黄芪多糖通过PI3K/AKT/mTOR促进激素性骨质疏松症大鼠成骨细胞增殖

目的 探讨黄芪多糖在体内外通过PI3K/AKT/mTOR信号通路对糖皮质激素诱导的骨质疏松症（glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP）的保护作用。方法 从分化的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）中培养成骨细胞,分为PBS组、模型组、LY294002组、黄芪多糖组和LY294002+黄芪多糖干预组。通过CCK-8法和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色检测细胞增殖和分化。MDC染色观察自噬体的形成。Western blot检测Beclin-1、p62等信号通路及自噬相关因子的蛋白表达。大鼠分为对照组、模型组、LY294002组、黄芪多糖组和LY294002+黄芪多糖组。比较各组大鼠的骨密度、骨组织形态学参数、组织中通路和自噬相关因子的表达。结果 黄芪多糖促进成骨细胞的增殖和分化能力（P＜0.05）。与模型组相比,黄芪多糖组PI3K/AKT/mTOR通路相关磷酸化蛋白的表达、成骨细胞的增殖分化能力、自噬体及自噬相关因子的表达均升高,但在LY294002组中发现了相反的结果（P＜0.05）。在体内实验中,与模型组相比,GIOP大鼠通过黄芪多糖干预改善了骨密度和骨形态参数,并提高了软骨组织中自噬相关因子的表达,而LY294002干预则表现出相反的结果（P＜0.05）。LY294002部分逆转了黄芪多糖对GIOP中成骨分化和骨形态参数的影响。结论 黄芪多糖通过PI3K/AKT/mTOR通路对GIOP发挥保护作用,可能与诱导自噬和促进成骨细胞增殖有关。     

淫羊藿次苷Ⅰ与其原型药物淫羊藿苷对rBMSCs成骨性分化的影响比较

目的观察淫羊藿次苷Ⅰ(IcarisideⅠ)与其原型药物淫羊藿苷(Icariin,ICA)对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,r BMSCs)成骨分化过程中碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)蛋白表达量及ALP、BGP、Osterix和Runx-2 mRNA表达的影响。方法贴壁筛选法体外培养r BMSCs,以1×10-5mol/L的ICA和IcarisideⅠ对r BMSCs的成骨性分化进行药物干预。ELISA法检测ICA组、IcarisideⅠ组和空白对照组及转化液组之间ALP活性、BGP分泌量;RT Real-Time PCR法检测ALP、BGP、Osterix和Runx-2 mRNA基因表达。结果与空白对照组相比,IcarisideⅠ与其原型药物ICA均可显著增强r BMSCs的ALP活性,促进BGP的分泌,提高ALP、BGP、Osterix和Runx-2的mRNA水平(P0.01)。IcarisideⅠ与ICA组比较,其ALP、BGP蛋白表达量及基因表达明显高于ICA组(P0.01),Osterix和Runx-2的基因表达两组无显著性差异。结论 IcarisideⅠ也能促进r BMSCs成骨性分化,并且其活性高于原型药物ICA,也是淫羊藿发挥抗骨质疏松活性的主要成分。(2)提示补肾中药淫羊藿其补肾壮骨作用与促进ALP、BGP蛋白分泌量,上调ALP、BGP、Osterix和Runx-2的mRNA水平有关。     

PI3K/AKT通路和S1PR2在急性梗阻性胆管炎诱导大鼠全身炎症反应中的作用

目的研究急性梗阻性胆管炎(AOC)大鼠模型中外周血单个核细胞(PBMCs)中磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/AKT通路和鞘氨醇-1-磷酸受体2(S1PR2)的激活情况以及其对大鼠全身炎症反应的影响。方法①体外实验:分离和培养清洁级大鼠PBMCs,然后将其分为磷酸盐缓冲溶液对照组、单独PI3K抑制剂LY294002处理组、脂多糖处理组和脂多糖+LY294002处理组4组,收集各组细胞的上清液和总蛋白,检测细胞上清液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平以及细胞中PI3K、AKT磷酸化水平和S1PR2蛋白的变化。②体内实验:60只清洁级SD大鼠被随机分为假手术组、单独PI3K抑制剂LY294002处理组、AOC模型组及AOC模型+LY294002处理组4组,记录大鼠存活情况,检测大鼠血清中肝功能丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平及血清中TNF-α和IL-6的水平以及大鼠PBMCs中PI3K、AKT磷酸化水平和S1PR2蛋白的变化。结果①体外实验结果:脂多糖+LY294002处理组细胞上清液中TNF-α和IL-6水平均明显低于脂多糖处理组(P0.050),PI3K、AKT磷酸化水平和S1PR2的蛋白水平亦明显低于脂多糖处理组(P0.050)。②体内实验结果:AOC模型+LY294002处理组大鼠的生存率高于AOC模型组,血清中肝功能ALT、AST、TBIL和炎性因子TNF-α和IL-6水平均明显低于AOC模型组(P0.050),PI3K和AKT磷酸化水平及S1PR2蛋白表达水平也明显低于AOC模型组(P0.050)。结论抑制AOC模型大鼠中PBMCs中PI3K/AKT通路的活化,可降低S1PR2的表达,且能抑制AOC诱导的大鼠全身炎症反应。     

高糖通过PI3K-AKT-mTOR信号通路增加足细胞自噬

目的 研究高糖引起足细胞自噬变化及其相关的信号机制.方法 培养的足细胞被分为6组,正常浓度葡萄糖(NG)组、高浓度葡萄糖(HG)组、NG+雷帕霉素(Rap)组、HG+Rap组、NG+LY294002组和HG+LY294002组.观察自噬增强剂Rap和PI3K抑制剂LY294002对高糖条件下培养的足细胞自噬和凋亡的影响.电镜和吖啶橙染色观察细胞内自噬体的形成;Western印迹检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和自噬血管基因Beclin-1的表达;通过阻断自噬的信号通路观察磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)相关蛋白AKT和mTOR的磷酸化水平的改变.结果 高糖可导致足细胞凋亡增加,促进足细胞内自噬体和自噬相关蛋白表达增加(均P＜ 0.05).与高糖组相比,HG+ Rap组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(均P＜0.05);LY294002部分抑制高糖导致的LC3-Ⅱ和Beclin-1表达增加(均P＜0.05).与高糖组相比,HG+ LY294002组足细胞内AKT磷酸化的水平增加(P＜0.05),mTOR的磷酸化水平降低(P＜0.01);HG+ LY294002组足细胞的AKT和mTOR磷酸化水平较高糖组均降低(均P＜0.05).结论 高糖可促进足细胞的自噬和凋亡,推测高糖诱导的足细胞自噬作用部分通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调节实现的.     

中药复方鹿角胶丸通过PI3-K/AKT信号通路调节破骨细胞凋亡

目的探索中药复方鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡机制的实验研究。方法 RAW264.7细胞培养并传代,RANKL+MCSF诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化;MTS检测不同浓度的鹿角胶丸对破骨细胞增殖活性影响;倒置相差显微镜观察鹿角胶丸对破骨细胞形态学的影响;流式细胞仪检测鹿角胶丸及加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后对破骨细胞凋亡的影响;Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3,Cleaved-Caspase-3、p-AKT、T-AKT的蛋白表达情况,以及检测加入LY294002后对凋亡通路蛋白的影响。结果 MTS显示各个浓度的鹿角胶丸(LJJW高、中、低)均能抑制破骨细胞的增殖活性,其中以LJJW(中浓度)作用24 h后具有明显的增殖活性抑制作用。加入鹿角胶丸后,破骨细胞透光度下降,凋亡的细胞皱缩,漂浮于培养基中。流式细胞仪检测结果显示鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡,预处理LY294002后,鹿角胶丸的促破骨细胞凋亡作用受到抑制。免疫印迹结果显示,鹿角胶丸促进线粒体Bax表达,抑制Bcl-2的表达,同时促进Caspase-3的裂解。鹿角胶丸促进AKT磷酸化,加入LY294002后AKT的磷酸化受到抑制,预处理LY294002后鹿角胶丸的促AKT磷酸化作用被抑制。结论中药复方鹿角胶丸通过PI3K/AKT通路促进破骨细胞凋亡。     

载基因仿生基质材料调控骨髓基质干细胞成骨定向分化

目的 探讨载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质于细胞（BMSCs）向成骨细胞定向分化。方法 将非病毒载体K16GRGDSPC共价接枝于新型骨基质材料聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PICA-[ASP-PEG]）构建非病毒基因转染体系。该体系与转化生长因子（TGF）-β1基因复合制备成载基因仿生基质材料pcDNA3-TGF-β1／K16GRGDSPc／PLGA-[ASP-PEG]，并将兔BMSCs与其复合培养，以pcDNA3／K16GRGDSPC／PLGA-[ASP-PEG]作为对照。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1基因的表达；应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP活性，并通过RT-FCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（GPN）和Ⅰ型胶原的表达，通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达，观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XFS图谱证实K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP—PEG]表面。载基因仿生基质材料复合BMSCs培养结果表明，TGF-β1基因被成功地导入细胞内并表达，而且其成骨标志物（ALP、OCN、CPN、Ⅰ型胶原和Cfbal）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 这种载基因基质材料既可以作为骨组织工程支架材料，又可介导外源TGF—β1基因转染BMSCs并定向调控BMSCs成骨分化。     

蛋白激酶B参与门静脉高压症高动力循环的研究

目的 探讨蛋白激酶B （AKT）与肝硬化门静脉高压症（portal hypertension,PHT）高动力循环的关系,特别是AKT与肝门静脉高压症内脏血管收缩反应性降低的关系.方法 将SD大鼠随机分为4组：正常对照组（N组,n=7）、四氯化碳诱导的肝硬化门静脉高压组（PHT组,n=7）,经AKT特异性阻滞剂LY294002处理的门静脉高压组（LY组,n=7）和注射二甲基亚枫（DMOS）的门静脉高压组（DMOS组,n=7）,分别测量门静脉压力（portal vein pressure,PP）,离体肠系膜分支动脉对缩血管物质去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）的反应性,应用LY294002对离体微动脉收缩反应性的影响以及肠系膜动脉内皮细胞内AKT、内皮一氧化氮合酶（eNOS）的蛋白表达变化.结果 ①与N组相比,PHT组PP明显增高（P＜0.01）,应用LY294002后,PP无明显降低（P＞0.05）;②PHT组肠系膜微动脉对NE的反应性较N组明显降低（P＜0.01）,LY294002可改善这种低反应性（P＜ 0.01）;③AKT在PHT肠系膜动脉内皮中的表达明显上调（P＜0.05）,eNOS的表达PHT组和N组无明显差别（P＞ 0.05）,但p-eNOS的表达在PHT组动脉内皮中明显增高（P＜ 0.05）.结论 肝硬化门静脉高压症的内脏动脉中,AKT的表达上调,通过促进eNOS的活化和降低血管收缩反应性,参与内脏高动力循环的形成.     

生长板软骨细胞促进骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)在生长板软骨细胞旁分泌作用下血管内皮生长因子(VEGF)的表达规律及其与成骨分化的相关性。方法大鼠BMSCs与生长板软骨细胞进行间接共培养,培养终末期做细胞化学染色,定量测定碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR方法半定量检测VEGFmRNA的表达。结果生长板软骨细胞持续高表达VEGF。BMSCs随共培养时间的延长,ALP活性升高,BMSCs的VEGF的表达也逐渐增强。培养液加入两种分泌型VEGF中和抗体后,VEGF表达趋势不变,ALP活性仍为升高趋势,也不影响培养终末期钙化结节的形成。培养终末期BMSCs的CD31和CD34均阴性。结论BMSCs成骨分化过程中VEGF的表达符合成骨细胞分化基因的表达规律,与成骨细胞特征性基因的表达趋势一致,体外条件共培养条件下,中和VEGF后并不能阻碍BMSCs的成骨分化。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

积雪草苷通过TGF-β/Smads通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 探讨积雪草苷对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的诱导作用以及潜在机制。方法 使用6个浓度的积雪草苷（0、5、10、20、30、40 μmoL/L）作用BMSCs,利用CCK-8与检测细胞增殖率与细胞凋亡率,筛选出积雪草苷对BMSCs最大无毒浓度。将BMSCs分成3组,空白对照组、积雪草苷组与抑制组,空白对照组正常培养,积雪草苷组使用积雪草苷对BMSCs进行诱导成骨分化,抑制组在此基础上加用SB-431542（50 moL/L）处理。诱导12 d后,茜素红染色观察细胞中矿化结节的数量,RT-qPCR检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）基因表达水平,Western blot检测细胞中转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平。结果 20 μmoL/L的积雪草苷对BMSCs无明显抑制效果。与空白对照组相比,积雪草苷促进BMSCs钙化结节形成增多,ALP、OPN和OCN基因表达水平升高,TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平升高（均P＜0.05）;积雪草苷在TGF-β/Smads通路被抑制的情况下仍然能发挥诱导BMSCs成骨分化作用。结论 积雪草苷具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的潜力,可能涉及的机制为激活细胞中TGF-β/Smads通路,上调OPN、ALP与OCN基因表达量,帮助骨髓间充质干细胞完成成骨分化。     

富血小板血浆与地塞米松对人骨髓基质干细胞成骨分化作用的对比研究

目的 通过系统评价富血小板血浆(PRP)与地塞米松(DEX)对人骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,为PRP临床骨组织修复应用提供更为可靠的实验依据.方法 将体外培养的BMSCs分为单纯血清培养组(FCS组)、PRP诱导组和DEX组,通过相差显微镜观察碱性磷酸酶(ALP)染色、钙盐沉积染色,RT-PCR法检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原(Coll-Ⅰ)、骨连接蛋白(ON)、中心结合因子(Cbfα1)mRNA表达系统评价PRP的成骨分化能力. 结果 PRP抑制了BMSCs向三角形、多角形细胞转变,DEX则诱导BMSCs向三角形、多角形细胞转变;PRP抑制了ALP分泌,钙盐沉积;DEX增加了ALP分泌,促进钙化结节形成.与FCS组相比,DEX促进了ALP、OCmRNA表达,PRP抑制了ALP、OC mRNA表达;PRP、DEX对Coll-Ⅰ、ON、Cbfα1 mRNA表达均无影响.结论 在本实验条件下,PRP对人BMSCs体外成骨分化的直接作用是抑制效应;在体外PRP并不能代替DEX作为人BMSCs成骨分化的诱导因子.     

补肾固本方对大鼠骨质疏松模型中PI3K/AKT/mTOR信号通路表达的调控研究

目的观察补肾固本方对去卵巢骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响,探讨补肾固本方干预OP的作用机制。方法将100只SD大鼠随机分为5组:正常组(C组)、模型组(M组)、补肾固本方组(B组)、补肾固本方+PI3k受体特异性阻断剂LY294002组(B+L组)、PI3k受体特异性阻断剂LY294002组(L组),除正常组外,其余4组建立去卵巢大鼠OP模型。药物连续干预12周后,采用ELISA方法检测血清中E2、BGP、ALP水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组股骨组织中LC3、Beclin1、caspase-9 mRNA的表达情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组股骨组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达。结果补肾固本方可显著增高OP大鼠血清E2水平,降低BGP、ALP水平,显著上调LC3、Beclin1表达水平,降低caspase-9、PI3K、p-AKT、mTOR的表达;而上述变化能够被PI3k受体特异性阻断剂LY294002所阻断,且其差异具有统计学意义(P0.05)。结论补肾固本方减少去卵巢后大鼠OP的发生,其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路及其下游基因蛋白表达有关。     

血小板源生长因子通过PI3K/AKT途径促肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成

目的研究磷脂酰肌醇3激酶（P13K）特异性的抑制剂LY294002对血小板源生长因子（PDGF）诱导的肝星状细胞增殖与I型胶原合成的影响，并初步探讨P13K信号通路在PDGF诱导肝星状细胞活化中的机制。方法HSC细胞用LY294002和PDGF—BB共同孵育处理。收集细胞和培养液上清。细胞增殖用噻唑蓝（MTr）法检测，I型胶原蛋白用ELISA法检测，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测I型胶原mRNA的表达。利用P13K通路下游效应物AKT作为活化指标，ELISA法检测AKT和磷酸化AKT蛋白的表达。结果PDGF—BB能激活P13K通路，并导致AKT磷酸化。LY294002抑制P13K信号通路后，PDGF—BB刺激的HSC—T6增殖与促I型胶原合成作用被抑制。结论PDGF促HSC增殖和I型胶原合成是通过P13K信号通路，其作用可以被P13K抑制剂LY294002抑制。     

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功能的促进作用

目的观察辛伐他汀对体外培养的人骨髓基质干细胞(humanBoneMarrowStromalcells,hMSCs)成骨分化功能的影响,探讨其刺激成骨的作用机制。方法体外培养来自于股骨颈骨折患者的骨髓基质干细胞,传代后实验组加入1×10-7molL的辛伐他汀,于不同时间点采用Westernblot检测核转录因子1(CoreBindingFactor1,Cbfa1)的表达,碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP)试剂盒检测ALP的比活性,及放射免疫法检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)含量。结果辛伐他汀作用后,实验组与对照组比较,实验组Cbfa1蛋白表达水平增高,ALP比活性增高且骨钙素含量增加。结论1×10-7molL辛伐他汀能够促进人骨髓基质细胞成骨分化,此种促进作用可能与辛伐他汀增强其分化过程中相关蛋白的表达有关。     

脂联素通过调节BMP信号通路促进骨髓干细胞成骨分化

目的 研究脂联素（adiponectin, ApN）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养BMSCs,构建ApN过表达质粒及干扰质粒,转染至BMSCs中。将BMSCs随机分为5组：对照组、过表达组、过表达空载组、干扰组和干扰空载组。茜素红染色观察各组细胞钙化沉积。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色观察各组细胞成骨分化能力。qRT-PCR检测ApN受体、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路及成骨相关基因表达情况。结果 与对照组相比,过表达组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达增多,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著升高（P<0.05）;干扰组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达减少,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著降低（P<0.05）。结论 ApN可能通过上调BMP信号通路促进BMSCs成骨分化。     

Y-27632 对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨Rho A/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞。将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组。分别于细胞培养后1d、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7 d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达。结果流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs。与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Y-27632阻断Rho A/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化。     

淫羊藿苷与雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 观察淫羊藿苷（icariin，ICA）与雌激素（estrogen，E2）对SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨分化及对内环境雌激素水平的影响。方法 取3、4代BMSCs细胞，分为正常组、E2组、ICA组和E2+ICA组，在37 ℃ CO2培养箱内诱导18 d；运用MTT法检测培养24、48、72 h后各组细胞增殖；通过ELISA检测法检测E2及6、12、18 d时的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性；运用茜素红染色法观察各组成骨分化情况；运用免疫荧光法观察雌激素受体α（estrogen receptor-α，ERα）的表达与分布。结果 根据MMT结果，正常组、E2组、ICA组和E2+ICA组均可促进BMSCs增殖（P＜0.01）；与正常组相比，各给药组ALP活性升高（P＜0.01）。相同时间点各给药组ALP活性从小到大依次为ICA组＜E2组＜E2+ICA组，12 d时各组浓度达到峰值；同期观测12 d时茜素红染色及免疫荧光染色结果（P＜0.05），与ALP结果趋势一致；各给药组E2活性明显升高（P＜0.01），从小到大依次为ICA组＜E2+ICA组＜E2组，与ALP结果趋势不一致。结论 ①E2+ICA组明显优于单独给药组。与E2相比ICA反应更快、毒性更小；②ICA可双向调节内环境雌激素的含量，使其趋于稳态，以规避雌激素替代疗法（estrogen replacement therapy ，ERT）副作用；③ICA能够通过调节雌激素水平，提高ERα核内表达，增加ALP含量，可用于治疗以雌激素缺乏为主的绝经后骨质疏松症，亦可为绝经后雌激素分泌异常导致的其他慢性病提供新思路。     

甲状旁腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化中LPL和ALP的影响

目的 利用大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)建造体外实验模型，探讨间歇应用甲状旁腺激素1 -34( parathyroid hormone 1 -34,PTH 1-34)对BMSCs成脂分化中脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase, LPL)和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP)的影响。方法 (1)全骨髓贴壁培养法分离出BMSCs，体外培养与鉴定；（2)以P3代BMSCs为体外实验模型，分为两组：单纯诱导液组和PTH组。单纯诱导液组：BMSCs + DMEM培养基+诱导液；PTH组：BMSCs + DMEM 培养基+诱导液+PTH 1-34;(3)采用间歇方式将不同浓度的PTH 1-34加人PTH组的BMSCs培养基，14天后采用ELISA法测定LPL活性，采用RT-PCR法测定ALP的活性。结果（1 ) P3代细胞表达抗原CD29、CD44,不表达抗原CD45，基本符合BMSCs表面标志物特征；（2)成脂诱导液诱导BMSCs分化21天后，油红O染色可见胞内脂滴出现，符合脂肪细胞的特性；（3)间歇应用不同浓度的PTH作用于BMSCs后，与对照组比较，LPL的表达量下降，ALP活性增加，并呈剂量依赖性。结论 小剂量间歇应用PTH 1-34可使BMSCs的成脂分化中LPL表达量降低，ALP表达量增加，证明小剂量PTH 1-34可抑制BMSCs成脂分化，促进其成骨分化。     

微管仿生人工骨对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

[目的]研究不同微管结构仿生人T骨对犬骨髓基质细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。[方法]仿生人工骨分为正交结构（A组）和同心结构（B组），以磷酸钙骨水泥（CPC）／重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）（C组）、单纯CPC（D组）为对照组：梯度密度离心法获取犬骨髓单个核细胞，取第3代与人工骨复合培养。通过荧光显微镜、扫描电镜观察细胞在人工骨表面附壁和生长情况；以MTT实验检测各组细胞增殖能力；测定碱性磷酸酶（ALP）检测BMSCs的成骨活性：[结果]细胞在各组人工骨表面黏附、生长，以A、B组数量较多；MTT法检测显示A、B、C组吸光度（A）值大于D组（P〈0．05）、A、B、C组A值相似（P〉0．05）；ALP测定显示ALP活性A、B组〉C组〉D组（P〈0．05），A、B组间差异无统计学意义（P〉0．05）。[结论]微管结构仿生人工骨与犬BMSCs有良好的生物相容性，是BMP的良好缓释载体，可以促进犬骨髓基质细胞向成骨方向分化.     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。