脱细胞支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程血管

背景:目前临床使用的小口径(<6 mm)人工血管因生物相容性差、远期通畅率低,效果并不理想.因此,学术界一直致力于寻找具有正常血管生物学功能的血管代用品,组织工程血管的构建与功能研究已成为目前热门研究课题.目的:将兔骨髓间充质干细胞与脱细-胞血管支架动态复合培养体外构建组织工程血管,通过体内移植实验,探讨该组织工程血管的组织相容性及通畅率.设计、时间及地点:随机对照实验,细胞学、组织病理学观察,于2006-01/2008-06在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成.材料:通过去污剂-酶消化法制备兔腹主动脉脱细胞支架;采用密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,分离扩增兔骨髓间充质干细胞,将扩增后的干细胞静态种植于脱细胞支架后置于生物反应器中动态培养构建组织工程血管.方法:60只兔随机均分为3组,剪取一段腹主动脉长约1.0 cm,再将移植血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上.组织工程血管组:受体为对应抽取骨髓干细胞的实验兔,以组织工程血管为移植血管;脱细胞血管支架组:以脱细胞处理的同种异体腹主动脉为移植血管;同种异体血管组:以同种异体新鲜腹主动脉作为移植血管.主要观察指标:对培养的骨髓间充质干细胞进行免疫组化鉴定;血管移植后3个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果.结果:兔骨髓间充质干细胞在体外培养8 d后形成漩涡状排列,免疫组化结果符合间充质干细胞表型特征:将间充质干细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养12 d后,种子细胞在血管腔内黏附生长;血管移植3个月后,组织工程血管组、脱细胞血管支架组通畅率分别为90%,80%,均优于同种异体血管组(25%).移植3个月后苏木精一伊红染色及扫描电镜结果显示,组织工程血管组形成清晰的内、中、外膜3层结构,形态接近正常动脉,内皮细胞覆盖完整;脱细胞血管支架组血管内表面内皮细胞覆盖不完整,伴有附擘血栓形成,内膜轻度增生,伴炎性细胞浸润:同种异体血管组内膜极度增厚、坏死,管腔明显狭窄,伴不同程度的血栓机化.结论:将兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架上,可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管.     

低温去合金化镍钛形状记忆合金的血液相容性

背景:国内外研究表明镍钛形状记忆合金在体内长期置入可释放镍离子,为了降低镍离子在体内的溶出,研究者进行了很多试验,低温去合金化是一种新的表面处理技术.目的:测定低温去合金化处理后的镍钛形状记忆合金血液相容性指标,评价其血液相容性.设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-12/2008-06在兰州大学第二医院骨科研究所实验室完成.材料:低温去合金化镍钛形状记忆合金和未处理镍钛形状记忆合金由贵州科学院苏向东老师惠赠.方法:通过模拟体内血液环境,以未处理的镍钛形状记忆合金为对照,对低温去合金化处理后的镍钛形状记忆合金与新鲜兔血接触进行溶血率实验、动态凝血时间实验、血小板黏附实验、接触角测定实验.主要观察指标:溶血率,动态凝血时间,血小板黏附数量,接触角.结果:低温去合金化处理后的镍钛形状记忆合金溶血率低,血小板黏附减少,动态凝血时间延长,接触角变小.结论:低温去合金化处理后的镍钛形状记忆合金的血液相容性得到了显著改善.     

低温等离子体肝素化改性后小肠黏膜下层的血液相容性及其构建小口径血管的可行性

背景:栓塞是小口径血管植入后失败的主要原因,目前常常对血管支架材料进行抗凝改性,以期提高其血液相容性,从而提高血管的有效通畅性.目的:观察低温等离子体肝素化改性后的内植物修复材料小肠黏膜下层的血液相容性,并探讨其体内构建小口径血管的可行性.设计:单一样本实验.单位:上海交通大学附属第六人民医院骨科、上海市四肢显微外科研究所.材料:实验于2006-01/10在上海市四肢显微外科研究所实验室进行.小肠黏膜下层来自农场猪.方法:①改性:将猪小肠黏膜下层用氩等离子体处理器照射处理,氩气流量20mL/min,照射时间分别为0,2,4,6,8,10,12,14 s,接着浸入肝素钠溶液24 h.②体内抗凝血实验:将20条狗分为2组,分别植入经过改性或未改性的小肠黏膜下层缝合成的3 mm口径血管支架,与股动脉直接吻合,观察6周.主要观察指标:①血液相容性检测:通过扫描电镜观测表面形态,并通过液滴接触角、凝血时间及血小板黏附实验检测小肠黏膜下层改性前后的抗凝性.②体内抗凝血:通过彩色多普勒和组织学检测,评价血管支架直接在体内循环血流下的长期通畅性和形成血管的可行性.结果:①改性小肠黏膜下层膜表面呈现出均匀的微结构改变,随着等离子体照射时间增加,表面液滴接触角降低;改性后凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间延长:血小板黏附减少.②植入体内后未改性小肠黏膜下层血管支架3 d内栓塞,改性组在6周内仍保持通畅,管腔内表面有完整内皮细胞覆盖.结论:经低温等离子体肝素化改性后小肠黏膜下层的亲水性、抗凝性有明显提高.     

海绵状Ⅰ型胶原蛋白与免脂肪干细胞的生物相容性

背景:脂肪组织工程研究中,寻找一种优良的生物支架材料作为脂肪干细胞的载体极为重要.目的:评价兔脂肪干细胞与海绵状Ⅰ型胶原蛋白的生物相容性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2007-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成.材料:三四月龄雌性新西兰大白兔8只,由南方医科大学实验动物中心提供.海绵状Ⅰ型胶原蛋白为广州创尔公司产品.方法:兔麻醉后取颈部皮下脂肪,体外分离培养脂肪干细胞,选取生长良好的第3代细胞,调整密度为1×109L-1细胞悬液.将无菌的Ⅰ型胶原蛋白海绵裁成10mm×10mm×5mm放入96孔板内,培养液平衡后,每孔支架材料表面接种0.1 mL细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:脂肪干细胞的形态及表面标志表达,细胞在支架材料上的黏附、增殖情况,光镜及电镜下观察细胞-支架复合物.结果:原代培养的脂肪干细胞形态主要呈宽大扁平短梭形,传代后细胞形态以长梭形为主,第3代脂肪干细胞CD29,CD44免疫荧光染色均呈阳性.细胞与支架混合培养后平均黏附率为92.38%,并保持正常的生长增殖速度.光镜下随培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多,极少从支架材料上掉落,Dil荧光染色后可见细胞膜发出红色荧光.电镜下部分细胞呈团簇状生长,聚集性分布,黏附于胶原海绵表面或孔隙内,细胞周围有大量的基质.结论;海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,能够为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间,可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料.     

以肝素固化脱细胞支架构建的小口径抗凝人工血管

背景：目前临床上直径〈6mm的小口径人工血管因生物相容性差、远期通畅率低，使用效果并不理想。目的：通过对脱细胞血管支架表面固化肝素，制备一种具有抗凝血功能的小口径生物人工血管。设计、时间及地点：细胞学、组织病理学体外观察，于2005—12／2007—12在鼓楼医院实验室完成。材料：普通成年杂种犬8只，雌雄不限，体质量约20kg。方法：采用去污剂-酶消化法制备犬颈动脉脱细胞支架，并将肝素分子交联至支架表面。将制备的肝素固化血管和脱细胞血管基质植入犬颈动脉进行异体血管移植实验。主要观察指标：通过血小板黏附实验和细胞接触实验评价其血液、生物相容性能：经异体血管移植实验观察其早期血栓形成情况。结果：脱细胞支架细胞成分去除完全，而胞外基质保留完整：经肝素固化后具有良好的抗凝血性能，细胞接触实验未显示细胞毒性；植入异体犬颈动脉1个月后，发现肝素固化组移植血管均维持通畅，而植入单纯脱细胞血管基质者因血栓形成而闭塞。结论：对同种异体脱细胞血管支架进行表面肝素固化，可获得一种具有良好生物相容性和血液相容性的小口径人工血管。     

新型纳米纤维支架的细胞生物相容性

背景:高孔隙率聚己内酯纳米纤维支架具有适合血管平滑肌细胞黏附、增殖的多级孔径结构,具有良好的细胞生物相容性.目的:探讨高孔隙率聚己内酯静电纺丝纳米纤维支架的细胞相容性.方法:根据支架的制作工艺不同分为传统支架组、新型纳米纤维支架组两组,另设单纯细胞组为对照组.采用组织块贴壁法体外原代培养兔主动脉平滑肌细胞并进行传代,用3～6代细胞作为实验用种子细胞.应用WST-1法测定平滑肌细胞黏附率、增殖力,光镜及扫描电镜观察细胞形态,评估支架的细胞生物相容性.结果与结论:高孔隙率聚己内酯纳米纤维支架对细胞形态无明显影响,新型支架上的种子细胞黏附、增殖及代谢活性情况较传统支架好.提示,高孔隙率聚己内酯静电纺丝纳米纤维支架具有较高的细胞相容性.     

组织工程心脏瓣膜支架材料的血液相容性

目的:评价去细胞猪主动脉瓣、胶原-透明质酸钠复合膜、胶原膜、胶原-壳聚糖复合膜的血液相容性,展望其在组织工程心脏瓣膜支架材料中的应用前景。方法:进行体外的动态凝血试验、血小板黏附性能试验、溶血试验和体内的犬腹主动脉内移植试验的血液相容性评价。结果:4种材料的溶血率均小于5%;前3者的OD-凝血时间曲线下降缓慢且吸光度高,同时血小板黏附少且没有明显变形和伪足。腹主动脉包埋试验大体解剖只有胶原-壳聚糖复合膜形成血栓。结论:前3种材料在血液相容性方面适合组织工程心脏瓣膜的要求;胶原-壳聚糖复合膜需要改进。     

兔肋软骨脱细胞基质的制备

背景:研究表明新西兰兔软骨组织可作为组织工程支架材料,中关节软骨及耳软骨的脱细胞基质的研究较多,采用肋软骨作为组织工程软骨支架的研究较少.目的:制备新西兰兔肋软骨脱细胞基质,讨天然软骨支架作为组织工程支架的可行性.方法:用联合去垢剂-酶法获得软骨支架,据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0,4,8,6 h分为4组.脱细胞完毕后各组支架固定行扫描电镜采集图像观察计算支架孔隙率、孔径长度,对支架进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,将脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下观察其相容性.结果与结论:兔肋软骨脱细胞基质呈乳白色,小均一,色示支架结构完整,保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分,描电镜观察经一定时间的脱细胞处理后可得到结构完整,隙均匀的天然软骨支架,孔隙率为(61.31±8.45) %;孔径长度为(32.80±5.15) μm,合正态性分布,组脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下7 d后生物相容性良好,围软组织无明显充血、化脓等炎症排斥反应出现.结果显示,肋软骨脱细胞支架具有良好的基质组成,较完整、均匀的孔隙结构及孔径分布,作为组织工程支架材料.     

免软骨基质支架与脂肪干细胞的生物相容性

背景:软骨基质主要为II型胶原和葡萄糖胺聚糖,它是软骨细胞分化和发育的先天环境,能促进干细胞向软骨细胞分化.目的:观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性.设计、时间及地点:观察实验.于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成.材料:取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和Triton X-100脱去细胞成分制备软骨基质.脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、I型胶原酶消化并离心后获得.方法:将2×107L-1的脂肪干细胞悬液0.2mL滴在软骨基质支架表面,置于37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度的培养箱中静置4 h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况,同时计算细胞黏附率,并采用二甲氧唑黄比色法榆测细胞增殖趋势.结果:扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形,其黏附率为93.7%;苏木精～伊红染色见细胞向支架深层生长:二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势.结论:兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性.     

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate),PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料,具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能,但同其他酯类材料相似,PHBHOx亲水性能较差,单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足.目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性.方法:取新鲜猪膝关节表面透明软骨,采用非离子型去污剂Triton X-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理.低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架.分离培养猪关节软骨细胞,进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况.结果与结论:PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高,软骨细胞在支架上黏附紧密,生长良好.提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能.