腺病毒介导的HSV-TK对骨关节炎滑膜细胞的作用

目的：观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒 胸苷激酶基因（HSV-TK）对骨关节炎滑膜细胞的作用。方法：含HSV-TK基因的重组腺病毒转染骨关节炎滑膜细胞，观察转染效率，经丙氧鸟苷（GCV）处理后测定滑膜细胞的抑制率，动态观察细胞形态学变化，荧光染色观察细胞核形态学变化，定量分析细胞的凋亡和坏死率。结果：含TK基因的重组腺病毒有效感染骨关节炎滑膜细胞，治疗组对滑膜细胞有显著的抑制作用（P<0.05），转染细胞死亡有坏死和凋亡两种形式。结论：HSV-TK/GCV系统对骨关节炎滑膜细胞有显著的抑制作用。     

胃癌BGC-823肿瘤细胞系SP表型初步分析

目的〓〖HTK〗观察人胃癌BGC-823肿瘤细胞系中是否含有SP细胞及SP细胞的形态特点，并验证该表型细胞与干细胞标志物(ABCG2)的关系。〖HTW〗方法〓〖HTK〗取贴壁生长的BGC-823细胞，经Hoechst33342染色，于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点，计算其百分比；之后对细胞爬片进行Hoechst33342染色和ABCG2的免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2的表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗荧光显微镜下可见BGC-823细胞系中存在SP细胞，且该类细胞体积较小，约占细胞总数的1.8%；免疫荧光染色可见爬片细胞中ABCG2+细胞即为SP表型细胞。〖HTW〗结论〓〖HTK〗人胃癌BGC-823细胞系中存有SP细胞，且该表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。     

尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞内游离钙浓度的影响

目的〓〖HTK〗研究尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞胞浆内游离钙离子浓度变化的影响。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将Wistar大鼠随机分为对照组、创伤组、治疗组；创伤组按照Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型，治疗组在外伤后开始静脉滴注尼莫地平。分别对脑挫裂伤后0.5、1、3、6、12、24、48h各时相点细胞内游离钙离子浓度和细胞凋亡率进行检测。对不同时相的创伤组、治疗组和对照组进行比较分析。〖HTW〗结果〓〖HTK〗脑挫裂伤后大脑皮层神经细胞内游离钙离子浓度迅速升高，0.5h时为正常值的4倍，24h时达到高峰，48h时降低明显，但仍然维持在比较高的水平。应用尼莫地平治疗后，钙离子浓度显著降低，6h时降至接近正常水平。脑挫裂伤后神经细胞凋亡率和胞内游离钙离子浓度存在相关性。〖HTW〗结论〓〖HTK〗脑挫裂伤后神经细胞胞浆内钙离子浓度升高，导致钙超载并引起细胞凋亡。早期应用尼莫地平能抑制钙超载，抑制细胞凋亡，对神经细胞具有极强的保护作用。     

三唑类药物与环孢菌素A的体外联合抗真菌作用

目的〓〖HTK〗评价氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑分别与环孢菌素A联合应用时对敏感与耐药白色念珠菌的体外抗真菌效果。〖HTW〗方法〓〖HTK〗采用棋盘法测定两类药物联用的体外抗真菌效果，以OD值测定法判读MIC值，并以FICI法对联用结果进行评价。〖HTW〗结果〓〖HTK〗两类药物联用对耐药白色念珠菌全部表现为协同作用，对敏感菌大多表现为无关作用。〖HTW〗结论〓〖HTK〗对于耐药白色念珠菌，环孢菌素A对3种三唑类药物均有明显的增敏作用，但对敏感菌的增敏作用不明显。以OD值测定法判读MIC值具有客观、迅速简便的特点。     

大鼠酒精性脂肪肝中Fbw7的表达

目的〓〖HTK〗分析大鼠酒精性脂肪肝Fbw7 mRNA及蛋白的表达量，研究其在酒精性脂肪肝发病机制中的作用。〖HTW〗方法〓〖HTK〗利用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性脂肪肝模型，于12周末处死大鼠。肝脏石蜡切片HE染色观察病理学改变，采用荧光定量PCR及Western blot方法测定大鼠肝组织Fbw7 mRNA含量及蛋白表达量。〖HTW〗结果〓〖HTK〗光镜下，模型组肝脏出现明显脂肪病变，肝组织中甘油三酯含量明显高于正常对照组（P＜0.01），Fbw7 mRNA及蛋白水平亦降低（P＜0.01），并与甘油三酯含量呈负相关。〖HTW〗结论〓〖HTK〗大鼠酒精性肝病时，Fbw7 mRNA及蛋白表达下降，可能在酒精性脂肪肝发病机制中发挥重要作用。     

液相色谱质谱联用技术测定动物血浆和组织中莪术醇

目的〓〖HTK〗建立HPLC-MS/MS法测定动物组织和血浆中莪术醇浓度。〖HTW〗方法〓〖HTK〗以奥硝唑为内标物，DiamonsilTM色谱柱C18(150mm×4.6mm, 5μm)为固定相，流速1mL/min，采用多反应离子检测方式测定犬血浆和大鼠5种组织样品中莪术醇（m/z 254.3→219.3）和内标奥硝唑（m/z 220.3→128.2）的浓度。〖HTW〗结果〓〖HTK〗在动物血浆和组织匀浆中，莪术醇浓度与内标物峰面积之比呈良好的线性关系。〖HTW〗结论〓〖HTK〗所建立的HPLC-MS/MS方法操作简便快速，灵敏度高，专属性强，可用于莪术醇动物药代动力学和组织分布研究。     

丁苯酞对氯化锂-匹鲁卡品诱发的癫痫大鼠海马神经元损伤的作用

目的〓〖HTK〗探讨丁苯酞对颞叶癫痫大鼠海马神经元的保护作用。 〖HTW〗方法〓〖HTK〗随机将30只雄性成年Wistar大鼠分为丁苯酞组、癫痫组和空白对照组。丁苯酞组和癫痫组先分别给予丁苯酞80mg/kg、等量生理盐水腹腔注射，再分别给予氯化锂、匹鲁卡品建立癫痫模型，在癫痫发作终止后3、24h时将动物处死，分别取出海马在光镜和电镜下观察，并检测超氧化物歧化酶活力及丙二醛含量。 〖HTW〗结果〓〖HTK〗丁苯酞组能明显延长癫痫发作的潜伏期，增加超氧化物歧化酶的活力（P＜0.01，P＜0.05），降低丙二醛的含量（P＜0.05，P＜0.01），细胞结构基本正常，但核仁有边聚、间隙肿胀，部分线粒体膜有断裂和嵴缺失现象。癫痫组细胞肿胀、破裂，神经元数目明显减少, 胞质中线粒体变形、肿胀, 线粒体嵴缺失。 〖HTW〗结论〓〖HTK〗丁苯酞能减轻颞叶癫痫对海马神经元造成的损伤，其作用机制可能与丁苯酞对神经元线粒体的保护有关。     

前列腺组织特异性启动子介导的TAT-EGFP的靶向表达

目的〓〖HTK〗构建由前列腺特异抗原（PSA）启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列（TAT）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白pPSA-TAT-EGFP表达载体，使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达，提高其特异性及表达效率。〖HTW〗方法〓〖HTK〗以pEGFP-1载体为模板，设计包含TAT序列的引物，PCR技术扩增含有酶切位点的小片段Sal I-TAT-EGFP-Not I，经胶回收纯化，连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后，提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。 含有PSA启动子的pPSA-EGFP载体经Sal I和Not I双酶切后，胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段，得到pPSA-TAT-EGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗成功构建pPSA-TAT-EGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。〖HTW〗结论〓〖HTK〗引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。     

控制牙菌斑对胃粘膜幽门螺旋杆菌检出率的影响

目的〓〖HTK〗通过检测胃粘膜幽门螺旋杆菌（HP），观察控制牙菌斑对胃粘膜ＨＰ检出率的影响，探讨口腔和胃内ＨＰ的相关性。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将根除胃内ＨＰ的患者108例分为试验组（n=56）和对照组（n=52）。试验组行彻底的牙菌斑控制，对照组未行牙菌斑控制或控制失败。半年后均行胃镜复查，并行病理检查和快速尿素酶试验检测胃内ＨＰ，确定其检出率。〖HTW〗结果〓〖HTK〗试验组56例患者中胃ＨＰ阳性者11例，检出率为19.6%；对照组52例患者中胃ＨＰ阳性者42例，检出率为80.8%，试验组胃粘膜中ＨＰ的检出率明显低于对照组（P＜0.05）。〖HTW〗结论〓〖HTK〗口腔与胃ＨＰ感染之间具有明显相关性。提示治疗ＨＰ相关性胃病时，应注意口腔卫生，控制牙菌斑。     

Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因在肾癌中的表达

目的〓〖HTK〗探讨肾癌组织CCN蛋白中Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1 基因的蛋白表达水平及意义。〖HTW〗方法〓〖HTK〗采用Western blot半定量方法检测31例肾癌组织和18例癌旁正常肾组织中Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因的蛋白表达。 〖HTW〗结果〓〖HTK〗Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1蛋白在肾癌组织中的表达水平均低于癌旁正常组织(P<0.05)，其中乳头状肾癌的NOV和WISP-1 表达水平高于透明细胞癌(P<0.05)，G1级肿瘤NOV表达水平高于G2，3肿瘤(P<0.05)。 〖HTW〗结论〓〖HTK〗Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1在肾癌中低表达， CCN基因在肾癌的发生和发展中可能起抑制作用。     

HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用；转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合，再加入GCV，MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞，在感染复数（MOI）为100时，平均细胞存活率为26％；HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”，当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时，细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的：用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。 方法：利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。 结果：随着AdCMVLacZ的病毒量（MOI）增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞, 且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。 结论：AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。     

单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦系统杀伤前列腺癌细胞的"旁观者效应"及其调控

目的评价单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统杀伤前列腺癌细胞PC-3m的“旁观者效应”,探讨连接蛋白（Cx）介导的细胞间隙连接交流（GJIC）在该系统“旁观者效应”中的作用,观察apigenin对PC-3m细胞连接蛋白43（Cx43）表达及GJIC状况的调控。方法MTT法评价TK基因系统杀伤PC-3m细胞的“旁观者效应”,划痕标记染料示踪技术（SLDT）比较几种代表细胞系GJIC功能状况,检测HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”。逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）法和SLDT检测PC-3m细胞Cx43表达和GJIC状况,并观察apigenin对Cx43表达、GJIC状况及“旁观者效应”的调控作用。结果HSV-TK/GCV系统杀伤PC-3m细胞时“旁观者效应”程度较弱,TK基因阳性细胞比例约为10%的混合细胞经100 μmol/L GCV处理72 h后,仅23.5%±3.21%细胞被杀灭。该自杀基因系统对GJIC功能强大的NIH-3T3、 Cos-7和L-02细胞“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞者强（P<0.001）。PC-3m细胞Cx43 mRNA表达降低,GJIC功能低下,apigenin不仅可上调PC-3m细胞Cx43表达、促进GJIC功能,还可使其“旁观者效应”明显改观（P<0.001）。结论细胞内在的GJIC功能与HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”程度有正向关系,PC-3m细胞Cx43 mRNA表达减弱及GJIC功能低下可能是导致HSV-TK/GCV系统杀伤该细胞时“旁观者效应”较弱的原因,某些化学物质如apigenin可通过上调PC-3m细胞Cx43表达并促进GJIC功能,增强“旁观者效应”程度及TK基因系统疗效。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

Apigenin/GCV对C_6-TK细胞株的杀伤效应及作用机制

目的探讨Apigenin/GCV对体外培养鼠胶质瘤C6细胞的杀伤效应及作用机制。方法对含有导入pcDNA3-TK质粒的C6细胞进行培养、传代：通过MTT法、TUNEL实验法及光镜技术检测GCV/Apigenin对检测不同组别C6细胞C6-TK细胞株的杀伤效应。结果给GCV＋Apigenin后：转染组、空载体组和对照组中两两比较：转染组的细胞增殖水平显著低于空载体组和对照组（P〈0.05）;相对未处理组,用10μmol/LApigenin预先处理6h后,GCV对C6混合细胞的杀伤效应显著增强（P〈0.01）。结论缝隙连接功能上调剂Apigenin可显著提高HSV-TK/GCV肿瘤自杀基因系统的＂旁观者效应＂及显著促凋亡作用。GCV的作用效能对细胞间通讯功能有一定的依赖性。     

Relationship between the expression of connexin43 and bystander effect of suicide gene therapy in ovarian cancer

heHSV TKbystandereffecthasbeendefinedtodescribetheGCV mediateddeathofHSV TKex pressingcellsandadjacentHSV TKnegativecells .Thiseffectisconsideredaprerequisiteforthethera peuticefficacyofHSV TK /GCVtherapyowingtothecurrentlowefficiencyofdeliveryvectorstota…     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。