鼠成骨细胞诱导兔BMSCs成骨的实验观察

目的观察乳鼠成骨细胞诱导乳兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨情况。方法取SD大鼠乳鼠颅盖骨,采用组织块培养法培养成骨细胞;取乳兔长骨,采用全骨髓培养法培养BMSCs;用Transwell双层细胞培养板共育,实验组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室不接种细胞,两组培养下室均接种BMSCs。观察BMSCs形态变化,用酶标仪检测诱导分化后BMSCs的ALP活性,RT—PCR检测BMSCs中的骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Ⅰ型胶原基因。结果共培养后实验组BMSCs形态逐渐向成骨样细胞转化,对照组无明显变化;实验组BMSCs中ALP活性高于对照组,实验组的BMSCs的骨钙素、BMP-2、Ⅰ型胶原基因有所表达,对照组无表达。结论乳鼠成骨能够诱导乳兔BMSCs向成骨细胞分化。     

Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞

目的建立科学有效的大鼠成骨细胞体外培养模式,建立成熟合理的体外培养大鼠成骨细胞鉴定程序。方法采用I型胶原酶阶段消化法来消化新生大鼠乳鼠颅骨,来获得成骨细胞进行体外培养、扩增和鉴定。通过绘制成骨细胞生长曲线,倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,基质钙结节形成观察;进行钙-钴法碱性磷酸酶(ALP)染色;I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。结果Ⅰ型胶原酶改良阶段消化法获得的大鼠成骨细胞纯度较高,增殖较快;ALP染色可见体外培养成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒;免疫组化法检测I型胶原可见成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色,显微镜计数阳性细胞比例为87.3%;体外培养超过3w的成骨细胞可见基质钙结节形成。结论Ⅰ型胶原酶阶段消化法原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。     

高铁环境对成骨细胞生物活性的影响

目的探讨高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)活性指标的影响。方法采用细胞贴壁法培养成骨细胞(hFOB1.19)后,将不同浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基,用MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;Vonkossa染色法行钙结节染色;用RT-PCR和Western blotting分别检测Ⅰ型胶原(COL1)的基因及蛋白表达变化。结果用不同浓度枸橼酸铁铵干预成骨细胞后,与对照组相比,48 h与72 h组成骨细胞增生活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P0.05);48 h组成骨细胞凋亡率呈浓度依赖性升高,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);不同浓度枸橼酸铁铵干预10 d和14 d时各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随枸橼酸铁铵浓度增高而降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,枸橼酸铁铵干预17 d后钙结节染色结果显示,矿化面积和钙结节形成随铁离子浓度增加而减少;枸橼酸铁铵干预3 d后呈剂量依赖性下调Ⅰ型胶原基因和蛋白的表达。结论高铁环境使成骨细胞成骨活性指标均受到抑制。     

氟中毒动物模型胶原免疫组化及Ⅰ胶原MRNA的测定

目的通过研究氟中毒动物模型骨Ⅰ型胶原免疫组化及Ⅰ型胶原MRNA的影响,为预防和治疗氟骨症提供基础理论。方法对正常与模型组大鼠股骨以图像分析系统观察Ⅰ型胶原免疫组化及Ⅰ型胶原MRNA原位杂交检测。结果得出了各组试样的阳性染色分别面积、平均灰度值、阳性反应面积等指标。结论模型组各项指标显著低于正常对照组（P〈0.05）,氟中毒动物模型胶原免疫组化及Ⅰ型胶原MRNA指标发生改变。     

诱导型环氧合酶高表达增加兔主动脉粥样硬化斑块易损性

目的:探讨诱导型环氧合酶（COX-2）在兔主动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)组织中的表达及其与斑块易损性之间的关系。方法: 以高脂饲料喂养建立兔主AS模型,并与正常饲料组对照。喂养12周后,取兔主动脉标本,行HE及免疫组化染色,观察COX-2、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型和Ⅲ型胶原在AS斑块组织中的表达。结果: COX-2仅见于AS斑块,正常动脉壁无表达。AS组COX-2免疫组化染色强度均显著高于正常对照组（P<0.05）。AS组Ⅰ、Ⅲ型胶原和MMP-2免疫组化染色强度均显著高于正常对照组（P<0.05）,Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例增加。结论: COX-2在兔主动脉AS斑块中的高表达可能增加斑块的易损性。     

秋水仙碱对血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏Ⅰ,Ⅲ,Ⅵ型胶 …

目的 阐明秋水仙碱因吸虫病肝纤维化小鼠肝脏胶原蛋白表达的影响。方法 应用免疫组化技术,观察血吸虫病肝纤维化小鼠在秋水仙碱治疗前后肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白的分布及含量（半定量）变化。结果 秋水仙碱治疗组小鼠与对照组相比,肝内Ⅰ型胶原蛋白无显著变化,而肝内Ⅲ型和Ⅵ型胶原蛋白的免疫组化染色均明显减弱。对胶原含量半定量分级亦显示两组Ⅰ型胶而肝内Ⅲ型和Ⅵ型胶原蛋白的免疫组化染色均明显减弱;对胶原含量半定量分     

丹参酮ⅡA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力的影响。方法扩增传代至第3代的SD大鼠BMSCs向成骨诱导分化培养,分为实验组和对照组,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;采用RT—PCR方法检测成骨相关细胞因子mRNA的表达;通过钙结节染色对比观察细胞形态情况。结果实验组各浓度TanⅡA较对照组BMSCs增殖速度提高（P〈0．05）,细胞增殖速率随TanⅡA浓度的增高而加快（P〈0．05）;实验组各浓度TanⅡA成骨相关细胞因子mRNA的表达较对照组提高（P〈0．05）;钙结节染色观察TanⅡA各浓度组均阳性显色,对照组显色不明显。结论TanⅡA能够提高体外培养的BMSCs增殖速率,对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用,缩短骨细胞的成熟时间。     

BMP信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMC,将其随机分为正常对照组、高磷组、华法林(10μmol/L)干预组及华法林(10μmol/L)+维生素K(10μmol/L)干预组。对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红染色检测钙结节,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达变化,RT-PCR检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad1及Runx2的表达变化。结果茜素红染色结果显示,与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组钙化结节明显增多;钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组ALP活性明显增加(P0.05),Runx2 mRNA和蛋白表达水平及BMP-2、Smad1 mRNA表达明显增高(P0.05);与华法林干预组相比,华法林+维生素K干预组细胞钙含量、ALP活性及BMP-2、Smad1、Runx2的表达均明显降低(P0.05)。结论BMP信号通路参与了华法林促进的大鼠VSMC钙化,其可能的作用机制是介导了VSMC的表型转化。     

肝苏对CCl4肝纤维化大鼠氧化应激和胶原表达的影响术

前期体外实验发现肝苏具有肝细胞保护、抗氧化、抗肝纤维化作用。目的：探讨肝苏对实验性大鼠肝纤维化的防治作用。方法：以四氯化碳（CCI。）诱导大鼠肝纤维化模型。63只Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为正常对照组（7只）、肝纤维化模型组（14只）、低剂量肝苏干预组（1g／kg,14只）、中剂量肝苏干预组（2g／kg,14只）、高剂量肝苏干预组（4g/kg,14只）。检测各组大鼠血清肝生化指标和透明质酸（HA）水平以及肝组织丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性．HE和Masson染色观察肝组织纤维化程度,免疫组化染色检测肝组织肝星状细胞（HSC）活化标记d．平滑肌肌动蛋白（0I-SMA）以及I型、Ⅲ型胶原含量。结果：大鼠肝纤维化模型建立成功。各剂量肝苏干预组血清AIJT、AST、ALP、HA水平较模型组不同程度地下降;肝组织MDA含量较模型组下降,高、中剂量组差异显著,但SOD活性无明显变化：肝组织纤维化程度较模型组改善．尤以高剂量组为著;肝组织a-SMA、I型、Ⅲ型胶原含量较模型组减少,前两者减少更为明显。结论：肝苏能减轻实验性大鼠肝纤维化的肝细胞损伤,降低肝组织MDA含量,抑制HSC活化和肝内胶原合成,具有抗氧化和抗纤维化作用。     

间充质干细胞移植对缺血/再灌注大鼠心肌胶原与去甲肾上腺素转运蛋白的影响

目的观察同种异体骨髓间充质干细胞（BMSCs）心肌内移植对60分钟缺血/再灌注心肌梗死（MI）模型大鼠左心室重塑及心肌去甲肾上腺素转运蛋白（NET）表达的影响,探讨BMSCs移植对心脏交感神经功能以及胶原重塑作用的可能机制。方法分离、原代培养Wistar大鼠BMSCs,建立缺血/再灌注MI模型,随机分为假手术对照组、MI组、BMSCs移植组。观察BMSCs移植后动物模型血流动力学指标,天狼猩红染色测定MI范围、面积以及扩展指数,结合偏振光分析MI区胶原容积分数和胶原成熟度;免疫组化检测NET表达。结果①BMSCs移植可缩小60min缺血/再灌注大鼠MI面积;②BMSCs移植可减轻心肌梗死动物左心室重塑;③BMSCs移植发挥细胞外基质抑制,心肌间质胶原含量、胶原容积分数下降,增加心肌NET表达。结论 BMSCs移植可改善MI后心室重塑、降低心肌胶原、增加心肌NET表达。     

淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中DKK1蛋白动态表达的影响

目的观察DKK1在淫羊藿总黄酮调控去势雌性大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化平衡过程中的动态表达,为进一步阐明淫羊藿总黄酮治疗绝经后骨质疏松症的作用机制提供实验依据。方法体外分离培养去势雌性大鼠来源骨髓间充质干细胞,分别在成骨诱导液和脂肪诱导液条件下连续培养15 d,并在此基础上添加剂量为10μg/mL的淫羊藿总黄酮。采用ALP染色、ALP活性测定、油红O染色以及荧光定量PCR技术,观察淫羊藿总黄酮对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响。用酶联免疫法(ELISA)检测淫羊藿总黄酮处理过程中DKK1蛋白的动态表达,观察DKK1蛋白在淫羊藿总黄酮调控去势雌性大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化平衡过程中的作用。结果淫羊藿总黄酮能显著增加骨髓间充质干细胞ALP的表达以及成骨早期分化因子Runx2 mRNA的表达,显著下调骨髓间充质干细胞中脂肪形成关键基因PPARγ-2mRNA的表达,从而抑制脂滴的形成。在成骨诱导条件下,EFs呈时间依赖性下调DKK1的表达;在脂肪诱导条件下,EFs呈时间依赖性抑制DKK1蛋白的上调。结论通过抑制DKK1蛋白的表达调控去势雌性大鼠BMSCs成骨和成脂分化平衡,可能是淫羊藿总黄酮治疗绝经后骨质疏松症的分子机制之一。     

骨形态发生蛋白微球对犬骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察骨形态发生蛋白微球对犬骨髓基质细胞（MSC）增殖及分化的影响。方法聚乳酸聚乙醇酸共聚物制备微球,采用细胞培养及组织化学等方法观察骨形态发生蛋白载药微球对犬MSC增殖、分化及Ⅰ型胶原表达的影响。结果骨形态发生蛋白微球对MSC的增殖无明显影响,但对细胞的分化功能及Ⅰ型胶原表达有明显的促进作用。结论骨形态发生蛋白能够提高MSC的体外成骨能力,且微球可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响

目的 研究重组人结缔组织生长因子(rCTGF)对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响.方法 用rCTGF干预体外培养的人成骨细胞,采用[3H]-TdR掺入法检测人成骨细胞增殖率,α-磷酸萘酚法测定细胞内碱性磷酸酶活性变化,放射免疫法测定骨钙素含量的变化,Western印迹法检测Ⅰ型胶原表达的变化,应用流式细胞仪检测rCTGF埘成骨细胞凋亡的影响.结果 rCTGF呈剂量依赖性促进人成骨细胞增殖,200 ng/ml rCTGF达最大效应;rCrrGF干预显著促进人成骨细胞分化,rCTGF旱剂量依赖性增加Ⅰ型胶原、骨钙素表达及碱件磷酸酶活性;rCTGF干预可显著减少成骨细胞凋亡.结论 rCTGF可显著促进人成骨细胞增殖、分化,并抑制人成骨细胞凋亡.     

丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的抑制作用

目的：探讨丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的作用及机制。方法：30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹参酮ⅡA组。结扎大鼠单侧输尿管建立肾间质纤维化动物模型。丹参酮ⅡA经腹腔注射，剂量为1．5mg／（kg·d）。术后第10天取梗阻侧肾组织作HE、Masson染色，观察肾间质病理改变。免疫组化法检测肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅰ型胶原的蛋白表达与定位。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测三者的mRNA水平。结果：模型组术后第10天梗阻侧出现明显的肾间质纤维化，肾组织TGF-β1、α—SMA和Ⅰ型胶原的蛋白及mRNA表达显著增加（P〈0．01）。丹参酮ⅡA组肾间质纤维化程度减轻，肾组织TGF-β1、α—sMA及Ⅰ型胶原表达下调（P〈0．05）。结论：丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化有明显的抑制作用，其机制可能与下调TGF-β1表达，抑制成纤维细胞增殖和表型转化，减少胶原沉积有关。     

1α，25-二羟维生素D3对成骨细胞增殖分化、Ⅰ型胶原及核心结合因子α-1基因表达的影响

目的研究1α,25-二羟维生素D3[1α,25-（OH）2D3]对体外培育SD大鼠成骨细胞（OB）增殖分化以及核心结合因子α-1（Cbfa-1）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA表达的影响。方法采用胰蛋白酶和胶原酶消化法从24h内新生SD乳鼠颅盖骨分离得到OB,设置0、1、10、100nmol／L1α,25-（OH）2D3干预组,干预24、48、72h后分别采用噻唑蓝比色法（MTT）检测OB增殖率,采用PNPP法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,采用逆转录-聚合酶链反应法检测细胞cbfa-1和ColImRNA表达。结果 在1α,25-（OH）2O3干预24、48h和72h后,与0nmol／L组比较,1nmol／L组吸光度（A值）均显著增加（P〈0．05）;1α,25-（OH）2D3干预细胞ALP活性、ColⅠ和Cbfa-1基因mRNA表达呈时间依赖性和剂量依赖性增高,且在24h、48h和72h,100nmol／L组与0nmol／L组比较,以上指标差异均显著性增高（P〈0．05）。结论低浓度1d,25-（OH）2D3可促进OB增殖和分化;高剂量对OB增殖无明显作用,但可促进OB分化,提高其ALP活性,增强ColⅠ及Cbfa-1基因mRNA表达而影响骨代谢。     

罗格列酮联合甘精胰岛素对骨髓基质细胞的影响

目的 观察胰岛素增敏剂罗格列酮联合甘精胰岛素对骨髓基质细胞成脂分化和脂质过氧化物体（PPAR-γ）基因表达水平的影响.方法 将大鼠骨髓基质细胞分离、传代培养后分组以不同浓度药物处理,在显微镜下观察细胞形态,用油红O染色测定比色值,并用RT-PCR法检测PPAR-γ基因的表达水平.结果 用药6天,各用药组与对照组相比,均明显促进成脂分化（P〈0.05）,除甘精胰岛素10-8 mol/L组外,其他各组光密度（OD）值均明显高于成脂诱导剂组（P〈0.05）,提示高浓度甘精胰岛素和罗格列酮及其联用,均有显著的促成脂作用.各组均表达PPARγ基因,其中罗格列酮10 μmol/L组＋甘精胰岛素10-7 μmol/L组PPARγ基因表达明显增多.结论 罗格列酮与甘精胰岛素单独应用均能明显促进骨髓基质细胞的成脂分化,两者联用有协同作用.     

双环醇对小鼠日本血吸虫病心肌组织中TGF-β_1、金属蛋白酶1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的研究小鼠日本血吸虫病肝纤维化致心肌损伤作用及双环醇对心肌损伤及纤维化的保护效应及机制。方法80只小鼠随机均分为4组。其中3组小鼠感染日本血吸虫8周后,分别以双环醇60mg/(kg·d)、120mg/(kg·d)治疗56d(8周)以及不作任何治疗(实验对照组),第4组小鼠作为健康对照组。应用苏木素伊红(HE)染色及免疫组化染色法,观察并分析不同剂量双环醇治疗前后各组小鼠心肌组织病理改变、转化生长因子β1(TGF-β1)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达变化同步观察肝组织病理改变。结果用高剂量双环醇治疗后,小鼠心肌组织、肝组织病理损伤减轻,心肌组织中TGF-β1、TIMP1和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显低于实验对照组而高于健康对照组,而低剂量双环醇对日本血吸虫病致肝纤维化及心肌损伤无明显治疗效果。结论日本血吸虫病可致心肌损伤。双环醇抗日本血吸虫病肝纤维化、保护心肌作用呈剂量依赖性,通过抑制心肌组织中TGF-β1、TIMP1和Ⅰ、Ⅲ型胶原过度表达减轻心肌纤维化程度,从而保护心肌作用。