人野生型P^53与反义mdm2基因融合体真核表达载体的构建及其在Mc3细胞中的表达

目的构建P^53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体，并探讨其在人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞中的表达。方法应用分子克隆技术，将mdm2 cDNA序列反向插入到含有P^53基因序列pDOR—Neo中的P^53。基因序列下游，构成含有P^53基因与反义mdm2基因融合基因的逆转录病毒表达载体。经酶切分析鉴定后命名为pDOR—Neo—P^53-F mdm2并将重组载体通过脂质体转染Mc3细胞，通过G418筛选转染阳性细胞，并采用Westernblot方法检测P^53蛋白表达。结果酶切鉴定证实重组载体含有P^53与反义mdm2 cDNA片段，实验结果表明：转染后P^53蛋白（1．35±0．14）较对照组P^53蛋白（6．26±0．11）含量显著减低（P〈0．01），转染空载体P^53蛋白（6．24土0．12）与对照组比较无统计学差异（P〉0．05）。结论P^53与反义mdm2基因融合体真核表达载体构建成功，并表达野生型P^53蛋白和封闭mdm2基因，为今后进一步研究打下了基础。     

siRNA对腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰技术靶向阻断survivin基因表达，探讨其蛋白表达水平及对细胞增殖抑制作用。方法将siRNA真核表达载体Pgenesil-sur通过脂质体介导转染腺样囊性癌细胞，采用免疫组化法检测survivin基因蛋白表达；并用图象分析仪分析蛋白表达强度及表达抑制率。MTT法检测对腺样囊性癌细胞增殖的抑制作用。结果空白对照组、空质粒载体组、RNA干扰组survivin蛋白表达强度分别为：2．52±0．10，2．48±0．11，0．53±0．10。经统计学分析表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后。survivin基因蛋白表达水平明显减低（P〈0.05），其抑制率达到79％；转染空质粒载体与空白对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；MTT法结果表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后细胞增殖受到显著抑制，抑制率为38．80％（P〈0．05）；转染空质粒载体细胞增殖未受到抑制（P〉0．05）。结论靶向survivin siRNA能抑制体外培养的腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖作用。     

逆转录病毒介导野生型P^53与反义mdm2融合基因对Mc3细胞凋亡的影响

目的 探讨P53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体诱导人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞凋亡的影响.方法 将P53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体通过脂质体转染Mc3细胞,采用形态学观察凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳检测"梯状条带";末端转移酶标记法(TUNEL)检测凋亡指数;透射电镜检测凋亡小体.结果 转染48 h后形态学观察到细胞体积缩小;核浓染碎裂成大小不等的碎片;核染色质成新月形,琼脂糖凝胶电泳可见180～200 bp典型的凋亡带,TUNEL检测凋亡指数为25.22±1.01(转染后),与对照组2.01±1.10(转染前)比较差异有统计学意义(P<0.05),转染空载体(2.02±1.11)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),透射电镜可见染色质浓集分布不均,形成由核膜包裹断裂的核碎片的凋亡小体.结论 P53与反义mdm2基因融合体真核表达载体能诱导和促使体外培养的人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞发生凋亡.     

人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达

本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ（human coagulation factorⅨ，hFⅨ）基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480，用RT-PCR检测mRNA的转录，荧光显微镜观察转染效率，ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明：转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录；荧光显微镜观察到48小时转染效率最高；ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为（11．34&#177;0．23）ng／（10^6cells&#183;24h），第48小时hFⅨ蛋白量最高，达（29．34&#177;1．00）ng／（10^6cells&#183;24h），转染后72小时降为（12．45&#177;0．15）ng）／（10^6cells&#183;24h）。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性，48小时达峰值（6．07&#177;0、17）％／10^6cells，第72小时降至（1．81&#177;0．06）％／10^6cells。结论：肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ，肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。     

反义T-STAR基因对A549细胞的调节作用

目的：观察反义T-STAR基因对肺腺癌细胞A549的T-STAR蛋白表达的调节作用。 方法：实验于2002-09／2004-03在西南医院中心实验室完成。①用双酶切定向克隆法．构建T-STAR反义核酸真核表达载体pneo-STAR。②A549细胞分4组用脂质体介导转染法分别转染：A549-STAR细胞组转入正义T-STAR基因真核表达载体pEGFP-C1／T-STAR，A549-asSTAR细胞组转入反义T-STAR基因真核表达载体pneo-STAR，A549-neo细胞组转入空载体质粒pcl-neo，A549细胞组为相同处理下不加任何载体的A549细胞。③用反转录-聚合酶链反应和western blot联合检测以上各组细胞的T-STAR表达情况。 结果：①A549-STAR细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量显著高于A549细胞组[（19434&;#177;219）和（1．280&;#177;0．018），（6922&;#177;113）和（0．323&;#177;0．015），P〈0．05]。②A549-asSTAR细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量[（1122&;#177;97），（0．133&;#177;0．005）]显著低于A549细胞组（P〈0．05）。③A549-neo细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量[（6295&;#177;143），（0．625&;#177;0．085）]与A549细胞组差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：导入正义T-STAR基因后的A549细胞中，T-STAR蛋白及RNA表达增加，导入反义T-STAR基因后的A5．9细胞中，T-STAR蛋白及RNA表达减少，说明反义核酸真核表达载体pneo-STAR可以特异性降低A549细胞中T-STAR基因的表达．为进一步研究T-STAR基因的功能奠定了基础。     

Snail1外源性过表达诱导HepG2细胞上皮间叶样表型转化的实验研究

目的探讨Snaill蛋白诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化并增强其侵袭转移能力的效应。方法利用重组腺病毒载体pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2肝癌细胞株,诱导外源性Snail1蛋白过表达,以空载腺病毒pAdEasy-GFP作为对照。利用RT-PCR、Westernblot和细胞免疫组织化学的方法,检测转染后HepG2细胞Snail1、E—eadherin、N-eadherin、Vimaentin的mRNA转录和蛋白表达水平。随机运动实验及侵袭实验检测HepG2细胞转染目的基因后运动侵袭能力的改变。结果①pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2细胞,与对照组相比SNAI1mRNA和Snail1蛋白表达均显著增强（分别为1．591&#177;0．090、0．414&#177;0．031,0．995&#177;0．009、0．423&#177;0．002。P〈0．01）,Snai1蛋白在胞浆和胞核着色明显强化。②实验组HepG2细胞,在mRNA和蛋白水平E-cadherin表达均显著受到抑制（分别为0．528&#177;0,037、1．668&#177;0．065,0．284&#177;0．003、1．067&#177;0．011,P〈0．01）,N—cadhrein、Vimentin表达则明显上调（N—eadhrein：0．945&#177;0．029、0．600&#177;0．015,0．655&#177;0．007、0．226&#177;0．007,P〈0．01;Vimentin：1．630&#177;0．123、0．291&#177;0．024,0.692&#177;0,009、0．219&#177;0．005,P〈0．01）;③实验组随机运动实验中各观察时相点细胞空白区均小于对照组;侵袭实验中,实验组穿膜细胞数多于对照组（59．4&#177;7．48、23．9&#177;4．15,P〈0．01）。结论外源性Snail1蛋白过表达能诱导HepG2细胞出现EMT样变化,细胞运动、侵袭能力增强。     

P^53,mdm2和neo基因探针的制备与应用

为研究P53和mdm2基因在肿瘤细胞中的表达意义。本文将克隆于质粒载体中的P53、mdm2和neo基因分别用双酶切割得到P53、mdm2cDNA和neo基因片段，采用地高辛标记制备P53、mdm2、cDNA和neo基因探针，用于DNA和RNA斑点杂交及肿瘤细胞中P53和mdm2的检测。1材料和方法1．1材料1．1．1主要试剂：TE液（1mmol／LTris－HCI；1mmol几EDTA，pH8．0）、EcoRI、BamH！、Sal！、fundl、Xbal、lug－11－duTP（均购自德国BoeheringerMannbeim公司）。1．1．2重组质粒：PDOR－P‘’、PDOR－mdm。、pBCMGSNeo（本室保存）。1．1．3细胞系…     

RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体，转染EC109细胞，筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照；通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量，比较各组细胞在体内的增殖速度；免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为（8．86&#177;1．069）d，高于其它各组；平均瘤重为（0．32&#177;0．12）g，低于其它组，均有显著差异（P〈0．05）；TUNEL法细胞凋亡检测，siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为（10．52&#177;4．35），高于其它组，具有显著性差异（P〈0．05）；结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用，诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。     

CCND1和myc的mRNA联合检测在乳腺癌诊断中的临床研究

目的建立荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）法检测细胞周期蛋白D1（CCND1）基因和核内原癌（myc）基因表达水平,探讨其联合检测在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法建立FQ—PCR法,并以β2-微球蛋白为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和151例乳腺癌患者外周血中CCND1和myc的表达量。结果CCND1和myc表达水平在健康女性体检者、良性乳腺疾病扣乳腺癌患者中分别为（1．45&#177;0．12）&#215;10^-3,（1．45&#177;0．11）&#215;10^-3,（4．15&#177;1．02）&#215;10^-3;（1．15&#177;0．07）&#215;10^-3,（1．15&#177;0．08）&#215;10^-3,（2．86&#177;1．51）&#215;10^-3,它们在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学显著性意义（P〉0．05）,乳腺癌组均高于前两组（P〈0．05）,β2-微球蛋白在三组间差异无统计学显著性意义（P〉O．05）。CCND1和myc联合检测的灵敏度高于单个基因的检测。结论FQ—PCR技术是高灵敏度、高特异度的快速定量检测CCND1和myc的方法,两者联合检测可有效提高乳腺癌的诊断灵敏度。     

转染乙醛脱氢酶2基因对心肌梗死后心衰小鼠心功能的影响

目的：观察左心室腔内注射法转染乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因对急性心肌梗死（AMI）后C57/BL6小鼠心功能的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠分3组：（1）对照组（CON，0.1mL0.9%氯化钠）；（2）转染带绿色荧光蛋白（BV）的空载体组（blankvector BV，2.0&#215;10^8pfu&#183;μL^-1，0.1mL）；（3）转染乙醛脱氢酶2腺病毒载体组（ALDH2，2.0&#215;10^8pfu&#183;μL^-1，0.1mL）。3组小鼠闭合主动脉，左心室分别注射0.9%氯化钠或腺病毒载体，48h后结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死（AMI）模型。4周时分别检测超声心动图，4周处死3组小鼠（n=3）观察ALDH2表达水平，免疫组化检测p53蛋白表达水平，TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：心脏超声检查显示，术后4周，ALDH2组左室舒张末内径（LVEED）显著低于CON组和BV组，左室短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）值则显著提高（均P〈0.05）。TUNEL法检测结果表明，左室梗死区域ALDH2组凋亡细胞明显少于CON组（P〈0.001）。免疫组化结果显示，ALDH2组中p53核染色阳性细胞数量远远小于CON组（P〈0.001）。结论：ALDH2基因的高表达可以有效地抑制急性心肌梗死后心衰小鼠心肌细胞的凋亡，改善心脏功能，此作用可能是通过抑制p53的表达来实现的。     

LIMK1和Cofilin蛋白在前列腺癌组织中的表达及其临床意义

[目的]探讨LIM激酶-1(LIMK1)和丝切蛋白(Cofilin)在前列腺癌组织中的表达及其临床意义.[方法]选择2015年9月至2018年6月在本院诊治的93前列腺癌患者及51例前列腺增生患者,采用免疫组化法检测前列腺癌组织及前列腺增生组织中LIMK1与Cofilin蛋白表达水平;分析前列腺癌组织中LIMK1与Cofilin蛋白表达水平的相关性及其与患者病理特征及预后的关系.[结果]前列腺癌组织中LIMK1和Cofilin蛋白阳性率明显高于前列腺增生组织(P<0.05);前列腺体积、精囊侵犯、淋巴结转移、包膜侵犯、切缘阳性、前列腺特异性抗原(PSA)水平、前列腺特异性抗原密度(PSAD)、Gleason评分及临床T分期不同的前列腺癌患者癌组织中LIMK1及Cofilin蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.05);LIMK1和Cofilin蛋白表达与前列腺癌患者生存率明显有关(P<0.05);前列腺癌组织中LIMK1和Cofilin蛋白表达呈正相关(P<0.05).[结论]LIMK1与Cofi-lin蛋白在前列腺癌组织中呈阳性表达,其与前列腺癌患者的临床病理特征和生存率有关,可作为前列腺癌患者诊治和判断预后的指标.     

差异表达基因Hepsin在前列腺癌中的表达及其意义

目的探讨cDNA芯片筛选出的前列腺癌（PC）差异表达基因Hepsin在PC中的表达及其意义。方法应用RT—PCR检测Hepsin在正常前列腺组织、PC组织及PC细胞系中的表达，并进行半定量分析，同时采用免疫印迹法检测Hepsin的表达，采用免疫组织化学染色法检测40例PC标本、15例前列腺增生（BPH）标本和6例正常前列腺标本的Hepsin表达水平。结果在mRNA水平，Hepsin在PC中的表达水平高于正常前列腺组织（P=0．026），但在PC细胞系中的表达并不增高。在蛋白表达水平，正常前列腺组织未表达Hepsin，而PC及PC细胞系均表达Hepsin。PC和BPH标本免疫组化检测均为阳性，但两者间有非常高度显著性差异（P=0．000），而正常前列腺标本为阴性。结论Hepsin在PC中的表达增高，有可能作为早期诊断的标志以及基因治疗的靶基因。     

瘦素、N-Cadherin在大肠癌中的表达及临床意义

【目的】探讨瘦素、N-Cadherin蛋白表达与大肠癌临床病理特征之间的关系。【方法】采用免疫组织化学SP法检测蛋白瘦素、N-Cadherin在120例大肠癌中的表达并分析与临床病例资料的关系。【结果】瘦素、N-Cadherin在大肠癌中的阳性表达率分别为75.8%(91/120)和68.3%(82/120);瘦素与N-Cadherin的高表达均与大肠癌的浸润深度、临床分期、淋巴结转移、分化程度密切相关(P<0.05);大肠癌组织中瘦素、N-Cadherin的表达呈显著正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】瘦素、N-Cadherin可能在大肠癌的发生、发展中起相互协同作用,二者可能作为判断大肠癌预后及指导临床治疗的指标。     

中性粒VCS参数表达的性别差及差异表达的临床应用

目的建立健康人群中性粒细胞体积、浆核比例、胞浆颗粒的参考区间并探讨其在细菌感染和急性髓系白血病中的应用。方法挑选2014年1～6月159例健康体检标本(男性79例,女性80例),80例血液细菌感染标本和59例急性髓系白血病标本,统计分析健康男性与女性中性粒细胞VCS参数(MNV,MNC,MNS)的差异性并建立其参考区间;同时分析该指标在健康人群、细菌感染与急性髓系白血病中的表达差异性并分析原因。结果男性与女性中性粒细胞VCS参数MNV(fl),MNC,MNS分别为140.1±7.9,161.5±4.5,155.7±6.5和140.3±7.6,162.9±3.8,155.3±9.7,采用独立样本t检验,两组间差异无统计学意义(t值分别为0.681,0.423和0.395,均P>0.05),建立健康人群中性粒细胞VCS参数参考区间:MNV 140.2±7.7 fl,MNC 162.2±4.4,MNS 155.5±8.2;MNV(fl),MNC,MNS在健康人、细菌感染和急性髓系白血病中的表达分别为140.2±7.7,162.2±4.4,155.5±8.2;168.3±13.7,154.2±5.5,133.2±11.1和180.1±13.9,150.9±10.7,125.1±17.1。采用非参数检验,三组间的差异有统计学意义(H值分别为58.683,43.101和37.536,均P<0.05);健康人和细菌感染组间的差异具有统计学意义(z值分别为-6.545,-6.104和-4.325,均P<0.05),健康人和急性髓系白血病组间的差异有统计学意义(z值分别为-5.337,-3.867和-5.264,均P<0.05),但是细菌感染和急性髓系白血病组间的表达差异无统计学意义(z值分别为-0.843,-0.811和-1.177,均P>0.05)。结论中性粒细胞VCS参数的表达不受性别的影响,可作为一种快速、经济的临床筛检指标,提示细菌感染和白血病等疾病的存在。     

LRP15基因的表达谱分析及其在白血病细胞中的表达

为检测LRP15基因在肿瘤细胞以及处于不同发育阶段造血细胞的表达状况 ,探讨其在肿瘤发生、发展以及在白血病分型预后中可能具有的作用 ,利用NCBI提供的SAGE文库及NCI提供的正常组织及肿瘤细胞基因表达数据库 ,分析比较了LRP15基因在多种肿瘤组织、细胞系和正常组织中的表达谱 ;采用RT PCR方法检测了该基因在正常血细胞及原代白血病细胞中的表达状况。结果显示 ,LRP15在人类多种正常组织及肿瘤细胞中有表达 ;在幼稚细胞中表达阳性率高于成熟细胞 (P <0 .0 1) ,在急性髓细胞白血病中M1、M2 和M3 表达的阳性率高于其它亚型 (P <0 .0 1) ;难治组LRP15表达的阳性率有高于初治组的趋势。结论 ,LRP15基因与急性白血病及其它多种肿瘤的发生、发展密切相关 ,对急性白血病的临床分型具有重要的意义 ,可能对判断急性白血病的预后具有一定价值。     

重组水蛭素克隆的表达及其产物的分离纯化

目的：在原核细胞中表达具有生物活性的重组水蛭素变异物１（ｒＨＶ１）并进行重组产物的分离纯化研究。方法：以质粒ｐＢＶ２２０为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ｒＨＶ１，发色底物法测定其抗凝血酶生物活性；利用超滤、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０以及凝血酶亲合层析进行重组产物的分离纯化。结果：在大肠杆菌中获得了ｒＨＶ１的活性表达，表达量约占总蛋白的１６．９％，活力达到２０～３０ＡＴＵ／ｍｌ培养液；初步的纯化研究得到了具抗凝生物活性的ｒＨＶ１纯品，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。结论：重组水蛭素变异物１的活性表达及其分离纯化研究填补了国内空白，为研制国产高效重组抗凝药物带来希望。     

铁调素的表达与调节机制

背景:细胞铁的外向转运是由铁调素调节的.铁调素的表达受机体信号因子的影响,如血清铁水平、促红细胞生成素、炎症、低氧、氧化应激等.这些刺激通过肝实质细胞表面的组织相容性Ⅰ型跨膜糖蛋白HFE,转铁蛋白受体1,2,铁调素调节蛋白激活各种信号通路,包括BMP-SMAD、JAK-STAT和HIF1通路,进而改变铁调素基因的转录,调节铁调素的表达水平,但调节铁调素表达的分子机制还不明确.目的:从影响铁调素表达的信号因子及信号通路两方面入手,总结并分析铁调素表达的调节机制.方法:由第一作者通过计算机检索NCBI和SpringerLink(2000/2010)英文数据库,检索词为"Hepcidin,Hemochromatosis,Hemoiuvelin,BMP signaling pathway,HFE,TfR1,TfR2".分别从影响铁调素表达的信号因子及参与其表达调控的信号通路两方面进行总结,介绍近年来在铁调素表达调控机制方面的最新研究进展.结果与结论:共检索到210篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入37篇文章.结果表明铁调素的表达受机体信号因子的影响,如肝实质细胞表面的遗传性血色素沉着症侯选基因、转铁蛋白受体1,2等,可通过激活各种信号通路,包括BMP-SMAD,JAK-STAT和HIF1通路,进而改变铁调素基因的转录,并调节其表达.     

Cyclin D1在颅脑胶质瘤中表达及细胞周期表达模式的研究

目的 研究颅脑胶质瘤中cyclin D 1的表达和细胞周期表达模式,探讨其与胶质瘤恶性程度的关系,并从生物学功能上探讨CyclinD 1在胶质瘤细胞周期演进中的作用. 方法 采用免疫组化法检测52例胶质瘤标本中cyclin D 1的表达,观察其与胶质瘤恶性程度之间的关系;利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化,确定CyclinD 1在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中的细胞周期表达分布模式. 结果 Cyclin D 1的表达随病理等级的递增而增高,高恶性度组阳性率和标记指数明显高于低恶性度组（P〈0.05）.在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中,CyclinD 1的表达呈细胞周期依赖性. 结论 cyclin D 1在人脑胶质瘤细胞中过度表达,同肿瘤的发生、发展有密切联系;在SHG-44和BT-325胶质瘤细胞中CyclinD 1的表达呈细胞周期依赖性.