PTHrP基因靶向RNA干扰重组表达质粒的构建鉴定以及在HTB-94细胞中的功能检测

目的构建针对目的基因PTHrp的pSilencer3.1-H1neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒,并在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中观察其干扰效果。方法设计并合成针对PTHrP基因编码区的含有发卡结构的互补的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定。结果双酶切证实PTHrP siRNA表达质粒克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,同时干扰了PTHrP基因的mRNA和蛋白的表达。结论成功构建的靶向RNA干扰重组表达质粒,可以通过小RNA序列干扰靶向基因的mRNA转录,降低靶向基因在细胞中mRNA和蛋白的表达。     

人RhoC基因正、反义真核表达载体的构建及对肿瘤增殖的影响

目的构建人RhoC基因正、反义真核表达载体，研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株增殖的影响。方法应用分子克隆技术，用KpnⅠ和BamHⅠ双限制性内切酶从RhoC基因切下所需目的片段，然后将该片段正、反向定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1／Hyg（＋）上，构建正、反义RhoC cDNA真核表达载体，以脂质体转染人胆管癌QBC939细胞，检测细胞生长曲线。结果经测序鉴定，将正、反义目的片段成功的连接到pcDNA3.1／Hyg（＋）载体上。结果序列测定证实RhoC基因正、反义.真核表达载体成功构建，反义RhoC基因抑制QBC939细胞增殖，正义RhoC基因促进QBC939细胞增殖。结论成功地将RhoC目的片段正、反向插入到pcDNA3．1／Hyg（＋）中，构建了人RhoC正、反义表达真核载体，RhoC基因调控QBC939细胞增殖。     

Sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨骺干细胞

[目的] 从永生化骨骺干细胞中克隆Sox9基因并构建真核表达载体,并探讨Sox9诱导骨髓基质细胞向骨骺干细胞分化的可能性.[方法]以RT-PCR方法获得Sox9全长,插入pGEM-T Easy克隆载体中,测序正确后与pEGFP-IRES2表达载体酶切后连接,复合质粒以脂质体法转染骨髓基质细胞,观察转染效率,Sox9和 FGFR-3的表达.流式细胞术鉴定细胞表型,MTT法检测细胞增殖活性.[结果]成功的完成了Sox9的扩增和表达载体的构建 ,重组载体转染骨髓基质细胞后能检测到Sox9、FGFR-3的表达,增殖活性与骨骺干细胞无异.[结论]成功构建了Sox9真核表达载体,其能诱导骨髓基质细胞分化为骨骺干细胞并具有其特性.     

靶向Notchl基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向Notchl基因的siRNA真核表达载体.方法:根据Notchl基因cDNA序列,设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列,将其插入U6启动子下游,克隆到真核表达载体pGsensil中,并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定.采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中,荧光下观测转染效率.RT-PCR检测Notchl基因mRNA在转染前后的表达.结果:转染48 h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notchl mRNA的表达.酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确.结论:成功构建的靶向Notchl的siRNA真核表达载体,具有抑制Notchl基因mRNA表达的功能,可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向.     

胆囊癌hTR锤头状核酶基因真核表达载体的构建

目的 用反转录PCR法，调取胆囊癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因，并针对其序列设计锤头状核酶切割基因序列，并将其构建入真核表达载体pTriEx-4内。方法 根据hTR cDNA序列．设计引物，经RT-PCR法从体外培养的胆囊癌细胞内调取hTR模板区基因，根据其测序结果，合成锤头状核酶基因，与经相应酶切的真核表达载体连接，酶切鉴定重组体的正确性。结果 经RT-PCR从细胞内调出68bp序列，与hTR cDNA比较，与模板区域碱基序列一致。核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。结论 RT-PCR法可调出胆囊癌hTR基因有效片段；成功构建了针对hTR模板区的核酶基因的真核表达载体，为胆囊癌的基因治疗奠定了基础。     

BMP2和TGFβ3双基因真核表达载体的构建

[目的]构建骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体.[方法]从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以pGEMT/BMP2和反转录的cDNA为模板,PCR扩增出BMP2和TGFβ3两个基因全长,将两个基因片段分别定向连入双基因真核表达载体pIRES;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定.[结果]酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确.[结论]成功构建pIRESBMP2/TGFβ3双基因真核表达载体.     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

与基底细胞癌细胞凋亡相关的分子生物学研究--促凋亡分子Bad的克隆及其pEGFP-C3真核表达载体的构建

目的:克隆Bcl-2相关凋亡基因Bad并构建其真核表达载体,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:采用RT-PCR的方法,扩增Bad基因全长片段。通过基因定向克隆,构建Bad基因的真核表达质粒载体。结果:经酶切鉴定、PCR及DNA序列测定鉴定,Bad基因表达质粒pEGFP-C3载体成功构建。结论:成功克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad并构建其真核表达载体pEGFP-C3-Bad,为进一步研究Bad在人肿瘤细胞系中的促凋亡作用奠定了实验基础。     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.     

靶向Notch1基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定靶向Notch1基因的siRNA真核表达载体。方法：根据Notch1基因cDNA序列，设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中，荧光下观测转染效率。RT-PCR检测Notch1基因mRNA在转染前后的表达。结果：转染48h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notch1 mRNA的表达。酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论：成功构建的靶向Notch1的siRNA真核表达载体，具有抑制Notch1基因mRNA表达的功能，可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

重组质粒pEGFP-N2-GPC3的构建及GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进细胞增殖的影响

目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片段.应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过C418(600 mg/L)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用噻唑蓝(MTT)比色法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响.结果 限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组比较差异有统计学意义(P<0.05),IGF2实验组与空质粒转染组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用.     

PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 分析PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞HepG2的杀伤作用并探讨其可能的机制.方法 利用重组PCR定点诱变法制备融合基因PNP-CD.将PNP-CD插入真核表达载体pcDNA3.0中,构建融合自杀基因表达载体pcDNA3.0/PNP-CD.经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染pcDNA3.0/PNP-CD的抗性细胞克隆.用RT-PCR和Western Blotting法检测PNP-CD基因在HepG2细胞中的表达.用台盼蓝排斥法检测细胞生长曲线,用MTT法检测细胞细胞克隆对相应前药敏感性及所导致的旁观者效应.结果 融合基因片段PNP-CD正确插入了pcDNA3.0中,pcDNA3.0/PNP-CD在HepG2细胞中实现了表达.细胞抗性克隆对特定的前药高度敏感.在两种前药联合作用下,pcDNA3.0/PNP-CD所致旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药所致旁观者效应.结论 具有双自杀基因功能的PNP-CD融合基因系统是肝癌基因治疗中一种高效治疗载体,对肝癌细胞有着良好的杀伤作用.     

人TRPC1基因真核表达载体的构建及肝细胞表达

目的 构建人TRPC1基因真核表达载体,并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法 提取细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)得到TRPC1基因的编码序列,经纯化回收后克隆入表达载体pGM-T中,酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,最后转染HL-7702细胞,通过电泳和噻唑蓝(MTY)比色法检测基因表达与细胞生长.结果 扩增片段长度为455 bp,重组质粒pGM-T-TRPC1经酶切鉴定条带位置正确,证明表达载体成功构建.电泳结果显示转染重组质粒后的HL-7702细胞表达TRPC1增强.MTF检测发现转染前后肝细胞生长未受到明显影响(t值分别为0.43、-0.40、-2.01、-1.60、-0.41和-0.72,P值均0.05).结论 成功构建人TRPC1基因的真核表达载体pGM-T-TRPC1,并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达.     

沉默RANK真核表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的构建沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK,筛选沉默RANK的最佳干扰序列。方法针对小鼠RANK基因设计并合成3对干扰序列,将其连接到真核表达载体pSuper上,酶切及测序鉴定正确后命名为pSuper-shRANK,后将其用脂质体瞬时转染小鼠骨髓巨噬细胞,用荧光显微镜观察转染情况,用Real-timePCR和Westernblot分析干扰效率。结果酶切分析与测序结果表明重组载体pSuper-shRANK构建成功,脂质体共转染后,Real-timePCR和Western blot分析结果显示shRANK-3干扰效果最好,干扰效率达88.7%,筛选出shRANK-3为最佳干扰序列。结论成功构建了沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK;筛选出了沉默小鼠RANK的最佳干扰序列,为研究抑制该基因在破骨细胞分化及活化作用机制中奠定了基础。     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

可体内、外示踪的BMP2真核表达载体的构建和表达

目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法获得BMP2片段,将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.将质粒转染CHO细胞后Western Blot检测BMP2蛋白表达,用RT-PCR检测BMP2mRNA表达.结果 琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216 bp的带,重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切可得到约1216 bp的片段,测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符,重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48～72 h后荧光显微镜下证实转染成功,经RT-PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达,采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白.经Western Blotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白,相对分子质量在17×103左右.结论 成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体.     

人β神经生长因子基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人NGF-β基因真核表达载体并观察其在子鼠脊髓神经干细胞内的表达.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人脑肿瘤旁组织总RNA中扩增出750 bp片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3中经酶切鉴定产生750 bp和5.2 kd)的片段,完成序列分析.分离培养E14子鼠脊髓神经干细胞,以非脂质体转染试剂FuGENE HD介导质粒peDNA3-hNGFb转染培养第3代的细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的片段,重组质粒peDNA3-hNGFb经双酶切产生750 bp和5.2kd)的片段,测序结果与文献报道结果完全一致.免疫细胞化学、Western blot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达.结论 成功构建了peDNA3-hNGFb真核表达载体,其转染的子鼠脊髓神经干细胞能正确表达NGF-β.