.025）与A组相比均无显著性差别（P〉0.05）。结论高浓度的葡萄糖能够上调Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达,不同浓度的胰岛素不影响Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达,高浓度的葡萄糖和胰岛素同时作用能够上调Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达     

△Np63和VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨△Np63和VEGF在膀胱移行上皮癌（TCCB）中的免疫组化表达及与膀胱癌发生发展中可能的作用和相互关系。方法用免疫组化染色方法对56例膀胱移行上皮癌组织行△Np63和VEGF检测,将结果与病理分级、分期和预后进行分析。结果膀胱移行细胞癌中△Np63和VEGF阳性表达率明显高于正常膀胱粘膜（P〈0．05）。△Np63和VEGF在低分化、浸润性癌组织中的阳性表达率明显高于高分化、浅表性癌组织,在复发病例中的阳性表达率显著高于初发病例,2个标记物在膀胱癌的病理分级、分期和预后之间表达差异有统计学意义（P〈0．05）。采用Spearman等级相关性分析,△Np63与VEGF呈正相关。结论△Np63在膀胱癌中的异常表达是膀胱癌组织向浸润性发展和恶性程度增加的重要原因之一,可能通过促进肿瘤血管生成发挥促癌作用,△Np63可能是判断TCCB预后的生物学指标。     

可溶性白细胞抗原-G在子痫前期患者的表达及意义

目的探讨可溶性人类白细胞抗原-G（SHLA-G）在子痫前期发病中的意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定45例子痫前期患者（轻度20例,重度25例）,正常足月妊娠者49例外周静脉血及靠近胎盘处脐静脉血中SHLA-G水平。结果子痫前期外周血SHLA-G浓度（6.61±2.51）μg/L,正常组外周血SHLA-G浓度（22.03±3.12）μg/L,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;子痫前期脐静脉血SHLA-G浓度（7.23±2.12）μg/L,正常组脐静脉血SHLA-G浓度（25.21±3.70）μg/L,差异有统计学意义（P〈0.05）。子痫前期外周血SHLA-G浓度：重度（5.38±2.38）μg/L,轻度（7.17±2.41）μg/L,差异有统计学意义（P〈0.05）,子痫前期脐静脉血SHLA-G：重度（6.08±1.90）μg/L,轻度（8.09±1.87）μg/L,差异有统计学意义（P〈0.05）;子痫前期血清SHLA-G表达水平与胎儿发育无相关性（r=0.065、0.270,P=0.711、0.116）;子痫前期血清SHLA-G的表达水平与子痫前期发病时间无相关性（r=0.565、0.923,P=0.586、0.380）。结论 SHLA-G水平的下降可能导致子痫前期的发病,且与子痫前期疾病的严重程度相一致,而与疾病发生早晚和胎儿宫内生长情况无相关性。     

健骨颗粒含药血清对成骨样细胞增殖及PCNA、Cyclin D1 mRNA表达的影响

目的:观察健骨颗粒含药血清对成骨样细胞增殖及PCNA、Cyclin D1 mRNA表达的影响。方法:制备健骨颗粒含药血清和生理盐水血清,分别干预体外培养的成骨样细胞ROS17/2.8,MTT法检测细胞增殖,流氏细胞术检测细胞周期,荧光定量PCR检测PCNA、Cyclin D1 mRNA表达。结果:与同浓度生理盐水血清组相比,中药血清组10%-30%浓度促细胞增殖均有显著性差异(P<0.05),其中浓度为20%时,两组间有非常显著性差异(P<0.01);中药血清组G0/G1期细胞比例明显低于同期生理盐水血清组,有非常显著性差异(P<0.01)。G2/M期、S期细胞比例及PI在干预48h时均高于同期生理盐水血清组,具非常显著性差异(P<0.01)。中药血清组较理盐水血清组PCNA、Cyclin D1 mRNA表达升高,组间有显著性差异(P<0.05)。结论:健骨颗粒含药血清能促进成骨样细胞的增殖、提高PCNA、Cyclin D1 mRNA表达。     

CK19，CDK4在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨细胞角蛋白19（CK19）和细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK4）在膀胱移行细胞癌中的表达情况及意义。方法应用免疫组化SABC法检测40例膀胱癌患者中CK19,CDK4的表达水平。结果CK19;CDK4的阳性表达与膀胱癌复发程度密切相关（P〈0．05）。结论、CK19,CDK4表达与肿瘤复发密切相关。