转化生长因子131在大鼠骨髓间充质干细胞移植修复梗死心肌中的作用

背景：人量研究显示,骨髓间党质干细胞是通过旁分泌作用,促使移植部位大量肌纤维母细胞聚集,分泌大量胶原蛋白,从而使梗死后心脏得到有利修复,并改善心脏收缩舒张功能。目的：探讨转化生长因予B1存大鼠骨髓间充质干细胞修复梗死心肌过程中的作用。方法：①体外实验：模拟心肌梗死后微环境培养大鼠骨髓间充质干细胞,检测其分泌肿瘤坏死因子α、血小板衍生生长因子、转化生长因子β1浓度。②休内实验：将大鼠Brdu标记的骨髓间充质干细胞、转化生长因子131、PBS分别移植到梗死后心肌内,免疫细胞化学染色、PCR、Wester-blot等方法检测移植后大鼠心肌胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ形成的差异。结果与结论：心肌梗死后微环境下培养大鼠骨髓间充质干细胞14d可检测到培养基内有高浓度转化生长因子G1。移植骨髓问充质干细胞、转化生长因子β1大鼠心肌部位可检测到肌纤维母细胞的聚集及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达。结果显示大鼠骨髓间充质千细胞移植梗死心肌后,可促进胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的生成,从而改善心脏收缩功能,其中骨髓间充质干细胞所分泌的转化生长因子β1可能发挥重要作用。     

骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化:不同时期心肌梗死区域的最佳微环境

背景:骨髓间充质干细胞移植能够有效改善心肌梗死后的心功能,其作用机制可能与移植部位大量肌纤维母细胞的聚集有关,但至今仍缺少证据来证实聚集的肌纤维母细胞足由骨髓间允质干细胞还是由成纤维细胞转化而来?目的:观察不同时期心肌梗死微环境对人鼠骨髓间充质下细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化的影响.方法:将培养组分为3组:大鼠骨髓间充质干细胞、心脏成纤维细胞单培养组,以及两种细胞共培养组,加入心肌梗死后不同时期心肌匀浆干预7～28 d,并设市不加心肌匀浆的空白对照组,运用免疫细胞化学染色方法,检测不同干预组间平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及成纤维细胞转化为肌纤维母细胞数量间的差异.结果与结论:加用心肌梗死第14天梗死周边区域心肌匀浆干预的共培养组,检测到心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的阳性率最高.提示心肌梗死后微环境下,骨髓间充质干细胞能诱导诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞,而心肌梗死后14 d的心肌梗死微环境是骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的最佳微环境.     

骨髓间充质干细胞对CD117+心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响

背景:骨髓间充质干细胞能够促进心肌细胞、血管生成,减轻心肌重构、改善心功能.但其旁分泌作用能否能够通过影响转化生长因子βⅢ型受体促进CD117+心脏干细胞的分化尚不清楚.目的:观察骨髓间充质干细胞对CD117+心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2008-02/2009-02在新华医院完成.材料:新生大鼠,体质量5～8 g,用于心脏干细胞分离培养;4周龄SD大鼠,体质量200-250 g,用于骨髓间充质干细胞培养.方法:分离大鼠心肌组织进行植块培养,体外磁珠分离培养大鼠心脏干细胞,免疫荧光鉴定其表型为CD117+.将获得的CD117+心脏干细胞吹打制成单细胞悬液,无血清同步化24 h,PBS冲洗3次,加入DMEM/F12培养基,接种至被咀胶包被的6孔板.实验分为对照组和共培养组,对照组用心肌球培养液诱导分化的心脏干细胞,共培养组用Transwell小室避免细胞融合建立心脏干细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系.主要观察指标:①倒置显微镜下观察心脏干细胞生长情况.②western blot检测CD117+心脏干细胞向心肌细胞系分化过程中培养第1,3,5,7天心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白43、转化生长因子βⅢ型受体和smad2及其磷酸化程度的改变.结果:①植块培养和磁珠分离法结合分离出CD117+心脏干细胞,传代后心脏干细胞分散生长,细胞略小于普通心肌细胞.②诱导分化后第5,7天,共培养组心肌钙蛋自T和缝隙连接蛋白43的表达高于对照组(P<0.05);诱导分化后第1～7天,转化生长因子βⅢ型受体的表达均高于对照组(P<0.05);同时,磷酸化smad2/smad2的值也高于对照组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞旁分泌作用能够促进CD117+心脏干细胞内心肌钙蛋白T,缝隙连接蛋白43和转化生长因子βⅢ型受体的表达,并提高了smad2蛋白的磷酸化程度.     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活

背景:骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞.结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只.骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞.对照组于相同部位注射等量生理盐水.每点注射体积30 μL.分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物.取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白.结果与结论:DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性.说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化.     

转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景:间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的:观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法:骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论:通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高(P < 0.05)。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠:高压氧干预促进治疗性血管生成

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后梗死区周边心肌的缺血、缺氧、炎性反应、细胞凋亡等病理变化严重影响到移植骨髓间充质干细胞的存活,而高压氧能显著改善其缺氧状态。目的:对心肌梗死模型大鼠缺血心肌局部移植血管内皮生长因子修饰的骨髓间充质干细胞,在移植后对大鼠进行高压氧干预,探讨其对骨髓间充质干细胞移植后所获得的治疗性血管生成效应的影响。方法:将真核表达载体pcDNA3.1(-)/人血管内皮生长因子165转染大鼠骨髓间充质干细胞,再移植至心肌梗死模型大鼠的缺血区组织,移植前细胞行CM-DiI标记。移植后2周每日对大鼠行高压氧治疗干预。移植1个月后行心脏B超测量其左室射血分数,组织化学苏木精-伊红染色和Ⅷ因子染色并评价新生血管密度。结果与结论:CM-DiI能有效标记骨髓间充质干细胞,标记率近100%。细胞移植1个月后高压氧干预的大鼠射血分数、再生血管密度较均明显增高(P<0.05)。证实,高压氧干预能显著促进移植血管内皮生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的心肌梗死大鼠所获得的治疗性血管生成作用,对心脏功能有明显改善作用。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景：间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的：观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法：骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论：通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高（P 〈 0.05）。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响

背景：骨髓间充质干细胞能够促进心肌细胞、血管生成。减轻心肌重构、改善心功能。但其旁分泌作用能否能够通过影响转化生长因子βⅢ型受体促进CD117^＋心脏干细胞的分化尚不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子3型受体表达的影响。设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2008-02/2009-02在新华医院完成。材料：新生大鼠,体质量5-8g,用于心脏干细胞分离培养：4周龄SD大鼠,体质量200-250g,用于骨髓间充质干细胞培养。方法：分离大鼠心肌组织进行植块培养,体外磁珠分离培养大鼠心脏干细胞,免疫荧光鉴定其表型为CD117^＋。将获得的CD117^＋心脏干细胞吹打制成单细胞悬液,无血清同步化24h,PBS冲洗3次,加入DMEM／F12培养基,接种至破明胶包被的6孔板。实验分为对照组和共培养组,对照组用心肌球培养液诱导分化的心脏干细胞。共培养组用Transwell小室避免细胞融合建立心脏干细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系。主要观察指标：①倒置显微镜下观察心脏干细胞生长情况。（2）Westernblot检测CD117^＋心脏干细胞向心肌细胞系分化过程中培养第1,3,5,7天心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白43、转化生长因子βⅢ型受体和smad2及其磷酸化程度的改变。结果：①植块培养和磁珠分离法结合分离出CD117心脏干细胞,传代后心脏干细胞分散生长,细胞略小于普通心肌细胞。②诱导分化后第5,7天,共培养组心肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达高于对照组（P〈0．05）;诱导分化后第1—7天,转化生长因子βⅢ型受体的表达均高于对照组（P〈0．05）：同时,磷酸化smad2／smad2的值也高于对照组（P〈0．05）。结论：骨髓间充质干细胞旁分泌作用能够促进CD117^＋心脏干细胞内心肌钙蛋白T,缝隙连接蛋白43和转化生长因子βⅢ型受体的表达,并提高了smad2蛋白的磷酸化程度。     

干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移

背景:外周静脉移植间充质干细胞只有1%～5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。目的:观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。方法:采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3～5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3d和移植后3d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。结果与结论:荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P>0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P<0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

背景：滋补肾阴左归丸、温补肾阳右归丸均可协同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,但其机制尚有待探讨。 目的：观察左、右归丸含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad2/3表达的影响。 方法：运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞;分别以空白血清对照组,左归丸、右归丸、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂（地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠）,以及诱导剂组为对照共5组对骨髓间充质干细胞进行干预。采用Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白表达,用免疫组化法检测转化生长因子和Smad2/3在细胞内的表达。 结果与结论：左归丸、右归丸含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨后Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、Smad2/3蛋白表达高于空白组、诱导剂组,差异有显著性意义（P〈0.05）,且左归丸优于右归丸（P 〈0.05）。提示左、右归丸含药血清能通过转化生长因子β1调节Smad2/3信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化,且左归丸组效果更好,表明中医“滋肾阴”法更能有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植:急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化

背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性.目的:观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化.方法:提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记.将55只兔随机分为正常组与手术组.手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组:穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组.5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法,夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法榆测碱性成纤维细胞生长因子.结果与结论:穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞.与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调.穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导.     

骨髓间充质干细胞旁分泌作用与脑缺血后的细胞凋亡

背景:骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的机制之一是骨髓间充质干细胞的旁分泌作用,而目前对于这一机制的研究报道较少.目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对脑缺血后细胞凋亡的抑制作用并探索相关机制.方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立大鼠大脑中动脉缺血模型.24只SD大鼠随机数字表法分为4组,每组6只.细胞移植给药组:大鼠纹状体内移植骨髓间充质干细胞后给予ERK1/2抑制剂U0126;非移植给药组:注射等量的PBS后给予U0126;细胞移植对照组:移植骨髓间充质干细胞后给予溶剂对照;非移植对照组:注射等量的PBS后给予溶剂对照.7 d后通过Western blot检测血管内皮细胞生长因子、磷酸化ERK1/2蛋白的表达;TUNEL染色检测梗死区周围及皮质区细胞凋亡情况.结果与结论:细胞移植组较非移植组大鼠纹状体内血管内皮细胞生长因子蛋白的表达明显增高,磷酸化ERK1/2表达增强,细胞凋亡数明显减少;经U0126处理后,血管内皮细胞生长因子的表达没有变化,而随着磷酸化ERK1/2的表达受到抑制,细胞凋亡数明显增高.提示骨髓间充质干细胞在大脑纹状体内可以旁分泌血管内皮细胞生长因子,并通过激活ERK1/2抑制了脑梗死区细胞的凋亡.     

骨髓间充质干细胞旁分泌对急性心肌梗死心肌的保护作用

背景：成人心肌细胞缺乏再生能力,使用细胞疗法再生和修复心肌,可能提高心肌缺血性损伤后功能。目的：探索骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死中可能的作用机制。方法：密度梯度离心法从SD大鼠中分离培养骨髓间充质干细胞。20只大鼠以开胸冠状动脉结扎法制备急性心肌梗死模型后,随机等分为模型组和骨髓间充质干细胞组,骨髓间充质干细胞组大鼠于冠状动脉结扎后通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞。结果与结论：造模6个月后,与模型组相比,骨髓间充质干细胞组大鼠心脏功能明显改善,心肌组织血管密度增加,细胞凋亡数量减少,心脏组织中炎症因子血管内皮生长因子、von Willebrand因子、肿瘤生长因子3β和白细胞介素1βmRNA表达明显增加。提示骨髓间充质干细胞通过调节心脏炎症因子与血管因子的分泌起到保护急性心肌梗死后心肌细胞的作用。     

接受骨髓间充质干细胞移植的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌组织基质金属蛋白酶及抑制剂的变化

背景:Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量与比例的变化是促使心脏几何形态改变、心肌收缩和舒展功能的重要因素,基质金属蛋白酶2及抑制剂是胶原代谢的主要调节物质。心肌梗死后心力衰竭大鼠接受骨髓干细胞移植后,心肌组织中这些指标会发生哪些变化?目的:观察接受骨髓干细胞移植治疗的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠,心肌组织中胶原含量与比例、基质金属蛋白酶2及抑制剂的变化。设计:随机对照实验。单位:解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。材料:实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。实验动物由北京医科大学动物实验中心提供,选取4周龄清洁级雄性SD大鼠用于骨髓间充质干细胞的制备,200~250g清洁级雌性SD大鼠14只用于心肌梗死后心力衰竭模型的制备,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。方法:采用梯度离心法与贴壁培养法分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞。结扎雌性SD大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死后心力衰竭模型。造模成功4周后将14只大鼠随机分为2组:移植组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受雄性SD大鼠来源的5×106骨髓间充质干细胞。对照组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受等体积磷酸盐缓冲液。每组7只。主要观察指标:移植治疗后21d:①以苏木精-伊红染色和Masson染色评价左心室形态。②以免疫组织化学分析心肌基质金属蛋白酶2及抑制剂与瘢痕区Ⅰ型及Ⅲ型胶原的变化。③以Western杂交检测基质金属蛋白酶2及抑制剂蛋白的变化。结果:14只大鼠均进入结果分析,无脱失值。与对照组大鼠比较,骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死瘢痕区Ⅰ型胶原增加,Ⅲ型胶原降低,心肌组织基质金属蛋白酶抑制剂表达增加,基质金属蛋白酶2表达降低,心室壁增厚,心室腔缩小,心功能增强。结论:骨髓间充质干细胞移植心力衰竭大鼠后,基质金属蛋白酶2及抑制剂发生了动态变化,进而影响瘢痕区胶原比例重建,逆转心力衰竭心脏异常的胶原平衡。     

骨髓间充质干细胞移植大鼠梗死心肌后的存活状况

背景：初步研究结果证实骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死安全、有效,但是其确切的治疗机制尚不清楚。有关移植后干细胞的存活状况及发挥作用时机的研究较少。
　　目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌后的存活状况。
　　方法：密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞。制作大鼠心肌梗死模型80只,于心肌梗死后14 d,在心肌梗死周边区分4个点用微量注射器移植骨髓间充质干细胞,取移植干细胞后仍存活良好的70只大鼠,分别于移植后第3,5,7,10,14,20,28天检测骨髓间充质干细胞的存活情况。
　　结果与结论：移植后第3,5,7,10,14,20,28天免疫组化染色高倍视野(×400)内Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞数分别为(36±12),(33±13),(28±9),(15±5),(5±3),0,0个。移植后骨髓间充质干细胞数整体呈下降趋势,骨髓间充质干细胞数与移植天数呈负相关(r=-0.47,P <0.01),其中移植1周后下降明显,至第20天已无存活骨髓间充质干细胞。结果可见骨髓间充质干细胞移植大鼠梗死心肌后不能长期存活且不会转化为心肌组织。     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的比较

背景：目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中,大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源。目的：比较糖尿病和正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效差别。方法：无菌条件下获取正常大鼠及糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞,建立大鼠心肌梗死模型并随机分为3组,分别于心肌梗死病灶区注射100μL 含有105-106个 F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液,空白对照组注射100μL 含体积分数20%胎牛血清的 DMEM。移植后1个月行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化;通过免疫组化方法检测 Bcl-2的表达。结果与结论：通过对细胞形态观察及流式细胞术鉴定,大鼠股骨骨髓贴壁培养可获取纯度较高的骨髓间充质干细胞,绘制细胞生长曲线结果显示正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长快。移植后1个月,正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织形态较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善,梗死区域心肌组织 Bcl-2的表达也高于其他2组。证实正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快,且糖尿病使骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效降低。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠慢性胰腺损伤

背景:慢性胰腺炎是以胰腺慢性炎症损伤及纤维化为主要病理特征的慢性进展性疾病,骨髓间充质干细胞可能在其治疗中具有潜在价值,但目前这一领域的研究尚不多见.目的:观察骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤的修复作用并探讨其治疗机制.方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;采用胆胰管逆行注射油酸法制备Wistar大鼠慢性胰腺炎模型,随机数字表法分为假手术组、模型组、间充质干细胞治疗组.间充质干细胞治疗组造模后20 d经尾静脉注射间充质干细胞生理盐水细胞悬液1 mL(含细胞3×106),第40天和第60天各重复1次;模型组经尾静脉注射等体积生理盐水;假手术组不进行十二指肠穿刺及胆胰管逆行注射,其余操作同模型组.3组动物均于治疗结束后取胰腺组织行病理组织学检查;并检测胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性.结果与结论:经间充质干细胞治疗的慢性胰腺炎大鼠胰腺病变程度及纤维化程度显著减轻;胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性显著降低(P < 0.01).提示骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤有显著的修复作用,其机制可能和抑制结缔组织生长因子、转化生长因子β产生、抑制炎症反应、减少胶原增生有关.