雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响

目的初步探讨雷洛昔芬对成骨细胞骨形成作用机制。方法采用新生大鼠颅盖骨酶消化法体外培养成骨细胞,在培养液中加入不同浓度雷洛昔芬（0、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）,在共同条件下培养。测定各项骨形成指标（增殖测定、碱性磷酸酶活性定量和矿化结节形态计量）。结果雷洛昔芬（10^-8mol/L组和10^-7mol/L组）的MTT、ALP测试结果及矿化结节形态计量高于对照组,且有统计学意义,P〈0.05。结论雷洛昔芬能够促进大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、分化及矿化,与雌激素作用类似。     

脱氢表雄酮通过丝裂活化蛋白激酶途径促进成骨细胞增殖的研究

目的研究脱氢表雄酮(DHEA)促进成骨细胞增殖的作用和机制。方法取新生2～4d的BALB/c小鼠颅骨,用酶消化法进行成骨细胞原代培养,以细胞形态学和碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定。取传1代成骨细胞给予不同浓度DHEA,在不同培养时间后,应用光镜、电镜、四唑盐(MTT)法及流式细胞术(FCM)检测细胞的生长和增殖;同时用免疫印迹法检测磷酸化细胞外信号调控激酶(p44/42)的表达。结果10-8～10-6mol/L的DHEA可明显促进小鼠成骨细胞的生长和增殖,经10-7mol/LDHEA处理3d后的细胞,增殖指数明显增加(P<001);在10-9～10-6mol/L浓度范围内,DHEA能明显提高p44/42的表达,以10-8mol/L浓度的作用最佳(P<001),该作用可被U0126阻断。结论DHEA能够促进小鼠成骨细胞生长和增殖,其作用与激活丝裂活化蛋白激酶信号途径有关。     

Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞

目的建立科学有效的大鼠成骨细胞体外培养模式,建立成熟合理的体外培养大鼠成骨细胞鉴定程序。方法采用I型胶原酶阶段消化法来消化新生大鼠乳鼠颅骨,来获得成骨细胞进行体外培养、扩增和鉴定。通过绘制成骨细胞生长曲线,倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,基质钙结节形成观察;进行钙-钴法碱性磷酸酶(ALP)染色;I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。结果Ⅰ型胶原酶改良阶段消化法获得的大鼠成骨细胞纯度较高,增殖较快;ALP染色可见体外培养成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒;免疫组化法检测I型胶原可见成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色,显微镜计数阳性细胞比例为87.3%;体外培养超过3w的成骨细胞可见基质钙结节形成。结论Ⅰ型胶原酶阶段消化法原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。     

依普拉芬对大鼠成骨细胞增殖分化及一氧化氮合成的影响

目的研究依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖分化以及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节以及培养基中NO浓度。结果与阴性对照组相比,依普拉芬可增加成骨细胞数量(P<0.01),提高细胞的ALP活性和促进钙化结节形成,增加培养液中NO浓度(P<0.01)。其中,依普拉芬浓度在10~8~10~5mol/L之间作用最为显著。结论一定浓度的依普拉芬可以促进体外培养成骨细胞的增殖、分化的作用,这种作用可能是通过增加细胞内NO合成进行调控的。     

阿托伐他汀钙对体外培养成骨细胞增殖、分化和矿化的影响研究

目的 研究阿托伐他汀钙对体外培养SD大鼠成骨细胞（osteoblast,OB）的增殖、分化、矿化能力的影响.方法 取出生24 h内SD大鼠颅骨,混合酶消化法培养OB,以细胞形态学和碱性磷酸酶染色鉴定.取第2代OB给予10^-5 mol/L、10^-6 mol/L、10^-7 mol/L三种不同浓度的阿托伐他汀钙,并设空白对照组、雌激素（E2）10^-8 mol/L对照组,培养72 hr,观察OB的增殖能力（MTT法）、碱性磷酸酶活性（ALP）（对-硝基苯磷酸盐即PNPP法）,培养1个月后观察OB矿化结节形成功能（茜素红染色）.结果 1个月后,在OB形成的矿化结节数量上,阿托伐他汀钙10^-5 mol/L组与空白对照组比较,其促进作用有统计学意义（P＜0.05）;在面积上有增加作用.在经阿托伐他汀钙处理3 d后OB的增殖率和ALP活性有一定促进作用,但无统计学意义（P＞0.05）.结论 阿托伐他汀钙对OB的增殖和分化有促进作用.高浓度阿托伐他汀钙能使OB形成矿化结节数量和面积有提高作用.     

糖基化终末产物促进大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的 观察糖基化终末产物对体外培养的血管平滑肌细胞钙化的影响.方法 在含10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养液中加入不同浓度(0、50、100、200 mg/L和400 mg/L)的糖基化终末产物与大鼠血管平滑肌细胞孵育不同时间.采用磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,甲-酚酞络合酮方法测定钙含量,实时定量逆转录聚合酶链反应检测成骨细胞特异性核心结合因子、碱性磷酸酶以及骨桥蛋白基因表达,蛋白免疫印迹检测成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白蛋白表达.结果 与对照组相比,糖基化终末产物随作用时间延长和浓度增加,细胞钙含量增加(P<0.05),升高碱性磷酸酶活性和基因表达(P<0.05),促进成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白基因及蛋白表达(P<0.01).结论 糖基化终末产物可促进体外培养的大鼠血管平滑肌细胞钙化.     

鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响

目的研究不同浓度鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响,旨在为未来抑制成骨细胞增殖的治疗提供参考。方法在新生SD大鼠颅骨成骨细胞培养液中分别加入0(空白对照组)、1、10、20、30、40μmol/L浓度的鱼腥草素,采用细胞计数试剂盒(CCK)-8测定不同浓度鱼腥草素对大鼠成骨细胞的增殖能力,采用茜素红染色法评价矿化结节情况,采用Western印迹法测定碱性磷酸酶蛋白(ALP)表达活性。结果经CCK-8法检测成骨细胞增殖结果显示,鱼腥草素作用2、7 d后,空白对照组、1、10、20、30、40μmol/L组吸光度值随着浓度增加均呈下降趋势,各时点各组吸光度值差异有统计学意义(P0.05);成骨诱导培养7、14 d后,茜素红染色结果显示,10、20μmol/L组矿化结节数多于其他各组,40μmol/L组培养各时点矿化结节数最少,后由少至多依次为空白对照组、30μmol/L组、1μmol/L组,组间差异有统计学意义(P0.05);各时间点,10、20μmol/L组ALP活性最高,30、40μmol/L组ALP活性抑制,随培养时间延长,这种活性促进与抑制的情况继续增强,组间差异有统计学意义(P0.05)。结论鱼腥草素对成骨细胞增殖、分化、矿化有抑制功效,可调节骨代谢,可能对骨质疏松的防治有积极意义。     

补骨脂素对成骨细胞核因子-κB受体激活配体和骨保护素表达的影响

目的研究补骨脂素(psoralen,PSO)对体外培养的小鼠成骨细胞(OB)分化及核因子-κB受体激活配体(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法取第1代BALB/c小鼠颅盖骨成骨细胞,将PSO以0.1、1、10μmol/L3种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,MTT法观察各组药物对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲线;用PNPP法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;RT-PCR法检测成骨细胞OPG和RANKL的转录水平。结果细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均随时间延长而增加,中、高浓度PSO能显著提高成骨细胞的ALP活性,促进OPG、RANKL的表达(P<0.05),OPG/RANKL升高(P<0.05)。结论低浓度PSO(0.1μmol/L)对骨更新作用不明显,而中、高浓度PSO(1、10μmol/L)能通过上调OPG、RANKL mRNA表达及OPG/RANKL比例,促进成骨细胞的生成功能,增强骨更新。     

橘红素对大鼠成骨细胞增殖、分化和成骨功能的影响

目的 研究橘红素(TG)对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化和成骨功能指标基因蛋白表达的影响。方法 选取出生24 h内的SD大鼠乳鼠颅骨，通过酶消化法培养原代成骨细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和状态，并以碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(ARS)染色法进行细胞鉴定；分别采用噻唑蓝(MTT)法、ALP染色法、ARS染色法检测TG对原代成骨细胞的存活率、评价成骨细胞分化能力和矿化能力的影响；采用Western印迹检测TG对原代成骨细胞成骨相关转录因子(OSX)、ALP、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和骨桥蛋白(OPN)等成骨功能指标基因的蛋白表达。结果 与Control组相比，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时可明显促进成骨细胞的增殖(P<0.01);TG共培养7 d后，与Control组比较，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时ALP染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞分化(P<0.05);TG共培养21 d后，与Control组比较，TG浓度为5、10、15、20μmol/L时ARS染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞的矿化功能(P&...     

阿托伐他汀钙对原代成骨细胞OPG、RANKL、M—CSF基因表达的影响

目的观察不同浓度阿托伐他汀钙对体外培养原代成骨细胞增生和对OPG、RANKL、M—CSF基因表达的影响,探讨阿托伐他汀钙抗骨质疏松的分子机制,为临床用药提供实验依据。方法采用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用差速贴壁法进行纯化。光镜下观察细胞的形态结构和生长状况,通过碱性磷酸酶染色和I型胶原免疫组化SABC法对细胞进行鉴定。用不同浓度的阿托伐他汀钙（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6和10^-5mol／L）干预成骨细胞,在24、48和72h后,用实时荧光定量方法检测OPGmRNA、RANKLmRNA、M—CSFmRNA的表达水平。结果镜下观察显示细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角、多边、长梭等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色呈阳性。实时荧光定量PCR结果显示：不同浓度的阿托伐他汀钙（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5mol／L）均可以促进OPGmRNA的表达,抑制RANKLmRNA的表达,对M—CSFmRNA基因的表达也具有促进作用,且与药物浓度及作用时间有关。结论采用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法体外分离成骨细胞,采用多次“差速贴壁法”可以获得数量多、纯度高且活性好的成骨细胞。阿托伐他汀钙可以促进成骨细胞OPG基因mRNA的表达,抑制RANKL基因mRNA的表达,对M—CSF基因的表达也有一定的促进作用。     

Preptin对人成骨细胞增殖和分化的影响及机制研究

目的 探讨preptin对人成骨细胞增殖和分化的影响及其信号途径.方法 体外培养人成骨细胞,用10-10、10-9、10-8和10-7mol/L preptin干预24 h,以[3H]脱氧胸腺嘧啶苷掺入法分析细胞增殖,用分光光度计法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性判断细胞分化程度.Western印迹法检测细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平.并在preptin干预前以ERK抑制剂(PD98059)、p38 MAPK抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)预处理,观察preptin诱导人成骨细胞增殖和分化的途径.结果 Preptin剂量依赖地增加人成骨细胞的增殖和ALP活性,10-9mol/L浓度时达最大效应(均P<0.01).Preptin刺激人成骨细胞ERK的磷酸化,对p38MAPK和JNK无作用.PD98059阻断preptin刺激的成骨细胞增殖及ALP活性增加(均P<0.05),而SP600125和SB203580无此效应.结论 Preptin通过ERK途径促进人成骨细胞的增殖和分化.     

NO供体亚硝基化合物-18对大鼠成骨细胞的影响

目的 探讨NO供体亚硝基化合物-18(NOC-18)对大鼠成骨细胞增殖和分化、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法 采用酶消化法和骨组织块法联合分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，然后将不同浓度的NOC-18作用于大鼠成骨细胞，采用噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞增殖能力，测定细胞ALP活性。免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，观察NOC-18对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。结果 NOC-18可显著促进大鼠成骨细胞增殖，提高成骨细胞ALP活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论 适量浓度的NOC-18可通过刺激成骨细胞的增殖和分化，促进骨形成，为预防和治疗骨质疏松提供了理论和实验依据。     

高铁环境对成骨细胞生物活性的影响

目的探讨高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)活性指标的影响。方法采用细胞贴壁法培养成骨细胞(hFOB1.19)后,将不同浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基,用MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;Vonkossa染色法行钙结节染色;用RT-PCR和Western blotting分别检测Ⅰ型胶原(COL1)的基因及蛋白表达变化。结果用不同浓度枸橼酸铁铵干预成骨细胞后,与对照组相比,48 h与72 h组成骨细胞增生活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P0.05);48 h组成骨细胞凋亡率呈浓度依赖性升高,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);不同浓度枸橼酸铁铵干预10 d和14 d时各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随枸橼酸铁铵浓度增高而降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,枸橼酸铁铵干预17 d后钙结节染色结果显示,矿化面积和钙结节形成随铁离子浓度增加而减少;枸橼酸铁铵干预3 d后呈剂量依赖性下调Ⅰ型胶原基因和蛋白的表达。结论高铁环境使成骨细胞成骨活性指标均受到抑制。     

Ghrelin regulates proliferation and differentiation of osteoblastic cells

It has previously been reported that growth hormone secretagogues (GHS) may have a role in the regulation of bone metabolism in animals and humans. In this study we evaluated the effect of ghrelin, the endogenous ligand of GHS receptors, on the proliferation rate and on osteoblast activity in primary cultures of rat calvaria osteoblasts. In the same experiments, we compared the effects of ghrelin with those of hexarelin (HEXA) and EP-40737, two synthetic GHS with different characteristics. Both ghrelin and HEXA (10(-11)-10(-8) M) significantly stimulated osteoblast proliferation at low concentrations (10(-10) M). Surprisingly, EP-40737 demonstrated an antiproliferative effect at 10(-9)-10(-8) M, whereas lower concentrations had no effect on cell proliferation. Ghrelin and HEXA significantly increased alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) production. At variance with these peptides, EP-40737 did not significantly stimulate ALP and OC. The mRNA for GHS-R1a receptors and the corresponding protein were detected in calvarial osteoblasts by RT-PCR and Western blot respectively, indicating that ghrelin and GHS may bind and activate this specific receptor. We conclude that endogenous ghrelin and synthetic GHS modulate proliferation and differentiation of rat osteoblasts, probably by acting on their specific receptor.     

牛磺酸通过ERK1/2信号途径促进成骨细胞分化

牛磺酸(taurine)增强成骨样MG63细胞碱性磷酸酶活性,促进骨钙素的分泌和矿化结节的形成.细胞信号转导研究发现牛磺酸诱导成骨细胞细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)磷酸化,ERKl/2抑制剂PD98059可阻断牛磺酸对成骨细胞的促分化作用.提示牛磺酸通过ERKl/2信号转导途径促进成骨样MG63细胞的分化.     

Metformin reverses the deleterious effects of high glucose on osteoblast function

An association has been previously established between uncompensated diabetes mellitus and the loss of bone mineral density and/or quality. In the present study, we examined the effects of different concentrations of glucose (5.5, 11, 22, and 44 mmol/L) with or without metformin (10–640 μmol/L) on rat primary osteoblasts cultured in an osteogenic medium. With 11 mmol/L glucose, cellular proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, the number of nodules formed, and calcium deposition in mineralized nodules were increased significantly; intracellular reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were slightly reduced, although these reductions were not statistically significant. At higher concentrations of glucose (22 and 44 mmol/L), cellular proliferation, ALP activity, the number of nodules formed, and calcium deposition were greatly reduced; ROS and apoptosis were significantly increased in a dose-dependent manner. Metformin markedly increased cellular proliferation, ALP activity, calcium deposition, and the number of nodules formed and inhibited ROS and apoptosis in all glucose groups. Moreover, we assessed the gene expression levels of Runx2, IGF-1, and IGF-1R. Eleven micromole per liter glucose stimulated Runx2 and IGF-1 expression; 44 mmol/L glucose inhibited Runx2, IGF-1, and IGF-1R expression. Metformin stimulated the expression of Runx2 and IGF-1 in three glucose groups, but it did not affect IGF-1R. In conclusion, our findings suggest that the dual effects of glucose on cell proliferation and development are dose dependent. Metformin not only significantly decreased intracellular ROS and apoptosis, but also had a direct osteogenic effect on osteoblasts at all glucose concentrations, which could be partially mediated via promotion of Runx2 and IGF-1 expression.