成人真皮成纤维细胞原代培养及鉴定

目的探讨建立成人真皮成纤维细胞原代培养方法。方法新鲜皮肤组织用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)消化,分离上皮和真皮层,分别采用组织块法和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法分离真皮层成纤维细胞。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期分布。结果培养48 h,经胶原蛋白酶分离得到的成纤维细胞95%以上贴壁,同时细胞开始从组织块边缘贴壁延伸生长。培养5 d时,组织块周围有大量细胞贴壁增殖。细胞生长迅速,第7天,增殖细胞层铺满培养皿。组织块法分离的成纤维细胞中可混杂少量上皮细胞团,而胶原蛋白酶消化法分离的细胞波形蛋白阳性率接近100%,几乎均为成纤维细胞。结论胶原蛋白酶消化和组织块法均是快速、经济、有效获取真皮成纤维细胞的方法。胶原蛋白酶消化法可以更有效避免上皮细胞污染,分离的真皮成纤维细胞有较好的增殖能力。     

成年大鼠心脏成纤维细胞的分离培养

目的；建立成年大鼠心脏成纤维细胞的离体培养模型。方法：以组织块消化法分离细胞，以差数贴壁法去除其它细胞，常规培养、传代、免疫组化染色进行细胞鉴定并绘制生长曲线观察细胞传代后成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果：第2－4代细胞生长良好、稳定，波形蛋白染色阳性，VⅢ因子相关抗原及肌动蛋白染色阴性。结论：组织块消化法是一种适用于成年大鼠心脏成纤维细胞分离培养的简便方法，第2－4代细胞适于实验。     

乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。方法：选取新出生1 d的新西兰白兔，采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化心脏组织，差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞；使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，绘制细胞生长曲线；采用CCK-8法检测细胞活力；波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度；Western blot法检测异丙肾上腺素刺激心脏成纤维细胞后Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）水平。结果：差速贴壁90 min后在相差显微镜下可见部分成纤维细胞已贴壁生长；3 d后成纤维细胞数量较前增多，形态多样，多为不规则的多边形及扁平形；5 d时成纤维细胞数量显著增多（P<0.05），细胞形态趋于多样性，细胞间完全融合；细胞生长曲线类似“S”形。波形蛋白阳性率可达95%。CCK-8实验结果显示在4～5 d细胞活力最强（P<0.05）；给予第2代心脏成纤维细胞异丙肾上腺素刺激48 h后，Col I及α-SMA水平显著增加（P<0.05）。结论：本研究建立了乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。     

成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性

目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法.方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养.在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达.结果:酶联合消化法分离培养的细胞1d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4d后,可见细胞从组织块边缘长出,7d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97％.两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61％和30.87％,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24％和28.05％;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期.两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性.结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养.与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞.     

胚胎成纤维细胞和Ⅳ型胶原黏附分选表皮干细胞的比较研究

目的比较以Ⅳ型胶原和胚胎成纤维细胞黏附分选表皮干细胞的效率，探索从皮肤中快速表皮干细胞分选的有效方法。方法使用DispaseⅡ和CollagenaseⅠ混合酶、胰酶分步消化皮肤得到的细胞悬液，实验组用胚胎成纤维细胞，对照组使用Ⅳ型胶原，分别作为黏附基质，在细胞培养板中对表皮干细胞进行黏附筛选，培养5d后统计各组表皮干细胞克隆形成数量，评价筛选效率。结果经抗β-整合素单抗和抗角蛋白K19单抗免疫细胞染色确证形成克隆的细胞是表皮干细胞，在两个细胞密度水平，实验组和对照组培养出的表皮干细胞克隆数量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论使用成纤维细胞分选表皮干细胞与使用Ⅳ型胶原方法分选效率相当，成纤维细胞条件培养液对黏附效率没有影响，但能促进表皮干细胞生长。     

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

背景：利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异,通过优化心肌细胞的培养条件,一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。 目的：探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。 方法：采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化,差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件,免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。 结果与结论：心肌培养48 h时Troponin T阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法,心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好,且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。     

人皮肤成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的：建立人皮肤成纤维细胞的体外原代及传代培养并鉴定的技术方法.方法：取临床无菌切除的幼儿包皮,利用胶原酶分离表皮和真皮,将真皮剪成肉糜状,再用胰蛋白酶消化,接种于培养皿,加少许含10％小牛血清的DMEM-高糖培养液进行培养,次日补加培养液.原代长满后,进行传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及组化鉴定.结果：接种次日倒置镜下可见有长梭形细胞迁出、生长,5-6d进行传代,传代后约5d长满,可长期传代.免疫组化Vimentin表达阳性.结论：该方法可快速高效获得构建组织皮肤真皮所需的成纤维细胞.     

人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞生长的作用

目的：研究人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞（EG细胞）生长的作用。方法：采用组织块体外培养法体外培养人EG细胞,不添加任何细胞因子,利用源于胚胎组织自身的成纤维细胞作为饲养层,收集培养3d和9d的上清液,用抗体夹心ABC-ELISA法定量检测其白血病抑制因子（LIF）、干细胞生长因子（SCF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。培养的细胞用免疫细胞化学法进行SSEA-3、OCT-4的检测。结果：培养9d的上清液中3种因子均含量为LIF55．25pg／ml、SCF90．39pg／ml、bFGF26．06pg／ml．均高于培养3d相应的平均含量。培养的细胞SSEA-3、OC-4呈强阳性表达。结论：上清液中LIF、SCF和bFGF的含量与胚胎成纤维细胞的生长呈正比,胚胎成纤维细胞能分泌这些细胞因子,以维持EG细胞体外增殖并抑制其分化。     

人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养及生物学差异

背景:成纤维细胞是创伤愈合过程中的主要效应细胞,对瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养可为体外研究瘢痕疙瘩提供基础。目的:比较体外培养的人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为体外研究瘢痕疙瘩提供平台。方法:应用组织微粒贴壁法,对人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞进行原代培养、传代培养、冻存及复苏,观察二者的生长增殖情况及差异。结果与结论:瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同;体外培养的成纤维细胞在液氮中冻存后,细胞复苏状态良好,接种后绝大部分细胞存活,与冻存前无明显差异。说明瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞及正常皮肤来源的成纤维细胞生长增殖无明显差异,且均可成功冻存和复苏。     

C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备

背景：昆明小鼠胚胎成纤维细胞是目前最常用的饲养层细胞,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层的研究鲜有报道。目的：体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,制备饲养层,力求扩大小鼠胚胎成纤维细胞的来源。方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,研究其生长规律,并制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,检测干细胞在所制备饲养层上的生长状态。结果与结论：不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞数量多,增殖活跃。在细胞冻存后1,2周、1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞在第2-5代增殖旺盛,第6代以后细胞增殖出现明显下降。种植到培养皿上的C57BL/6小鼠饲养层细胞在种植后3 d内活力高,种植4 d以后细胞活力急剧下降。所以C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞来源的饲养层的最佳使用时间为灭活后3 d内,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层一样,能很好地支持胚胎干细胞及诱导多能干细胞生长。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Hepatocyte progenitors in man and in rodents--multiple pathways, multiple candidates

In severe injury, liver-cell progenitors may play a role in recovery, proliferating, and subsequently differentiating into mature liver cells. Identifying these progenitors has major therapeutic potential for ex vivo pharmaceutical testing, bioartificial liver support, tissue engineering and gene therapy protocols. Potential liver-cell progenitors have been identified from bone marrow, peripheral blood, cord blood, foetal liver, adult liver and embryonic stem cells. Differences and similarities are found among cells isolated from rodents and humans. This review will discuss identifying markers and differentiation potential in in vitro and in vivo models of these putative progenitors in both humans and rodents.     

On the possible origin of extra-epithelial enterochromaffin cells by budding from the crypts of Lieberkuhn

This study was undertaken to test Pierre Masson's still unconfirmed theory that extra-epithelial enterochromaffin cells in the gut arise in adult life by budding from the crypts of Lieberkuhn under conditions of low grade inflammation. Appendices (900) were reviewed and 19 were selected for serial section study because in random sections they showed lateral fusion of the crypts, one of the key features described by Masson. Ten specimens without crypt fusion served as controls. Sixteen of the 19 study specimens and one of the control specimens showed budding, averaging one bud in every 88 sections. Most buds were in direct contact with Schwann cells in the adjacent lamina propria and 45 per cent of them contained enterochromaffin cells. There was also histologic evidence linking buds and lateral crypt fusion to low grade inflammation. Masson's ideas are, therefore, confirmed insofar as the existence of buds and their relationship to enterochromaffin cells, Schwann cells, and inflammation is concerned. The actual separation of buds from the crypts to form extra-epithelial enterochromaffin cells has yet to be proved.     

大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离及鉴定

目的建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,并探索其分离及鉴定方法。方法雄性Wistar大鼠每天1次连续灌胃给予不同剂量二乙酰氨基芴(2-AAF熏5、10、15、20、25mg/kgBW),第5天行标准的2/3肝切除术,术后按各自剂量继续给予11天,不同时间取肝脏组织,行甲胎蛋白、细胞角蛋白18及19染色并观察。以确定的2-AAF最佳剂量制备大鼠肝干细胞增殖模型,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠肝卵圆细胞,光镜、电镜下观察细胞特点,并进行上述细胞表型标志免疫组化染色。结果2-AAF15mg/kgBW能建立较理想的肝卵圆细胞增殖模型。HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增殖的嗜碱性小细胞,电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点,免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19染色阳性,白蛋白及白细胞共同抗原(LCA)染色阴性。分离所得底层细胞,光镜下表现大小不等、不规则圆形细胞,体积较小,细胞核/浆比例较大,电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,余同增殖细胞特点,免疫组化染色与增殖细胞表现相同细胞表型特点。结论本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞,符合肝卵圆细胞的形态特点、超微结构及细胞表型标志特点。     

人外周血树突状细胞-乳腺癌细胞融合细胞

目的：探讨树突状细胞—肿瘤细胞融合细胞的形态特性，为研制融合细胞疫苗提供形态学依据。方法：将免疫磁珠法分离的人外周血树突状细胞与人乳腺癌细胞株MCF7融合，瑞氏—姬姆萨染色观察；扫描电镜观察树突状细胞、融合细胞的表面超微结构。结果：树突状细胞与MCF细胞按10：1比例融合后，一个乳腺癌细胞可以与一个或多个树突状细胞相融合；扫描电镜下可见分离的树突状细胞表面有突起，树突状细胞/MCF7融合细胞具两种亲代细胞的表面超微结构特点。结论：树突状细胞与人乳腺癌细胞融合后无明显的形态改变。     

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。     

人羊膜上皮细胞上清液对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肿瘤作用

目的探讨人羊膜上皮细胞(h AECs)上清液对体外培养的肝癌细胞系BEL-7402细胞迁移、增殖与凋亡的影响。方法 BEL-7402细胞随机分为5组,其中对照组不加h AECs上清液,其余4组加入体积分数分别为6.25%、12.5%、25%和50%的h AECs上清液作用24 h后,通过划痕实验、MTT试验和流式细胞术检测BEL-7402细胞迁移、增殖和凋亡;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达量。结果 h AECs上清液能剂量依赖性地抑制BEL-7402细胞迁移、增殖并诱导凋亡(P0.05);25%和50%h AECs上清液组BEL-7402细胞caspase-3和caspase-8蛋白的切割片断蛋白定量明显高于对照组(P0.05)。结论 h AECs上清液对体外培养的BEL-7402细胞具有一定的抗肿瘤作用。     

Harnessing innate and adaptive immunity for adoptive cell therapy of renal cell carcinoma

The development of immunotherapies for renal cell carcinoma (RCC) has been the subject of research for several decades. In addition to cytokine therapy, the benefit of various adoptive cell therapies has again come into focus in the past several years. Nevertheless, success in fighting this immunogenic tumor is still disappointing. RCC can attract a multitude of different effector cells of both the innate and adaptive immune system, including natural killer (NK) cells, γδ T cells, NK-like T cells, peptide-specific T cells, dendritic cells (DC), and regulatory T cells (Tregs). Based on intensive research on the biology and function of different immune cells, we now understand that individual cell types do not act in isolation but function within a complex network of intercellular interactions. These interactions play a pivotal role in the efficient activation and function of effector cells, which is a prerequisite for successful tumor elimination. This review provides a current overview of the diversity of effector cells having the capacity to recognize RCC. Aspects of the functions and anti-tumor properties that make them attractive candidates for adoptive cell therapies, as well as experience in clinical application are discussed. Improved knowledge of the biology of this immune network may help us to effectively harness various effector cells, placing us in a better position to develop new therapeutic strategies to successfully fight RCC.     

皮肤树突状细胞亚群研究进展

皮肤树突状细胞(DC)作为重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答或自身耐受的发生中扮演着非常重要的角色.皮肤免疫系统中定居着多种DC亚群,主要包括表皮层中的郎格汉斯细胞(LC)与真皮层中的各种真皮DC亚群.健康皮肤中的DC亚群主要有表皮LC、真皮DC(dDC)和浆细胞DC(pDC),dDC又分为Langerin+ dDC及Langerin-dDC等.但在炎症性皮肤,如过敏性皮炎、银屑病等病变皮肤中则存在着炎症性DC亚群.DC由于其复杂的异质性群体,导致了其各亚群的特殊化功能.皮肤DC亚群的特殊化功能,为皮肤性疾病的临床治疗及新型疫苗的研发设计等都提供了良好的新策略.     

The molecular makeup and function of regulatory and effector synapses

Summary:  Physical interactions between T cells and antigen-presenting cells (APCs) form the basis of any specific immune response. Upon cognate contacts, a multimolecular assembly of receptors and adhesion molecules on both cells is created, termed the immunological synapse (IS). Very diverse structures of ISs have been described, yet the functional importance for T-cell differentiation is largely unclear. Here we discuss the principal structure and function of ISs. We then focus on two characteristic T-cell–APC pairs, namely T cells contacting dendritic cells (DCs) or naive B cells, for which extremely different patterns of the IS have been observed as well as fundamentally different effects on the function of the activated T cells. We provide a model on how differences in signaling and the involvement of adhesion molecules might lead to diverse interaction kinetics and, eventually, diverse T-cell differentiation. We hypothesize that the preferred activation of the adhesion molecule leukocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) and of the negative regulator for T-cell activation, cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4), through contact with naive B cells, lead to prolonged cell–cell contacts and the generation of T cells with regulatory capacity. In contrast, DCs might have evolved mechanisms to avoid LFA-1 overactivation and CTLA-4 triggering, thereby promoting more dynamic contacts that lead to the preferential generation of effector cells.