动脉再生机制研究:骨髓间充质干细胞诱导分化内皮样细胞的体外实验

目的:探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮样细胞定向分化条件。方法:无菌条件下采集兔骨髓,肝素抗凝,经淋巴细胞分层液(相对密度为1.077)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,通过贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞(bonemarrow-mesenchymalstemcell,MSC),然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化,观察细胞的体外生长特点及其生化特性。结果:MSC每扩增一代,细胞数量增加5～8倍,7.65×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.26×108个细胞。特定条件下贴壁细胞延展呈梭形,形成细胞簇、索状结构及“铺路石”样结构,扩增细胞免疫组化证实表达CD31和VIII因子相关抗原(factorVIIIrelatedantigenvonWille-brandfactor,vWF),具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白的功能。结论:MSC扩增能力强,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力

目的：研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchvmal stem celis，MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力，为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法：实验于2003—10／2004—10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓，用直接贴壁法获得小鼠MSCs，然后以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth faclor，vEGF)进行诱导分化，最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrand factor，vWF)免疫荧光鉴定观察。结果：MSCs每扩增一代，细胞数量增加4～8倍，7．0&;#215;10^3个原代MSCs体外扩增3代即获得1．4&;#215;10^8个细胞。在70％～80％融合时呈现“铺路石”样形态，说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后，以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现，诱导组的vWF呈阳性表达，对照组vWF表达呈阴性。结论：绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强，在vEGF作用下可以向内皮细胞转化。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中端粒酶活性表达及意义

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞覆其扩增过程中端粒酶活性的表达及其意义。方法：联合应用密度梯度离心和贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞，继而诱导其向内皮细胞方向分化并传代培养。用TRAPezeELISA法和TRAP银染法分别检测骨髓问充质干细胞体外诱导分化前后端粒酶活性。结果：兔骨髓问充质干细胞体外培养时具有快速增殖能力，在特定环境中诱导分化细胞具有内皮细胞特征；增殖前的骨髓阃充质干细胞端粒酶活性低水平表达，一旦经过诱导分化其端粒酶活性表达上调，在5代内其端粒酶活性不因细胞传代而下降或消失。结论：骨髓间充质干细胞在体外有限扩增和诱导分化时保持端粒酶活性，维持组织干细胞特性，为内皮祖细胞的临床研究奠定理论基础。     

骨形成蛋白4诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力

目的：骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein4，BMP4)体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。方法：采用BMP4体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果：成年大鼠骨髓间充质干细胞受BMP4诱导后出现神经元样细胞，细胞免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NF表达阳性，诱导后5h，12h，1d，3d，5d和7d的NF神经样细胞阳性率分别为(40&;#177;7)％，(71&;#177;6)％，(58&;#177;3)％，(53&;#177;6)％，(37&;#177;5)％，(13&;#177;2)％，诱导后12h，NF神经元样细胞阳性表达到高峰，与诱导后5h比较，差别有显著性(t=1．380～2．621，P&;lt;0．05)。结论：BMP4可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。     

传代培养密度对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

背景：组织工程技术的快速发展为骨缺损完全再生修复带来了新的希望，种子细胞的快速扩增是其中的关键问题之一。 目的：观察人间充质干细胞传代培养时，细胞种植密度对间充质干细胞增殖及成骨诱导分化影响。 设计：重复测量设计。 单位：解放军第三军医大学细胞培养室和检测分析室。 对象：实验于2003-01／2004-03在解放军第三军医大学的创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室完成。从5例男性健康志愿者髂骨骨髓中分离扩增的干细胞。 方法：将第2代间充质干细胞以8&;#215;10^3／cm^2，3&;#215;10^3／cm^2，8&;#215;10^2／cm^2密度接种。分析其生长曲线，并扩增培养18d，记录细胞扩增数量，再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力。 主要观察指标：①不同种植密度下细胞生长曲线。②碱性磷酸酶染色和骨钙素的免疫组化染色结果。 结果：人骨髓间充质干细胞阴性表达碱性磷酸酶、CD34；在8&;#215;10^3／cm^2种植密度下，细胞倍增时间40h，18d后细胞数量扩增（51&;#177;13）倍；在3&;#215;10^3／cm^2种植密度下，细胞扩增（28&;#177;6）倍；在8&;#215;10^2／cm^2种植密度下，细胞总数仅增加（5&;#177;3）倍。在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组，两组细胞均具有成骨诱导能力。 结论：种植密度对间充质干细胞增殖有明显影响，快速扩增间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞，宜选择8&;#215;10^3／cm^2种植密度。     

本期专题：间充质干细胞向肝样细胞的诱导与分化（本刊中文部）

1 体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化：肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用 2 三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化 3 多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞的分化     

间充质干细胞分化的内皮细胞有免疫调控作用

为了探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）诱导而来的内皮细胞的免疫调控能力，将人骨髓MSC在体外经VEGF诱导分化为内皮细胞，并用倒置相差显微镜和流式细胞术分别观察和检测细胞的形态和免疫表型，用淋巴细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明：MSC在向内皮细胞分化的体系中生长迅速，诱导后的细胞经von Willebrand factor（vWF）免疫荧光染色呈阳性，能在Matrigel上形成毛细血管样网状结构。细胞表面标记无明显改变，即CD73、CD105、HLA—ABC仍阳性，CD34、CD80、CD86、HLA—DR、CD31仍为阴性。由MSC诱导分化而来的内皮细胞能抑制T淋巴细胞的增殖，其抑制作用随内皮细胞加入量的增多而增强。结论：由骨髓MSC来源的内皮细胞对T淋巴细胞具有调控作用。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景：间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的：观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法：骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论：通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高（P 〈 0.05）。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的：观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论：人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-Ⅰ是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 设计：开放性实验。 单位：中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。 材料：实验于2003-03／11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。 方法：采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞，体外扩增，用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44，CD71，CD34, CD45表达；在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg／L胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液，采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。 主要观察指标：通过检测细胞CD34，CD44，CD45的表达，进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。 结果：①倒置显微镜观察结果：体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45，说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点：③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化：加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-Ⅰ共培养，在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆，15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形．突起短，呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72．5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内，呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液共培养组培养15d后，细胞内蛋白多糖含量为[8．92&;#177;0．91）μg／L，高于单纯骨髓间充质干细胞培养组Ⅰ（2．56&;#177;0．26）μg／L，P〈0．05]，但低于软骨细胞组[（13．69&;#177;1．51）μg／L，P〈0．05]。 结论：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌样细胞及其低免疫源性实验

目的：通过体外诱导骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化，验证其多能分化特性，检测分化后的细胞进行免疫源性。方法：①实验于2003-03／2004-09在华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科实验室完成。实验选用1月龄Wistar大鼠20只。②贴壁法体外培养骨髓间质干细胞，用化学物质5-氮杂胞苷诱导24h.免疫组化检测诱导后的细胞心肌特异性蛋白的表达，单向混合淋巴细胞反应检测诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫源性。③实验分组如下，对照组1：单独的反应细胞组；对照组2：刺激细胞＋反应细胞。实验组1：不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1&;#215;10^7，1&;#215;10^8，1&;#215;10^9L^-1＋反应细胞；实验组2：不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1&;#215;10^7，1&;#215;10^8，1&;#215;10^9L^-1＋刺激细胞＋反应细胞。以抑制率表示诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫调控活性。④多均数比较采用方差分析，进行方差齐检验后，均数间两两比较采用LSD法。两样本均数比较采用t检验。结果：20只大鼠均进入结果分析。①部分诱导后的细胞胞浆结蛋白，心肌特异性肌钙蛋白，连接蛋白—43免疫组化呈阳性反应。②实验组1（加入的骨髓间质干细胞为1&;#215;10^7，1&;#215;10^8，1&;#215;10^9L^-1时）同种异体淋巴细胞的每分钟脉冲值明显低于对照组1（4610．106&;#177;276．16，3704．55&;#177;159．50,2881．317&;#177;114．62，8232．333&;#177;351．71，P〈0．05），各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显（P〈0．05）。③实验组2（加入的骨髓间质干细胞为1&;#215;10^7,1&;#215;10^8，1&;#215;10^9L^-1时）对混合淋巴细胞反应的抑制率明显高于对照组1（43．9％，55．1％，65．7％，1．65％，P〈0．05），各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显（P〈0．05）。结论2骨髓间质干细胞具有向心肌样细胞分化的潜能，分化后的骨髓间质干细胞能呈剂量依赖性地抑制同种异体淋巴细胞增殖，可以抑制正在进行的混合淋巴细胞反应，具有低免疫源性，可用于同种异体移植。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景:间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的:观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法:骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论:通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高(P < 0.05)。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨分化对血管内皮细胞形成的可能影响

背景：种子细胞的成骨功能及局部血管形成是骨组织工程修复重要影响因素。目的：体外研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)诱导培养分化为成骨细胞的功能表现及血管内皮生长因子(vascular endothelia gmwth factor，VEGF)的表达。探讨MSCs向成骨分化及对血管内皮细胞形成的可能影响。设计：以细胞为研究对象，单一样本研究，重复观察测量。单位：一所大学组织胚胎学教研室。材料：本实验于2002-03／12在广东医学院组织胚胎学教研室完成。对象为兔骨髓间充质干细胞。方法：分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞，用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液诱导MSCs向成骨细胞分化，观察诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节形成以及VEGF的表达。主要观察指标：①细胞形态学观察。②培养细胞的成骨分化鉴定。③诱导培养的成骨细胞VEGF表达。结果：MSCs诱导培养后，细胞ALP呈强阳性染色，形成矿化结节，且VEGF表达增强，其灰度值为132．3&;#177;4．6，与MSCs的VEGF表达灰度值(148．5&;#177;5．3)比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：兔MSCs经诱导可分化为成骨细胞，且VEGF表达增强，可能参与内皮细胞的形成。     

黄体酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞实验研究

目的：体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，黄体酮定向诱导。MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄体酮诱导3h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景:心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建.目的:建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定.方法:全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测.结果与结论:骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点.提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞.     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的：探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化，为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法：实验于2005-05／06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者，应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质于细胞，应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化，采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中自蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达，通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果：①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80％～90％汇合，其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后，诱导组中出现圆形细胞，呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时，表达少量白蛋白核糖核酸，于诱导3周时可见白蛋白．核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中自蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论：肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的:观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法:体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论:人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

目的：观察三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经兀的能力。方法：实验于2004-10／2005—02在广州中医药大学神经解剖学实验室完成。选择40只SD大鼠，随机分为对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、龟板组与三甲复脉汤组，每组10只。龟板组与三甲复脉汤组每天给予龟板与三甲复脉汤口服液4mL灌胃1周，对照组及碱性成纤维细胞生长因子组则给予等体积蒸馏水灌胃1周。采用含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，龟板组与三甲复脉汤组用含10μg／L碱性成纤维细胞生长因子的L—DME 2μL预处理24h后，再分别加入龟板、三甲复脉汤含药血清诱导。每次诱导时设有对照血清组与碱性成纤维细胞生长因子组（加入10μg／L碱性成纤维细胞生长因子2μL）。诱导后5h，12h，1d，3d，7d在倒置显微镜下观察细胞形态，免疫组化鉴定神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达。结果：在实验过程中共有2只动物死亡，进行了相应的补充，进入结果分析为40只，保持为4组，每组10只。①骨髓间充质干细胞受诱导向神经元分化的形态特征：骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、龟板与三甲复脉汤血清诱导5h后，部分细胞形态发生明显改变，胞体变小，胞质向核周收缩，由原来的梭形变成圆形，形成网络样结构。随着诱导时间延长，骨髓间质干细胞呈渐近性的向神经元样细胞转化，神经样细胞增多。对照组未见有神经元样细胞出现。②骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经分化鉴定：神经元样细胞的胞体和突起神经丝蛋白染呈棕色，神经丝蛋白阳性细胞胶质纤维酸性蛋白染色为阴性。③骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经元样细胞数：诱导后12h，神经元样细胞阳性率达到高峰，碱性的成纤维细胞生长因子组、龟板组、三甲复脉汤组细胞的神经元样细胞数均高于对照组[（74&;#177;6），（75&;#177;6），（71&;#177;5），（6&;#177;1）个1；至第7天仍有神经元样细胞存活，其中以三甲复脉汤存活时间最长，高于碱性成纤维细胞生长因子组和龟板组[（21&;#177;3），（12&;#177;3），（15&;#177;2）个]。结论：三甲复脉汤含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元，而且能延长其表达。