Ag85A、Ag85B、16kDa和38kDa用于结核病血清学诊断的评价

目的对Ag85A、Ag85B、16k Da和38k Da 4种结核分枝杆菌抗原和几种抗原的组合进行诊断效能评价,分析其应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验,包被抗原使用Ag85A、Ag85B、16k Da和38k Da 4种原核系统表达的重组结核分枝杆菌抗原,检测54份结核病患者血清和93份健康者血清,并利用受试者工作特征曲线法计算不同抗原的最佳临界值(cut-off值),计算单种抗原和抗原组合的阳性率,对其诊断价值进行综合评价。结果 4种抗原的最佳包被浓度分别为3.05 mg/ml、4.50 mg/ml、2.45 mg/ml和7.50 mg/ml,最佳血清稀释度分别为1∶200、1∶400、1∶200、1∶200;11种抗原组合中Ag85B+16k Da+38k Da的组合诊断效能效果最好,灵敏度为70.4%,特异度为80.0%,诊断效率为76.2%,Youden指数为0.504。结论抗原组合Ag85B+16k Da+38k Da取得了较高的检测灵敏度,相比单种抗原更具有诊断价值。     

7种结核分枝杆菌重组蛋白的纯化及血清学特性

目的分离纯化结核分枝杆菌重组蛋白38-kDa、16-kDa、Mtb81、ESAT-6、CFP10、Rv3425、Rv3391,并比较7种蛋白的免疫学特性,评价其在结核血清学诊断中的应用价值。方法利用间接酶联免疫吸附试验评价确诊结核病人、非结核病人、健康人血清中7种重组蛋白的抗原性。结果成功分离纯化了7种重组蛋白;酶联免疫吸附试验结果表明,7种抗原均能有效区分确诊结核病人、非结核病人和健康人,其中阳性率最高的是ESAT-6为47.3%,特异性最高的是Rv3391为98.3%。联合抗原中阳性率和特异性最高的是CFP10+ESAT-6+Rv3391抗原组合。结论单一抗原中ESAT-6具有较高的免疫原性,联合抗原中CFP10+ESAT-6+Rv3391抗原具有很高的阳性率和特异性,在结核诊断具有很高的诊断潜力。     

结核分枝杆菌重组抗原Rv0350的克隆表达和血清学评价

目的对结核分枝杆菌重组抗原Rv0350基因进行克隆表达和纯化,并对其抗原性进行评价,分析此种抗原的应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv菌株基因组为模板,PCR扩增Rv0350基因片段,产物经验证后与载体质粒p ET-32a构建重组质粒,转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株内,蛋白诱导纯化后基于酶联免疫吸附试验(ELISA),使用重组结核抗原Rv0350对183份血清进行检测。运用受试者工作特征曲线法计算抗原的最佳临界值(cut-off值),并计算该抗原的灵敏度、特异度曲线下面积(AUC)和诊断效率,对其诊断能力和应用价值进行综合评价。结果经PCR扩增后的Rv0350基因片段电泳结果与目的基因相符,抗原诱导表达最佳时间为4 h,纯化蛋白与预期结果相同,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果表明,该蛋白的灵敏度为75.3%,特异度为80.0%,诊断效率为77.6%,Yuden指数为0.553,AUC为0.828。结论结核分枝杆菌重组抗原Rv0350具有良好的诊断灵敏度,有一定的临床应用价值。     

结核分枝杆菌4种新抗原的克隆表达及血清学评价

目的 初步评价结核分枝杆菌4种新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c和Rv1547的血清学诊断价值。方法 以结核分枝杆菌实验室标准参照菌株H37Rv全基因组DNA为模板PCR扩增Rv0432、Rv0674、Rv1566c基因的完整序列,Rv1547基因分为两段（Rv1547-1和Rv1547-2）扩增,与PET-32a表达载体构建重组质粒,重组蛋白利用亲和层析的方法进行纯化。待检测血清和BL21（DE3）菌体蛋白孵育进行预处理。各重组抗原用ELISA对151份待检血清（41份健康组血清和110份细菌学阳性结核患者组血清）进行IgG抗体检测。检测结果用受试者工作特征曲线对其诊断效能进行分析和评价。采用t检验比较目的蛋白在结核患者组和健康组的差异性。结果 成功克隆表达和纯化了蛋白Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2,ELISA结果显示Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数和曲线下面积分别为43.64%~92.73%、80.49%~92.68%、0.92~0.94、0.38~0.80、0.363~0.732和0.649~0.915。目的蛋白在结核组检测到的IgG抗体水平均大于健康组（P<0.000 1）。结论 结核分枝杆菌新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2具有良好的血清学检测价值,可作为结核病免疫学诊断的候选抗原。     

筛选结核分枝杆菌CFP10-ESAT6蛋白适配子的研究

目的通过SELEX技术筛选出结核分枝杆菌CFP10-ESAT6蛋白的高亲和性适配子。方法构建一个78碱基的ssDNA文库,利用SELEX技术筛选获得CFP10-ESAT6的适配子。用DNAMAN软件对其结构进行分析,酶联寡核苷酸吸附试验(ELOSA)测定亲和力。结果经过15轮筛选,ssDNA文库与CFP10-ESAT6亲和力从0.305提高到1.356。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适配子与CFP10-ESAT6结合的结构基础。结论初步获得了CFP10-ESAT6的高亲和性适配子,为开发结核病诊断和治疗试剂奠定了基础。     

结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的价值分析

目的探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值。方法回顾性分析2016年4月-2019年5月我院的疑似结核患者77例,其中确诊结核病患者31例,非结核患者46例,分别进行结核感染T细胞斑点试验及结核抗体检测,评价其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率,并对抗原A、B的诊断效能一致性、斑点分布特点进行分析。结果结核组T-SPOT.TB、TB-Ab的阳性率分别为87.1%、64.52%,两者比较差异有统计学意义;T-SPOT.TB的各项指标均高于TB-Ab,其中灵敏度、阴性预测值差异有统计学意义(P0.05),联合检测的灵敏度、阳性预测值高于T-SPOT.TB,阳性预测值差异有统计学意义(P0.05);特异度、阴性预测值、诊断符合率低于TSPOT.TB,其中阴性预测值差异有统计学意义(P0.05)。抗原A、B在总患者数,结核组、非结核组中具有较好的诊断一致性,其斑点数体现相同的特点。结论 T-SPOT.TB可有效诊断结核疾病,值得临床推广。     

结核杆菌重组Rv3425蛋白的结核病血清学诊断价值的评价

[目的]评价结核分支杆菌重组Rv3425蛋白在结核病血清学诊断中的价值。[方法]以重组Rv3425作为抗原，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测151份确诊结核病人、143份健康人、38份卡介苗接种阳转者和42份非结核病人血清中的抗结核抗体水平，并与结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）、Ag85B蛋白及TB—DOT、TB-CHECK-1试剂盒的检测结果进行比较，以此来评价重组Rv3425蛋白在结核病诊断上的价值。[结果]Rv3425与PPD和Ag85B抗原一样能够诊断结核病人，但PPD不能有效区分结核病人和BCG接种者，Rv3425和Ag85B蛋白可以明确区分。[结论]虽然重组Rv3425蛋白对结核病的阳性率尚不能与试剂盒媲美，但由于其能够有效区分结核病人和BCG阳转者，在结核病诊断方面具有很大的应用价值，可以作为结核病诊断的备选抗原之一。     

结核分枝杆菌4种分泌蛋白血清学应用价值

目的通过对4种基因重组的结核分枝杆菌分泌蛋白进行包被,建立了酶联免疫检测方法,用于检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者、卡介苗接种者的血清抗体,并探讨结核分枝杆菌分泌蛋白的血清学应用价值。方法在酶标板上分别包被基因重组蛋白ESAT-6、Ag85A、MPT64、MPT81抗原,建立间接ELISA方法,分别检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者和卡介苗接种前后的血清抗体。结果肺结核组血清抗体除ESAT-6外,Ag85A、MPT64、MPT81的阳性率均显著高于非结核肺部疾病组(P0.01)。结核菌素试验阴性者注射上述卡介苗前阳性率分别为19.0%、13.8%、12.1%、12.1%,注射后阳性率分别为37.9%、24.1%、15.5%、17.2%,其中注射ESAT-6前后阳性率之间的差异有显著性(P0.05)。结论用结核分枝杆菌重组分泌蛋白检测结核病人血清抗体具有重要的诊断价值,有望作为结核蛋白芯片的候选抗原。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测

目的 构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32(culture filtrate protein 32,CFP32)的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32,探讨其对结核病的诊断价值.方法 通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因,将其克隆到pMD18一T载体后,再亚克隆到表达载体pET21a,在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经纯化及复性后,通过Western blot分析,并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体,其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例,正常对照38名.结果 构建了CFP32重组质粒,并在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白经SDSPAGE分析,在约相对分子质量30 000处有表达条带,镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90%以上.Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合.并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测,结果敏感度为63.9%(62/97),特异度为96.8%(2/63).结论 成功构建pET21a-CFP32表达载体,并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白,对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一.     

结核分枝杆菌抗原Rv0585c人T细胞抗原表位鉴定及其免疫原性评价

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv0585c的抗原表位及其免疫原性,为结核病特异免疫诊断技术和疫苗的研发提供基础。方法 利用生物信息学TE-predict和IEDB人T细胞抗原表位预测软件进行结核分枝杆菌抗原Rv0585c的人T细胞抗原表位预测,根据预测结果,合成表位多肽,用ELISpot试验检测预测表位在临床结核病患者中的免疫反应性。分别采用高、低剂量（100 μg/只和50 μg/只）的Rv0585c抗原表位多肽、同时以高、低剂量（50 μg/只和20 μg/只）的Ag85B蛋白抗原为对照,对随机分组的BALB/c小鼠进行免疫。利用ELISA方法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平。结果 经生物信息学技术预测到Rv0585c 66个人T细胞抗原表位,选取合成了表位分布集中的抗原表位多肽9条。人群ELISpot试验筛选出3条阳性人T细胞表位多肽：P10110、P10112、P10117,用于肺结核检测的灵敏度分别为14.00%、12.00%和6.00%,特异度分别为100.00%、100.00%和97.96%;联合用于肺结核检测的灵敏度和特异度分别为22.00%和97.96%。动物免疫试验结果显示,P10110多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10,P10112多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10,均高于阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.001）。结论 Rv0585c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性,能刺激机体产生较强烈的细胞免疫应答,具有潜在的结核病细胞免疫诊断和新型结核疫苗的应用价值。     

结核分枝杆菌CFP10 ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10 ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10 ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10 ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10 ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25％,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为30.10％(31/103)和28.97％(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论rCFP10 ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌融合蛋白ELISA方法检测

目的探讨融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa对结核病的血清学诊断价值,并与脂阿拉伯甘露糖抗原(LAM)及结核蛋白芯片方法的检测结果进行比较,评价其应用价值。方法表达、纯化重组目的蛋白,分别以此蛋白和LAM为抗原包板,以酶标抗体为二抗,采用ELISA间接法检测肺结核患者血清、肺外结核患者血清及正常人血清,比较敏感性、特异性等,评价其对结核病的诊断价值。结果融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa、LAM、血清及酶标抗体的最佳工作稀释度分别为1、0.5μg/mL,1∶100、1∶4 000;分别用ESAT6-38kDa-16kDa和LAM检测761份结核病人血清,敏感性分别为76.9%、77.4%,特异性为89.2%、89.5%,差异均无统计学意义;ELISA法检测68份肺结核病血清标本融合蛋白,阳性检出率和阴性符合率与芯片检测结果有极高一致性。结论融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa作为抗原对结核病血清学诊断具有一定应用价值。     

外周血IFN-γ释放试验对活动性肺及胸膜结核诊断价值

目的探讨IFN-γ释放试验在活动性肺结核及胸膜结核诊断中的价值。方法使用TB-IGBA试剂、结核抗体试剂对湖南省人民医院呼吸科经诊断为活动性肺及胸膜结核分枝杆菌感染的患者70例和115例非结核患者外周血进行检测。结果 IFN-γ释放试验敏感性87.1%(61/70),特异性76.5%(88/115),阳性预测值69.3%(61/88),阴性预测值90.7%(88/97);结核抗体敏感性35.7%(25/70),特异性74.8%(86/115),阳性预测值46.3%(25/54),阴性预测值65.6%(86/131)。结论 IFN-γ释放试验诊断活动性肺结核及胸膜结核敏感性、特异性高,敏感性远远优于结核抗体检测,在活动性肺结核及胸膜结核诊断中有重要价值,值得临床推广。     

重组结核分枝杆菌16ku-38ku-ESAT-6融合蛋白的血清学评价

目的 以重组结核分枝杆菌16 ku-38 ku-ESAT-6融合蛋白(以下简称重组蛋白)为包被抗原,探讨该抗原对结核病的诊断价值.方法 结核组105例、对照组45例(包括非结核病患者25例及健康体检者20例),以重组蛋白作为包被抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测150例受检者血清中的重组蛋白抗体水平,得出各组之间的吸光度值及阳性率,并与结核分枝杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果进行比较,以此来评价重组蛋白对结核病的诊断价值,并建立受试者工作特征(ROC)曲线评价系统.结果 重组蛋白检测对照组的阳性率为6.67%(3/45),与试剂盒检测阳性率[51.11%(23/45)]比较差异有统计学意义(P＜0.01),结核组阳性率为59.05%(62/105),与试剂盒检测阳性率[64.76%(68/105)]比较差异无统计学意义(P＞0.05).结核组与对照组的吸光度值分别为2.22±0.58、1.35±0.24,两组比较差异有统计学意义(t=6.06,P＜0.01);重组蛋白检测结核病的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为59.05%、93.33%、95.38%、49.41%.应用ROC曲线分析,得出曲线下面积为0.751,cutoff值为2.52,此时敏感度及特异度分别为65.4%、84.8%.结论 重组蛋白检测血清结核抗体具有较高的特异度,可以更好地区分结核病患者群与非患者群,可以作为结核病诊断的备选抗原之一.

Abstract：

Objective To investigate the diagnostic value of 16 ku-38 ku-ESAT-6 protein in tuberculosis (TB). Methods ELISA was used for measuring the level of recombinant 16 ku-38 ku-ESAT-6 protein in 105 TB patients (TB group,26 patients with smear-positive, 79 patients with smear-negative) and 45 controls (control group, 20 healthy volunteers and 25 subjects with pulmonary diseases other than TB). The value of the antigen for diagnosis of TB in serodiagnosis was assessed, and ROC curve evaluation system was established. Results In control group, the positive rate of anti-recombinant 16 ku-38 ku-ESAT-6 protein and commercialization of TB antibody test kit had significant difference [6.67% (3/45) vs. 51.11% (23/45)](P＜0.01);but in TB group, there was no significant difference [59.05%(62/105) vs. 64.76% (68/105)](P＞0.05). The optical density value in TB group and control group was 2.22 ± 0.58 and 1.35 ± 0.24,and there was significant difference(t = 6.06,P＜ 0.01). The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the test was 59.05%,93.33%,95.38%,49.41% respectively. Analyzed by ROC curve, the area under the curve was 0.751, the- value of cutoff was 2.52, and sensitivity and specificity was 65.4% and 84.8%. Conclusions Recombinant 16 ku -38 ku -ESAT-6 protein of mycobacterium tuberculosis has higher specificity, and it can significantly distinguish TB and non-TB. So it might be selected as one of diagnosis antigens of TB.     

结核感染T细胞检测在肺外结核诊断应用价值

目的探讨结核感染T细胞检测在肺外结核诊断应用价值。方法选取本院2012年1月-2013年12月依据结核病原学、组织病理学、诊断性治疗有效及影像学支持临床诊断肺外结核病例80例,25例非结核肺部疾病以及8例健康对照。选用英国Oxford Immunotec Ltd.生产的结核感染T细胞检测试剂盒,按照使用说明操作六部法进行检测。利用蛋白芯片技术检测结核杆菌三种抗原的IgG抗体、痰抗酸染色涂片检查及痰结核分枝杆菌培养(采用改良罗氏法)。结果T-SPOT.TB在肺外结核病阳性率为81.3%、敏感度为84.2%、特异度97.1%、诊断效率87.6%。肺外结核组TSPOT.TB检测阳性率明显高于非结核疾病和健康对照组,差异有统计学意义(P0.01)。肺外结核疾病各组间敏感度、特异度、诊断效率比较差异无统计学意义(P0.05)。肺外结核疾病利用T-SPOT.TB和结核杆菌蛋白芯片检测方法配对比较,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P0.01)。结论肺外结核多脏器及临床表现差异性及复杂性,需要临床经验、有效的辅助检查诊断,T-SPOT.TB检测是结核病诊断金标准之外的非常有效辅助诊断方法,可节约诊断时间及不必要检查,可更好利用医疗资源同时减轻患者负担,更好防治结核病。     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的表达、纯化结核分枝杆菌rPstS1-HspX（rPH）融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法异丙基．陆D一硫代吡喃半乳糖苷（帆）诱导rPH融合蛋白表达,并用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。Western印迹分析纯化后融合蛋白的免疫反应性。最后用ELISA法检测194份血清抗体样本,其中来源于肺结核患者94份,非结核肺部疾病患者52份,健康对照者48份。结果rPH融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51000。经亲和层析后得到了浓度为0．62ng／mL,纯度达92％的融合蛋白。Western印迹实验证实纯化后融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫应答。重组蛋白rPH血清检测的灵敏度为77．6％（73／94）,特异性为92．0％（92／100）。结论成功表达和纯化了rPH融合蛋白,其用于结核病血清学诊断具有较好的灵敏度和较高的特异性,是ELISA的可靠抗原。     

T-SPOT在儿童结核病诊断中的价值

目的探讨T淋巴细胞酶联免疫斑点法(T-SPOT)在儿童结核病(TB)诊断中的应用价值。方法选取2015年3月—2016年5月某院收治并确诊的TB患儿43例作为结核组,随机选取同期在该院门诊及住院部排除结核感染的患儿及健康儿童50例作为对照组,分别对两组进行T-SPOT﹑PPD﹑结核抗体(MTB-Ab)及涂片抗酸染色等四种方法检测和对比分析,并对T-SPOT法在结核组不同感染部位、不同年龄段患者的阳性情况进行亚组分析。结果 T-SPOT在灵敏度和阴性预测值方面高于其余三种方法(P0.05),特异度也高于PPD法(P0.05);T-SPOT在肺内结核和肺外结核中检出的阳性率分别为88.9%和81.3%,差异无统计学意义(P0.05);在≤5岁和5岁儿童两组之间的检出率分别为70.6%和96.2%,差异有统计学意义(P0.05)。采用T-SPOT法和PPD法两种方法进行并联模式的结核检测时的灵敏度为95.3%,特异度为98.0%,相比于单一方法检测均有提高(P0.05)。结论 T-SPOT法在儿童TB检测方面相对于传统方法在灵敏度和特异度上均有优势,也适用于肺外结核的检测,可作为儿童结核实验室诊断的主要方法,但在5岁以下儿童存在不确定性,应合理联合PPD法检测,才能更好发挥在儿童TB诊断中的价值。     

结核感染T淋巴细胞γ干扰素释放试验在骨关节结核诊断中的应用

目的探讨结核感染T淋巴细胞γ干扰素释放试验(斑点试验,T-SPOT.TB)在骨关节结核中的应用价值。 方法回顾性分析2016年1月至2018年3月在我院骨外科行T-SPOT.TB检测的127疑似骨关节结核感染病例,分析T-SPOT.TB在骨关节结核中的诊断性能;比较在不同部位骨关节结核的阳性率差异;同时比较以早期分泌抗原靶6 (early secreted antigenic target 6,ESAT-6)和培养滤液蛋白10 (culture filtrate protein 10,CFP-10)诊断骨关节结核的阳性率差异。 结果T-SPOT.TB检测的正确率、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.61%(110/127)、83.33%(35/42)、88.24%(75/85)、77.78%(35/45)、91.46%(75/82);且在不同类型骨关节结核的阳性率差别无统计学意义(χ²=1.72,P>0.05);单独以ESAT-6和CFP-10抗原的点数诊断骨关节结核阳性率为69.04%、61.90%,差异无统计学意义(χ²=0.27,P>0.05),两者联合诊断阳性率(83.33%)均高于ESAT-6和CFP-10抗原单独诊断的阳性率,差异有统计学意义(χ²=4.16、7.11,P<0.05)。 结论T-SPOT.TB在骨关节结核诊断中具有重要的应用价值,值得临床推广。