抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗人肺癌mAb LC—1的人—鼠嵌合Fab片段基因表达质粒的构 …

表达抗人肺癌单克隆抗体ＬＣ－１的人－鼠嵌合基因工程抗体。方法将ｍＡｂ ＬＣ－１的ＶＬ和ＶＨ基因插入质粒ｐＳＷ１中,构建成表达ｍＡｂＬＣ－１人－鼠嵌合Ｆａｂ片段基因的质粒ｐＬＣ－１,转化大肠杆菌ＴＧ－１并在其中表达。结论成功地表达了具有较高亲和活性的人－鼠嵌合抗人肺癌的基因工程抗体。     

抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 ,为其临床应用研究奠定了基础     

抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。     

抗人CD3嵌合抗体基因的构建、表达及表达产物的初步功能研究

目的：构建并表达抗人CD3嵌合抗体，以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法：采用基因工程技术，将抗体VL、VH因分别克隆入嵌合抗体表达载体VL Express及VH Express中。共转染COS-7细胞后，用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达水平；采用Protein A亲和层析法纯化抗体，并进行Western blot鉴定。用FACS检测嵌合抗体结合抗原的活性；混合淋巴细胞培养检测抗体的功能。结果：成功地构建了VH Express-VH及VL Express-VL表达载体并表达纯化。Westem blot的结果显示，表达的抗人CD3抗体为人鼠嵌合抗体。FACS的结果显示．该抗体具有良好的结合抗原活性；混合淋巴细胞培养结果显示．该抗体具有一定的免疫抑制功能。结论：成功地构建、表达了抗人CD3嵌合抗体，为进一步的研究打下了基础。     

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达

目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb)3B4的单链抗体(scFv),并测定其活性。方法:分别以pMD18TmAb3B4VH和pMD18TmAb3B4VL为模板进行PCR,扩增mAb3B4的VH和VL基因,然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中。经DNA序列测定正确后,转化大肠杆菌,用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv;用ELISA检测其与亲本mAb3B4的抗原结合活性的改变。结果:对扩增的mAb3B4的VH和VL基因进行测序,结果表明VH基因与原序列完全一致,VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变。用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达,其与亲本一样具有多反应性,但抗原结合模式不完全相同。结论:成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体,表达的scFv与mAb3B4的抗原结合活性有一定的差异,为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础。     

抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链的真核表达

目的:在Sp2/0细胞中表达抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链.方法:采用RT-PCR技术从稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体(mAb)的小鼠杂交瘤细胞中扩增抗体轻链可变区基因VL, 并构建到人-鼠嵌合轻链表达载体pAG4622.重组质粒pAG4622/VL经DOTAP试剂转染入Sp2/0细胞, 酶酚酸筛选后用ELISA和RT-PCR检测表达产物.结果:在筛选后的转染细胞上清中检测到抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链蛋白, 且其细胞中存在相应嵌合轻链mRNA.结论:嵌合轻链的稳定表达, 为后续抗人L-PGDS人-鼠嵌合抗体的获得奠定基础.     

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的：通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人－鼠嵌合抗体2F7 Fab片段，方法：采用RT－PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆该抗体的重，轻链可变区基因，将2F7单抗的重，轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1-Fab中，构建得到pSW1-2F7 Fab，转化受体菌E.coil XL1-Blue,IPTG诱导表达，经Western blot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果：从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因，测序证实2F7单抗的重链（VH）可变区基因全长362bp，编码120个氨基酸，轻链（VL）可变区基因全长319bp，编码105个氨基酸，构建的2F7人－鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达，主要分泌在菌液的上清中，表达量较高且稳定，具有与NCI－H128细胞特异性结合的活性。结论：构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗2F7人－鼠嵌合Fab片段，表达产物具有与抗原结合的特异性，为进一步研究和应用打下了基础。     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

抗CD4人-鼠嵌合抗体的表达和抗增殖效应

目的：制备抗CD4人－鼠嵌合抗体。方法：从分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，通过RT－PCR扩增出VH和VL的DNA 片优，对VH和VL进行DNA序列测定和分析，证实VH和VL具有小鼠Ig可变区完整的结构功能后，将VH亚克隆至重链表达载体pγ1-Expr,VL亚克隆至轻链表达载体pκ－Expr转化XL2－Blue细菌，通过菌落或质粒PCR筛选阳性克隆，通过电转染将VH－Pγ1，LV－pκ共转染至小鼠骨髓瘤细胞X63Ag8,653，通过G418筛选，ELISA和免疫荧光鉴定。结果：得到分泌抗CD4人－鼠嵌合体的阳性转染瘤细胞克隆。所得到的嵌合抗体在体外对PHA和IL－2诱导的PBMC增殖具有抑制作用。结论：人－鼠嵌合抗体得到成功表达，并有可能作为免疫抑制剂应用于抗移植排斥和自身免疫疾病的治疗。     

抗血小板膜糖蛋白单抗SZ—21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究

目的 为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ－21的免疫原性,克隆了SZ－21可变区基因,构建并表达人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。方法 利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ－21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人－鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达。结果 pSZ－21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性。结论 成功地克隆了SZ－21可变区基因,并表达了可溶性人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。     

人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究

目的：降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性。为其进一步研究，应用奠定基础。方法：用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA，应用RT-PCR技术，扩增出SZ-2重链，轻链可变区基因，克隆入载体pUCm-T，测序分析，应用基因重组技术，将SZ-2轻，重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和к轻链恒区基因进行拼接，构建人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒pSW1-2Fab/Hu，并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达，以ELISA，Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验。对表达产物进行检测，验证。结果：克隆的基因序列符合小鼠轻，重链可变区基因的特征；表达质粒pSW1-2Fab/Hu拼接正确；在大肠杆菌中的表达量约为180μg/L；表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集。结论：成功地克隆了SZ-2可变区基因；并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。     

抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ—21基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的 将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体,为其临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶甸反应,扩增并克隆SZ-21的可变区基因VH、VL,经测序后构建SZ-21单链抗体（SZ-21AScFv),在大肠杆菌中进行表达,ELISA和Western印迹检测其与血小板的结合特性。结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-21ScFv基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的21%,经过变性和复性后,该单抗体保留了与血小板特异结合的能力。结论 成功表达了SZ-21单链抗体。该小分子抗体具有特异结合血小板的能力,有望用于抗血栓治疗。     

High efficiency reconstitution of a human-mouse chimeric Fab of CAb-1 antibody specific to human colon cancer

Monoclonal antibody (mAb) has been widely applied in the treatment of human diseases, especially in malignant tumours. However, most antibodies produced in mouse by hybridoma technology might induce severe human anti-mouse reactions. We had reported a murine mAb CAb-1 of therapeutic interest for its specifically binding to a cell surface glycoprotein of human colon cancer. Here, we attempted to generate a reconstituted human–mouse chimeric Fab (cFab) of CAb-1 in vitro to reduce its antigenicity and increase its capacity of penetration. First, the genes of heavy and light chain variable region (VH, VL) of CAb-1 were cloned. Then, the chimeric light chain (cL) and Fd (cFd) were constructed and expressed in Escherichia coli . Finally, the reconstituted cFab was obtained by gradient dialysis of the mixture of cFd and cL. SDS-PAGE and western blot analysis showed the reconstituted cFab with a recovery rate of 70.2% when the initial total concentration of cL and cFd proteins to be 100  μ g/ml. The reconstituted cFab maintained the affinity and specificity to colon cancer cells compared with its parental antibody as determined by immunostaining analysis, FACS and ELISA. Our results established a foundation for further application of the cFab in diagnosis and treatment of colon cancer.     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

Cloning, expression and characterization of a murine-human chimeric antibody with specificity for pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus

The cloning, expression and characterization of a murine-human chimeric antibody with specificity for the pre-S2 surface antigen (Ag) of hepatitis B virus (HBV) is described. The heavy and light chain variable region (VH and VL) genes encoding the murine monoclonal antibody (mAb) were isolated and combined with human γ 1 and κ constant region genes, respectively. The expression vectors containing the chimeric heavy and light chain genes were sequentially electroporated into murine Sp2/0 hybridoma cells and transfectomas secreting chimeric antibody were isolated. The chimeric antibody was purified and characterized by ELISA, Western analysis and competition immunoassay, demonstrating that the transfectoma functionally express and secrete murine-human chimeric antibody which retained the specificity and affinity of the parental murine mAb.     

抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定

目的 构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体（single-chain Fv)蛋白。方法 设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50A mAb VH和VL基因间引入连结短肽,体外构建50A ScFv基因并进行序列分析;将克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性。结果 序列分析表明,50A ScFv基因全长747bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量（Mr)为29000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16．2％,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性亲和力。结论 成功地构建50A ScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础。     

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。