组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1RmRNA的siRNA真核表达质粒。方法:从GeneBank中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R(NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1和psiIGF1R2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK。所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点。质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞。转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率。结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1R1、psiIGF1R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%～50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1R1、psiB-clXL2和psiIGF1R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%。结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA(short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1R2与psiBcl-XL1和psiIGF1R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高。     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

增强型绿色荧光蛋白基因与hTIMP 1基因融合表达载体的构建及鉴定

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与人组织型金属蛋白酶抑制剂1(hTIMP1)基因融合表达载体.方法:Trizol法提取总RNA,经逆转录合成cDNA.通过套式PCR获得hTIMP1开放读码框(ORF),将扩增产物与pEASY-Blunt Simple载体连接,进行序列分析.继而将该重组质粒和载体经XhoⅠ和HindⅢ双酶切,回收hTIMP1 ORF目的片段和pEGFP-C1载体大片段,将两者相连、扩增,筛选重组子进行PCR、双酶切鉴定及接头部分序列分析.结果:扩增得到hTIMP1 ORF约为624 bp,与预期长度相符.hTIMP1 ORF与pEASY-Blunt Simple载体相连,测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列无改变.hTIMP1 ORF与pEGFP-C1连接所得融合表达载体经PCR及双酶切鉴定(XhoⅠ和HindⅢ),证实hTIMP1 ORF插入pEGFP-C1.结论:成功构建EGFP基因与hTIMP1基因融合表达载体,为进一步研究hTIMP1蛋白的生物学功能和开展以hTIMP1为靶点的急性冠脉综合征的基因治疗奠定了基础.     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白报告基因rhPDGF-BB非融合型表达载体的构建及其转染

目的：构建并转染含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组人血小板衍化生长因子-BB（rhPDGF-BB）非融合型表达载体，为采用转基因工程化细胞修复糖尿病溃疡创面奠定基础。方法：从人脐静脉内皮细胞human umbil ical vein endothelial cell，HUVEC）中分离总RNA，行RT—PCR获得rhPDGF—BB cDNA，构建克隆质粒pMD 19-T／rhPDGF—BB，经测序正确后，再将该目的片段与真核表达载体pSELECT—GFPzeo—mcs连接，转化E．coli DH 5α感受态菌落筛选得到含GFP报告基因的非融合型表达载体，然后将其转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）并用免疫组化染色法鉴定。结果：PCR获得长度为681bp的目的片段，经pSELECT-GFPzeo—mcs载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入目的片段与GenBank检索的rhPDGF-BB cDNA序列（NM-033016）完全匹配。结论：成功构建了非融合型表达载体pSELECT-GFPzeo—mes／rhPDGF-BB，并实现了rhPDGF-BB基因在CHO的表达。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及在真核细胞的表达

目的 构建人胰岛素样生长因子—1(IGF1)真核表达载体，并在成纤维细胞NIH3T3细胞内进行表达。方法 用RT-PCR法从人肝细胞中克隆人IGF1的基因，将其连入真核表达载体pSec-Tag／FRT／V5一His，PCR法及测序鉴定阳性克隆；用脂质体法将阳性克隆转染NIH3T3细胞；收集转染后的细胞上清，用Western blot进行检测。结果 琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出315bp的条带；与载体连接后的克隆进行测序得到一个阳性克隆；Western blot检测显示转染后细胞上清出现与预计值相符的特异性条带。结论 成功克隆并构建人IGF1基因的真核表达载体，转染后NIH3T3细胞成功表达IGF1重组蛋白。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizd法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上,构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／myc．BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合,重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1,为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。     

FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位

目的构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位。方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位。结果成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中。结论成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点。     

真核表达载体pEGFP-N1-kin17的构建及其在Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞内的表达

目的：构建人kin17基因真核表达载体pEGFP-N1-kin17,将载体转染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纤维上皮细胞,荧光显微镜观察kin17蛋白表达情况。方法用高保真DNA 聚合酶,从pCMV-kin17载体中扩增获取人kin17 cDNA编码序列,将其克隆至pEGFP-N1载体中,经酶切、连接、转化后,挑取阳性克隆进行菌液进行PCR、菌液质粒双酶切及测序鉴定;将成功构建的GFP-kin17表达载体转染Zmpste24-/- MEFs,荧光显微镜观察kin17蛋白的核定位情况。结果 pEGFP-N1-kin17转化细菌克隆测序结果完全正确;将载体转入MEFs后,可以通过荧光显微镜观察到kin17蛋白的表达。结论成功构建GFP融合的kin17真核表达载体,该载体为kin17蛋白的研究提供工具。本实验中载体pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均成功表达。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

FL基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的获得人FLcDNA膜外序列 ,构建表达人FL蛋白的重组体并实现其有效表达 ,更深入地探讨FL的生物学功能。方法提取胎肝细胞总RNA经RT PCR扩增目的cDNA片段 ,并将其克隆至pUC 18T载体中 ,测定其DNA序列 ,将该基因重组于GST融合蛋白表达载体pEGX 4T 1并进行表达。结果从胎肝细胞总RNA中扩增得到 5 46bp片段 ,序列测定结果与文献报道一致 ,表达的FL蛋白占菌体总蛋白的 10 %左右。结论人FL基因在大肠杆菌DH5α中获得了有效表达 ,为进一步的基础研究和临床应用奠定基础。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

靶向大鼠血管紧张素转换酶基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠血管紧张素转换酶-短发夹RNA(ACE-shRNA)腺病毒载体并在人胚胎肾-293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-ACE-shRNA真核表达载体中用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出ACE-shRNA片段,并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-ACE-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶,聚合酶链反应(PCR)检测和绿色荧光蛋白(FGFP)表达证实成功地构建了携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带ACE-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步利用基因沉默技术抗高血压的研究奠定了基础。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。