聚(丙交酯-co-乙交酯)仿生基质材料的制备

目的　将能与细胞表面整合素受体特异性结合的多肽共价结合于改性聚 (丙交酯 co 乙交酯 ) (PLGA)材料上 ,以提高材料对骨组织工程种子细胞的黏附能力。方法　用固相合成法合成 [K] 16 GRGDSPC多肽并鉴定 ;取 1g/L多肽溶液与已用交联剂预处理的改性PLGA材料室温下反应 ,用X射线光电子光谱法 (XPS)表征。结果　PLGA改性后引入了含活性基团的氨基酸序列 ,所合成的多肽序列为 [K] 16 GRGDSPC ,纯度达 95 %以上 ;XPS检测表明多肽成功地固定于PLGA多孔基质材料上。结论　在PLGA基质材料上固定 [K] 16 GRGDSPC多肽 ,为实现对骨组织工程种子细胞的高效黏附奠定了基础。     

同种异体骨共价枝接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽对成骨细胞黏附和增殖的影响

目的观察同种异体骨共价枝接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）多肽对大鼠成骨细胞黏附和增殖的影响。方法以RGD多肽在同种异体骨片表面进行共价枝接反应,用X线光电子能谱分析仪（XPS）进行表面分析,以大鼠成骨细胞在骨片表面进行组织培养,MTY法及细胞计数法评价成骨细胞的黏附效力及增殖活性,通过相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态及增殖情况。结果以碳二亚胺（EDC）为交联剂能够将RGD多肽有效固定于同种异体骨片表面,成骨细胞在同种异体骨片表面培养4h、加h后,实验组细胞黏附效力（0．322±0．014、0．447±0．030）均明显强于对照组（0．240±0．012、0．337±0．048）,培养4d、6d、8d后,实验组成骨细胞增殖情况（0．510±0．054、0．612±0．075、0．629±0．098）亦强于对照组（0．405±0．054、0．340±0．030、0．339±0．018）。结论RGD多肽共价修饰同种异体骨能够有效促进成骨细胞的黏附和增殖。     

新型仿生活性人工骨诱导兔腰椎横突间脊柱融合研究

目的采用先进快速成形技术（RP）结合骨组织工程方法研制新型仿生活性人工骨，并探讨其在兔腰椎横突间脊柱融合的应用情况。方法首先采用RP制备薄块型聚乳酸一聚羟乙酸／磷酸三钙（PLGA／TCP）人工骨载体，进而高效复合牛骨形态发生蛋白（bBMP）以制备仿生活性人工骨。扫描电镜观察载体材料及人工骨超微结构。将健康新西兰兔28只（平均体重4.1kg）随机均分为A、B两组（每组14只）。A组：于兔腰4～5右、左侧横突间分别植入仿生活性人工骨（A1组）、自体髂骨（A2组）；B组：于兔腰4～5右、左侧横突间分别植入复合自体新鲜红骨髓的PLGA／TCP载体材料（B1组）、单纯PLGA／TCP载体材料（B2组）。于术后6周和12周，定期大体观察、手法检测、组织学[苏木素-伊红（HE）、三色法及四环素-钙黄绿素荧光检测]和影像学方法（X、CT）系统评价脊柱融合情况。结果RP制备的PLGA／TCP载体具有规则的空间支架结构、相互贯通的孔隙及材料表面微孔特征。这些均有利于bBMP的高效复合。动物实验结果显示，A1组仿生活性人工骨植入具有强的诱骨活性及骨性融合能力，不仅成骨早、新骨形成量大，而且在新骨形成及改塑的同时载体材料逐渐降解。术后12周可形成较为典型的骨小梁及骨髓结构，骨代谢活性亦接近正常。A2组自体髂骨移植能达到良好骨性融合，但术后12周所形成的新骨结构尚须进一步塑形及完善。B1组、B2组术后12周仍遗有较多的载体材料有待降解，基本无成骨能力。术后12周，A1、A2、B1、1324组横突间融合率分别为100．0％、58．3％、18．2％和0％，A1组融合率最高（P〈0．01）。结论先进RP制备的PLGA／TCP载体不仅具有良好的空间超微结构及孔隙特性，而且能高效复合bBMP以正确构建新型组织工程人工骨。该仿生活性人工骨诱导兔横突间脊柱融合获得成功．为生物制造脊柱外科所需的新型、高效人工骨移植材料奠定了重要基础。     

转化生长因子-β基因转染骨髓基质干细胞在多肽修饰的聚乳酸-羟基乙酸上生长情况的研究

目的 探讨转转化生长因子-β(TGF-β)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)材料上的增殖、黏附、分化情况,以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用. 方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,把TGF-β基因转入BMSCs,以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照,分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上,培养1、2、3 d后,计数细胞密度以反映细胞增殖情况:接种后4、12 h,沉淀法定量检测黏附的细胞数;培养24 h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,观察细胞骨架的组织情况;用成骨性培养基培养7、14、21 d,检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性来了解BMSCs分化情况. 结果转TGF-β基因细胞密度显著增大,且在各时间点有较高的ALP活性.RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高,并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架,且在第14天时表现出高的ALP活性.结论 TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上,并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化.     

类骨磷灰石涂覆改性聚(乙交酯/丙交酯)的细胞亲和性研究

目的 研究具有类骨磷灰石涂层的聚(乙交酯/丙交酯)[Poly(L-lactide-co-glycolide),PLGA]材料作为骨组织工程细胞支架材料的可行性.方法 采用氧等离子体预处理结合模拟体液1.5 SBF0孵育的方法对PLGA进行类骨磷灰石涂覆改性.用鼠OCT-1类成骨细胞作为种子细胞进行体外培养和扩增后分别种植于PLGA致密膜和多孔支架上,观察细胞在致密膜和多孔支架上的黏附率、黏附形态、增殖活力和生长形态.结果 经类骨磷灰石涂覆改性的PLGA,其表面OCT-1类成骨细胞的黏附率和增殖活力都得到了提高,细胞的黏附形态和生长形态良好;在多孔支架上培养的细胞能够迁移到支架的内部旺盛生长.结论 具有类骨磷灰石涂层的PLGA具有更高的细胞亲和性,可望成为一类新的骨组织工程细胞支架材料.     

大段仿生活性人工骨修复兔长骨缺损的实验研究

目的观察以聚左旋乳酸、磷酸三钙、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)制备的大段仿生活性人工骨对骨缺损的修复效果。方法利用快速成形技术制备多孔状的聚左旋乳酸-磷酸三钙大段人工骨载体材料,负压复合rhBMP-2后制备成大段仿生活性人工骨。将36只新西兰大白兔随机等分为三组,手术造成右前臂桡骨中上段15mm骨缺损。实验组植入15mm仿生活性人工骨,对照组a为材料对照,对照组b为空白对照。通过影像学、组织学、骨密度检查及图像分析技术观察骨缺损的修复效果及材料的降解情况。结果①影像学结果表明,实验组术后12周新生骨痂将缺损修复,修复率100%,术后24周骨痂塑形良好。两对照组术后24周内均无骨痂形成,缺损未修复。②组织学显示:实验组术后12周骨痂外层为皮质骨,中央为含有骨岛的载体材料,术后24周骨痂皮质骨与材料之间形成贯通的髓腔;材料对照组术后12周缺损区为纤维组织包裹的载体材料,空白对照组形成纤维连接。③实验组术后12、24周的骨密度值分别为正常值的70.6%和96.8%。④术后12周实验组和材料对照组的降解率分别是38.3%和31.4%,术后24周分别为54.2%和43.4%。结论以聚左旋乳酸、磷酸三钙和rhBMP-2制备的大段仿生活性人工骨对骨缺损具有良好的修复作用。     

骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活件多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响. 方法制备重组胶原矿化骨支架材料,将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;取第3代BMSCs接种到材料上,以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照,采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖;沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率;扣描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态;通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量,观察BMSCs在材料表面的分化情况. 结果扫描电镜结果显示:支架材料旱多孔状;X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面;BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性,经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料.     

仿生矿化对PLGA支架材料孔隙率及生物力学性能的影响

目的通过聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide,PLGA)的仿生矿化,对材料表面改性,检测矿化物组成,评价矿化对多孔材料孔隙率和生物力学性能的影响。方法PLGA经水解处理后在模拟体液(simulatedbodyfluid,SBF)中仿生矿化,应用扫描电镜、X射线衍射仪和红外光谱仪行矿化物形貌物相分析,比重法测量矿化前后材料孔隙率的变化,津岛生物力学测试仪测试材料矿化前后抗压强度的变化。结果PLGA在SBF中矿化后,表面可以形成明显的矿化层;矿化物主要成分为磷灰石,含有碳酸根成分,类似于人骨无机质。仿生矿化前后多孔PLGA孔隙率及生物力学性能无明显改变(P>0.05)。结论仿生矿化对三维多孔PLGA支架材料的孔隙表征和生物力学性能无影响,是表面改性的可行方法。     

青蒿琥酯诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的实验研究

目的探讨青蒿琥酯（artesunate，Art）诱导皮肤瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及机制。方法取自愿捐献的人耳垂增生性瘢痕，采用组织块贴壁法进行细胞培养。经免疫组织化学染色鉴定后，取第3～5代成纤维细胞，采用含60、120和240mg／LArt培养液各5ml培养作为实验组，仅加入等量的培养液作为对照组。于倒置显微镜及透射电镜观察，采用流式细胞仪观察细胞凋亡及细胞周期。另取第3～5代成纤维细胞，实验组采用30、60和120mg／LArt培养液，对照组仅加入等量的培养液，观察细胞内钙离子的变化。结果原代成纤维细胞呈典型的梭形贴壁生长，免疫组织化学鉴定细胞波形蛋白呈阳性表达；倒置显微镜下观察Art在60～240mg／L浓度范围内抑制成纤维细胞生长且呈剂量及时间依赖性，细胞出现凋亡征象；透射电镜观察，各实验组出现染色质浓缩，沿着核膜排列，甚至核碎裂现象。细胞周期分析显示各实验组与对照组比较，凋亡细胞比例、处于G0～G1、S、G2～M期细胞数差异均有统计学意义（P〈0．05），实验组均出现典型的凋亡峰，且随药物浓度增加，峰值越大。Art在30～120mg／L作用成纤维细胞24h可引起细胞内钙离子浓度持续增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Art通过作用于成纤维细胞周期诱导细胞凋亡，细胞内钙离子浓度升高可能是其诱导成纤维细胞凋亡的机制之一。     

骨髓基质干细胞与聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸/聚乙二醇体外复合培养的实验研究

目的探讨骨髓基质于细胞（marrow stromal stem cells，MSCs）与聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇[poly（lactic acid／glycolic acid／asparagic acid—co—polyethylene glycol），PLGA—ASP—PEG]的生物相容性，为构建组织工程骨进行骨缺损修复提供理论基础，以及为组织工程支架材料的优化提供实验依据。方法本体开环共聚法合成PLGA—ASP—PEG三嵌段共聚物。取4周龄新西兰大白兔骨髓，体外分离培养MSCs。将第3代MSCs以1．0×10^6／ml接种到PLGA—ASP—PEG材料上，测定细胞黏附力和黏附率；扫描电镜观察细胞的形态学特征；MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞周期、增殖指数、DNA指数及凋亡；通过考马斯亮蓝测定法和^3H-脯氨酸掺入实验观察细胞的蛋白合成和胶原合成情况。以PLGA支架材料作为对照。结果MSCs在PLGA—ASP—PEG支架材料上贴附、生长良好，其黏附、增殖和蛋白、胶原合成能力均显著高于PLGA组（P〈0.05），细胞凋亡率显著低于PLGA组（P〈0.05）。DNA指数显示两组细胞均为正常的二倍体细胞。结论PLGA—ASP—PEG的生物学性能与PLGA相比得到显著改善和提高，可作为MSCs的理想载体构建组织工程骨进行骨缺损修复研究。     

组织工程关节软骨梯度仿生支架的研究进展

由于良好的机械性能和生物相容性,组织工程支架已经成为修复和再生关节软骨缺损的重要方法。随着组织工程技术的不断发展,过去十年已经开发和测试了许多支架的制备和形成方法,但是理想再生支架的制备一直存在争议。关节软骨作为人体关节内的承重组织,其基质结构和细胞组成呈带状,并且从软骨表层至软骨下骨存在着几个平滑的自然梯度,包括细胞表型和数量、特异性的生长因子、基质的组成、纤维的排列、力学性能、营养和氧气的消耗量等均有较为明显的不同。因此,在再生支架的设计中有必要通过重现这些梯度来原位再生关节软骨。最近的文献报道已经有许多新型的梯度仿生支架用于模拟天然关节软骨的自然梯度,这些支架在结构上呈现出不同的机械、物理、化学或者生物梯度,并且取得了不错的修复效果。通过检索关于梯度支架治疗关节软骨缺损的相关文献,首先对天然关节软骨组织的结构、生物化学、生物力学、营养代谢等梯度特性进行研究和总结,然后对目前关节软骨梯度支架的最新设计和构建进行了归类,其次从材料构成(如水凝胶、纳米材料等)以及制备工艺(如静电纺丝、3D打印等)进一步加深对梯度支架的认识,最后讨论了梯度仿生支架在软骨原位组织工程技术中的前景和挑战,为梯度支架成功用于临床转化提供理论基础。     

纤维蛋白用做骨组织工程载体并修复骨缺损

[目的]研究将纤维蛋白用做骨组织工程的载体材料。[方法]将兔骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外大量培养扩增后，与同种兔纤维蛋白制成凝胶复合物，对复合物进行成骨性诱导培养，观察细胞增殖与分化情况。进而将含自体BMSCs的复合物填充于兔桡骨节段性缺损区，观察其对骨缺损的修复效果。[结果]BMSCs与纤维蛋白复合物在体外培养条件下可保持完整形状、细胞大量增殖，并发生成骨性分化和分泌钙盐。植入复合物的骨缺损区修复效果显著优于植入单纯纤维蛋白。[结论]纤维蛋白可为BMSCs提供良好的增殖与分化环境，二者复合物可用于组织工程法修复骨缺损。     

Effects of acetylsalicylic acid on intramuscular bone matrix implants and composite grafts in rats

Antigen-extracted, autolyzed, demineralized bone matrix and bone matrix combined with isogeneic bone marrow (i.e., a composite graft) were placed in the musculature of young male rats. The influence of acetylsalicylic acid (ASA) on the osteogenic potential of these bone-inducing materials was studied during an 18-day period. ASA (150 mg/kg/12 h) was used to obtain anti-inflammatory serum levels comparable with those in humans. Resorption of the implanted matrix and new formation of bone were quantified using collagen- and mineral-tracing radioisotopes and collagen and calcium analyses. The matrix implants showed a slow tissue turnover and produced only small amounts of new bone, with no significant differences between ASA-treated and control rats. However, during the last 24 h of the study the ASA-treated implants had a significantly hampered rate of new bone formation. The tissue turnover and new bone yield, as well as the rate of new bone formation, increased in the control composite grafts but not in the ASA-treated composite grafts. Thus, the results indicate an inhibitory effect of ASA on the bone-forming capacity of bone marrow.     

仿生电活性涂层钛植入材料促进骨结合的实验研究

目的评价仿生电活性钛酸钡(BaTiO3,BTO)/聚偏氟乙烯-三氟乙烯P(VDF-TrFE)涂层钛植入材料促进骨结合性能的效果。方法首先将直径为2 mm、长度为5 mm的医用纯钛圆柱进行表面喷砂-酸蚀处理,然后将BaTiO3/P(VDF-TrFE)溶液均匀涂覆在钛柱表面。待烘干后对涂层表面进行电晕极化处理。采用扫描电镜、能谱分析、原子力显微镜、水接触角测量仪分别对材料表面形貌、元素组成、表面粗糙度和亲疏水性进行表征检测,PLLA涂层钛柱作为对照材料。选取实验兔4只,在双侧胫骨位置各制备3个间隔为1 cm的圆形缺损,在左侧胫骨植入PLLA涂层钛柱,右侧胫骨植入仿生电活性涂层钛柱,术后4周和12周分别取材进行硬组织的骨形态检测分析。采用SPSS15.0软件对数据进行统计分析。结果理化性能表征检测显示,BaTiO3/P(VDF-TrFE)涂层和PLLA涂层均匀附着在钛柱表面,涂层厚度约50μm,且表面结构致密。电活性涂层可见钛酸钡纳米颗粒均匀分布在P(VDF-TrFE)基体内。两种涂层表面的粗糙度和水接触角无明显差异。电活性涂层具有稳定的压电性能,且压电常数接近生理量级。动物实验显示,术后4周,仿生电活性涂层材料表面和新骨结合紧密,涂层材料稳定无降解;而PLLA涂层材料表面由于材料有部分降解导致新骨结合较差,电活性涂层的骨结合率明显高于PLLA涂层。术后12周,两组的新骨成熟程度均增加,骨陷窝明显,仿生电活性涂层仍然保持稳定状态;而PLLA涂层进一步发生降解,和新骨结合程度弱于电活性涂层组。结论仿生电活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)涂层钛可能作为一种具有促进骨整合功能的种植体涂层材料。     

Bioactive porous titanium: an alternative to surgical implants

Abstract:  Porous titanium implants have been used to improve implant–bone attachment by the ingrowth of bone tissue within the porous structure. Despite the efficient bone adhesion of porous titanium implants, chemical bonds are required at bone–implant interface. These implants can become bioactive by a biomimetic precipitation process. The aim of this work was to enhance the bioactivity of pure porous titanium implants by biomimetic process. The samples immersed in a simulated body fluid promoted the nucleation and growth of calcium phosphate (Ca-P) crystals, such as hydroxyapatite (Hap), on the material surface. Scanning electron microscopy, energy dispersive spectroscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy analyses revealed that a Ca-P deposition occurred without the need of pretreatments to improve the surface bioactivity. This present study indicates the potential for growing a bone-like Hap layer on porous titanium implants by biomimetic processes.     

骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复山羊胫骨缺损的影像学研究

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨-骨膜缺损,以及修复负重骨缺损的可行性. 方法将18只12月龄健康杂种青山羊(雌雄不限),制备成双侧胫骨中段20 mm骨-骨膜缺损模型,常规钢板螺钉固定;MSCs与生物衍生骨于体外复合培养;对同一只山羊将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组,以单纯材料植入左侧胫骨缺损处作为对照组,空白组不植入任何材料;在8、12、16和24周各时间点分别行标本的大体观察、X线片观察和骨密度测试,比较其修复骨缺损的能力. 结果大体观察、X线片和骨密度测试显示:实验组8周骨缺损部分修复,12、16周骨缺损完全修复,8、12和16周其骨密度较对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05);24周实验组与对照组骨密度差异无统计学意义;空白组骨缺损未修复. 结论组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,且较单纯材料成骨量大、迅速,能够对负重骨缺损进行有效的修复.     

The potential of biomimesis in bone tissue engineering: lessons from the design and synthesis of invertebrate skeletons

Synthetic bone replacement materials are now widely used in orthopedics. However, to date, replication of trabecular bone structure and mechanical competence has proved elusive. Maximization of bone tissue attachment to replacement materials requires a highly organized porous structure for tissue integration and a template for assembly, combined with structural properties analogous to living bone. Natural structural biomaterials provide an abundant source of novel bone replacements. Animal skeletons have been designed through optimization by natural selection to physically support and physiologically maintain diverse tissue types encompassing a variety of functions. These skeletons possess structural properties that provide support for the complete reconstruction and regeneration of ectodermal, mesodermal, and bone tissues derived from animal and human and are thus suited to a diversity of tissue engineering applications. Increased understanding of biomineralization has initiated developments in biomimetic synthesis with the generation of synthetic biomimetic materials fabricated according to biological principles and processes of self-assembly and self-organization. The synthesis of complex inorganic forms, which mimic natural structures, offers exciting avenues for the chemical construction of macrostructures and a new generation of biologically and structurally related bone analogs for tissue engineering.     

Electrospun scaffolds for bone tissue engineering

Tissue engineering aims to regenerate native tissues and will represent the alternative choice of standard surgery for different kind of tissue damages. The fundamental basis of tissue engineering is the appropriate selection of scaffolds and their morphological, mechanical, chemical, and biomimetic properties, closely related to cell lines that will be seeded therein. The aim of this review is to summarize and report the innovative scientific contributions published in the field of orthopedic tissue engineering, in particular about bone tissue engineering. We have focused our attention on the electrospinning technique, as a scaffold fabrication method. Electrospun materials are being evaluated as scaffolds for bone tissue engineering, and the results of all these studies clearly indicate that they represent suitable potential substrates for cell-based technologies.