距离比较法构建表皮生长因子受体抑制剂的药效团模型

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的药效团模型,设计新结构类型的化合物.方法在EGFR结构的诱导下得到抑制剂活性构象集,将13个不同结构特征的EGFR抑制剂的构象进行叠合,应用距离比较法建立合理的药效团模型;初步验证模型的有效性,对数据库进行基于三维药效团模型的搜索和分子对接.结果得到了EGFR抑制剂的三维药效团模型,根据此模型设计了新结构类型的化合物.结论基于三维药效团模型进行药物分子的设计,可以减少后续工作的计算量,提高先导化合物的命中率,用于指导新型的酪氨酸激酶抑制剂的设计.     

SHP-2抑制剂药效团模型的构建与应用

目的:构建并应用蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制剂药效团模型。方法:应用Discovery Studio 3.5软件包中的基于分子共同特征Hip Hop和基于配体-受体晶体复合物CPB两种算法构建出SHP-2抑制剂药效团模型,应用Receiver-operating curve(ROC)分析方法对产生的药效团模型进行验证并对ZINC数据库进行筛选,最后应用Schrodinger Suite 2009中的Qikprop模块预测这些化合物的吸收、分布、代谢、排泄的性质,并与已报道的部分化合物作比较。结果:应用Hip Hop和CPB两种算法分别构建了识别活性与非活性分子能力最强的药效团模型,并且通过这两个模型筛选出了35个具有潜在SHP-2抑制活性的化合物,通过ADME预测得出设计出的化合物具有较好的ADME性质。结论:该两种药效团模型可以用于后续SHP-2小分子药物的筛选和优化,且采用两种药效团联合筛选的方法为计算机辅助药物设计提供了一个新的思路。     

CYP1A2抑制剂预测模型的建立及评价

CYP1A2酶在药物代谢中起着重要作用,抑制CYP1A2会引起被CYP1A2代谢的其他药物代谢率降低,从而导致这些药物的血浆浓度增加,进而使药物的生物效应增强,可能产生药物毒性。因此识别区分CYP1A2抑制剂成为新药早期评选及药物安全性评估的研究重点。本研究利用674个已知CYP1A2抑制活性的化合物构建CYP1A2抑制剂配体库,从基于受体和基于配体的角度,采用分子对接和药效团的方法,利用Pipeline Pilot软件建立自动化筛选预测流程,简单全面地从蛋白-配体结合角度快速准确预测出CYP1A2的抑制剂分子。最终从配体库中共预测出16个目标化合物,其中14个化合物具有CYP1A2抑制活性。研究最后对美国成药数据库进行综合预测,共发现4个药物是已报道的CYP1A2抑制剂。说明本模型对CYP1A2抑制剂具有很好的预测能力,可以应用于CYP1A2抑制剂的预测。     

基于PPARγ-LXRα-ABCA1通路的中药降脂成分研究

目的利用药效团和分子对接等模拟方法,基于过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)-肝X受体α(LXRα)-三磷酸腺苷结合盒转运体Al(ABCA1)通路发现中药中具有降脂作用的潜在活性化合物。方法首先,选择PPARγ和LXRα作为研究载体,分别构建其激动剂的药效辨识模型。通过对药效团模型的验证与评价,获得PPARγ和LXRα的最优药效团模型。随后,利用最优药效团模型筛选中药化学成分数据库(TCMD),结合Lipinski五规则及化合物与药效团模型的匹配度,得到初筛化合物。最后,利用分子对接方法进一步精简筛选结果,保留对接打分值较高的化合物,并分析其关键氨基酸,分别得到PPARγ和LXRα的潜在激动剂。结果本研究构建了PPARγ激动剂的最优药效团模型,包括1个氢键受体、1个疏水基团和2个芳香基团;LXRα的最优药效团模型,包括2个氢键受体、1个疏水基团和2个芳香基团。同时利用分子对接方法构建PPARγ和LXRα的蛋白三维模型,并将其用于分子对接研究。结合药效团及Lipinski五规则的筛选结果,分别获得20个和180个初筛化合物。依据筛选标准(打分值和关键氨基酸),最终确定鹰爪木脂醇和桧双黄酮为PPARγ的潜在激动剂,栝楼酯碱和刘寄奴酰胺为LXRα的潜在激动剂。筛选得到的PPARγ和LXRα潜在激动剂可以通过分别作用于PPARγ-LXRα-ABCA1通路上的对应靶标协同发挥降脂作用。结论本研究高效、快速的筛选了TCMD中具有潜在活性的PPARγ和LXRα激动剂,用于协同上调ABCA1的表达,为高脂血症的药物研发提供先导化合物。     

葡萄糖激酶激动剂药效团模型的构建及应用

葡萄糖激酶(GK)在调节碳水化合物代谢过程中起着重要的作用,已成为2型糖尿病药物研究的热门靶点之一。本研究选取了25个生物活性跨度达5个数量级(2~78 000 nmol/L)的GK激动剂作为训练集,利用Discovery studio2.5软件中的3D-QSAR Pharmacophore Generation模块构建GK激动剂药效团模型。构建得到的药效团模型具有3个氢键受体、1个疏水中心和3个排除体积,相关性系数为0.955,Δcost为60.5,标准偏差为0.714。药效团模型经训练集验证、测试集验证、Fischer验证和筛选能力验证。本研究利用所构建的药效团模型对本课题组合成的穿心莲内酯衍生物库进行虚拟筛选,得到了具有潜在GK激动活性的小分子,初步的药理活性评价验证药效团模型具备较好的筛选能力。     

抗乳腺癌基质金属蛋白酶9类抑制剂的分子设计研究

目的 以氧肟酸类基质金属蛋白酶9(MMP-9)抑制剂为数据集进行分子设计研究,为后续新型抗乳腺癌药物的改造与研发提供参考.方法 以文献中氧肟酸类M M P-9抑制剂为数据集,运用CoM FA和Topomer-CoM FA技术构建3D-QSAR模型,结合Topomer Search技术进行虚拟筛选,综合参考三维等势图信息与分子活性预测值进行分子设计.结果 CoMFA和Topomer-CoMFA模型的交叉验证系数分别为q2=0.697和q2=0.519,拟合验证系数分别为r2=0.994和r2=0.982,表明模型具有良好的稳定性和预测能力.三维等势图提示,分子侧链的静电场贡献度较立体场大,进一步结合Topomer Search虚拟筛选方法构建出2个新的高活性抑制剂化合物.结论 基于氧肟酸类MMP-9抑制剂的定量构效关系分析和虚拟筛选可用于MMP-9抑制剂的分子设计研究,为MMP-9靶向新药研发提供参考.     

基于药效团模型及虚拟筛选方法发现EphB4全新抑制剂

采用计算机模拟手段,通过建立3D-QSAR模型、虚拟筛选及分子对接方法发现恶性肿瘤治疗靶标EphB4潜在的抑制剂。首先,通过Catalyst/HypoGen算法建立药效团模型。其中最好的模型Hypo1具有最高的科雷尔值(Correl值):0.96,最低的RMS值:0.89,与固定消耗值(fixed cost):89.20最接近的总消耗值(total cost):101.26,和最高的Δ消耗值(Δcost值):89.14。随后,Hypo1经过测试集验证及Fischer随机验证,并用于筛选化合物数据库。然后利用类药性筛选及分子对接手段进一步减少分子数量。最终,根据预测活性分析、对接得分值及结合模式分析,得到23个具有全新骨架的化合物作为EphB4的潜在抑制剂可用于后续研究。     

具有μ/δ双重功效的阿片受体激动剂中药成分筛选研究

阿片类镇痛药作用于体内μ、δ和κ三种阿片亚型受体,是中重度疼痛的主要治疗药。目前临床上使用的阿片类镇痛药大多为μ受体激动剂,但易引起成瘾性、呼吸抑制等副作用。δ受体对μ受体介导的生理效应存在着明显的调节作用,可减少斗受体激动剂副作用的产生。因此,寻找具有μ／δ双重功效的先导化合物势必将为设计低毒副作用镇痛药物提供新的思路。借助于先进的分子模拟技术,该文首先分别构建了这两种受体激动剂的药效团模型。测试集阳性正确率（大于60％）和阴性正确率（大于90％）表明,模型具有较强的预测能力和合理性。由于从天然药物中寻找高效、低毒、无依赖性的镇痛新药已成为新的发展趋势,本课题选择在中药成分数据库中开展μ／δ阿片受体双激动剂先导化合物的虚拟筛选研究。运用空间多样性子集法,首先选取2000个代表性中药成分作为候选分子。运用构建的2个药效团模型共同过滤,发现38个中药成分可作为潜在的μ／δ阿片受体双激动剂先导化合物。化合物与μ／δ阿片受体蛋白对接的结果显示化合物4、20、23、31、34、38与μ／δ阿片受体的结合活性较好,更有潜力作为μ／δ双重功效的阿片受体激动剂的先导化合物。其中,化合物23来源于小花木瓣树的树皮,小花木瓣树的树皮作为传统的镇痛药广泛地在非洲被使用,而化合物23有可能是其主要的镇痛成分。     

桂枝中酚类提取物潜在作用靶点的探索

目的?研究桂枝中酚类提取物木脂素的潜在作用靶点。方法?在药效团模型数据库中筛选出与木脂素衍生物匹配值（FitValue）大于0.75的药效团模型；运用反向对接技术，从上述药效团模型所对应的靶点蛋白中挑选出与木脂素衍生物结合能最低的蛋白；以该靶蛋白已报道的抑制剂建立3D-QSAR药效团模型预测木脂素衍生物的活性，同时通过荧光偏振实验测试化合物1与Tankyrase 1蛋白的结合力，通过Western blot实验测试加入化合物1后细胞中Tankyrase 1蛋白的含量变化；最后用分子动力学模拟分析木脂素衍生物与该蛋白的作用模式。结果?与木脂素衍生物匹配值大于0.75的药效团模型有17个，其中4个为神经保护类靶点，占比（24%）最大；反向对接结果显示该化合物与Tankyrase 1蛋白（PDB ID:4TOR）的结合能（E=-66?kcal/mol）最低；预测该化合物的活性为0.61?μmol/L，荧光偏振实验测得化合物1与Tankyrase 1蛋白的结合力Ki=（0.15±0.01）μmol/L，属于中等抑制，Western blot表明在SW480细胞中化合物1使Tankyrase 1蛋白的表达下降；且分子动力学结果显示对接构象与该靶点已报道的抑制剂类似。结论?经过对桂枝中酚类提取物木脂素衍生物的反向找靶，以及活性测试确定其对Tankyrase 1蛋白具有潜在的抑制活性。      

具有质子泵双抑制机理中药成分筛选研究

质子泵抑制剂能有效治疗胃酸相关疾病,目前上市及处于临床研究的药物有不可逆型和可逆型两种作用机理。如果一个先导化合物能够同时符合这两种作用机理,势必有望成为更加有效的质子泵抑制剂。借助于先进的分子模拟技术,该文首先分别构建了这两种作用机理的药效团模型。测试集阳性正确率（大于70％）和阴性正确率（大于90％）表明,模型具有较强的预测能力和合理性。由于70％的现有药物仍然直接或间接的来源于中药成分,因此,本课题选择在中药成分数据库中开展质子泵双抑制机理先导化合物的虚拟筛选研究。运用空间多样性子集法,首先选取1000个代表性中药成分作为候选分子。进一步运用构建的两个药效团模型共同过滤,发现26个中药成分可作为兼具不可逆型和可逆型双机理的先导化合物。其中化合物14来源于治疗胃脘疼痛的中药材九里香,为从分子水平解释中成药“三九胃泰”的作用机理提供了思路。本课题研究方法同样适用于其它疾病的中药成分筛选研究。     

血管内皮细胞生长因子受体基因变异297 Val→Ile与受体功能及脑卒中易感性

目的 探讨血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR-2)基因的编码区变异对受体功能的影响及与脑卒中患病风险的关系.方法 利用多中心病例-对照研究,在1849例脑卒中患者(血栓形成性脑梗死812例,腔隙性脑梗死530例,脑出血507例)和1798例对照人群中检测VEGFR-2基因编码区变异rs2305948(Val297Ile)与脑卒中易感性的关联,并在另一个独立的病例-对照研究(327例脑卒中和327例对照)中进行验证.放射性受体配体结合实验测定基因变异对VEGFR-2与配基VEGF亲和能力的改变.结果 VEGFR-2基因变异297Ile携带者频率在脑出血组显著高于对照组[脑出血组:Val/Ile,155(30.6%);Ile/Ile,16(3.2%);对照组:Val/Ile,351(19.5%);He/Ile,18(1.0%);P<0.01],与脑出血的高发病风险相关(OR 2.25;95% CI 1.70～2.96;P<0.01),验证研究亦得到相似结果.常见等位基因297Val被替换为297Ile时,VEGFR-2与配基VEGF的平衡解离常数显著增加[分别为(87±9)pmol/L和(195±36)pmol/L,P<0.01].结论 VEGFR-2基因变异297Ile降低该受体与配基的亲和能力,并与脑出血的高发病风险相关.其分子机制可能是由于VEGF/VEGFR-2信号通路下调,引起血管内皮细胞的稳态和完整性受损,在血压升高等情况下导致血管易破裂、出血.     

用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫方法的建立

目的 建立一种均相时间分辨荧光免疫分析方法用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.方法 根据铕联穴状化合物(EuK)和异藻蓝蛋白(XL-665)两个荧光化合物在激发后的能量共振转移所发出的特异性荧光,采用多功能酶标仪在波长为612 nm和670 nm处测定荧光信号的变化;以血管内皮生长因子2(VEGFR-2)为蛋白酪氨酸激酶,检测蛋白酪氨酸激酶抑制剂Sunitinib的抑制活性.结果 建立了一种用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂体外高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫分析方法.在反应体系中,蛋白酪氨酸激酶VEGFR-2、三磷酸腺苷(ATP)和多肽底物浓度分别为5ng/μ1、100 μmol/L和1 μmol/L.在上述条件下,检测到Sunitinib 对 VEGFR-2酪氨酸激酶抑制活性的IC_(50)为86.7nmol/L,与文献报道的结果近似.结论 本实验所建立的均相时间分辨荧光免疫分析方法操作简便,重复性好,可用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.

Abstract：

Objective To establish an in vitro homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay method for high throughput screening of protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors. Methods Specific fluorescence signals at 670 and 612 nm were measured by multifunctional microplate reader when the fluorescence was emitted through a resonance energy transfer between fluorescent materials (EuK and XL-665). The inhibitory activity of Sunitinib, a standard PTK inhibitor, on vascular endothelia growth factor receptor 2 (VEGFR-2) kinase activity was investigated. Results A homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay was established for high throughput screening of PTK inhibitor. In this system, the concentrations of VEGFR-2, adenosine triphosphate (ATP) and poly-peptide substrate were 5 ng/μ1, 100 μmol/L and 1 μmol/L,respectively. Sunitinib inhibited VEGFR-2 kinase activity with an IC_(50) value of 86.7 nmol/L, which was close to the values tested using other methods. Conclusion The homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay we established can be easily used for high throughput screening of PTK inhibitors.     

VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂3-取代吲哚-2-酮的合成及抑制活性

目的:合成一系列结构新颖的3-取代吲哚-2-酮类化合物,并测试其对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的抑制活性。方法:以2-(羟甲基)-5-氰基-1H-吲哚为起始原料,经水解、氧化、缩合和胺化反应得到目标产物(6-14);以舒尼替尼为阳性对照,用MTT法测试目标产物对VEGFR-2高表达的人乳腺上皮细胞(HMEC)的抑制活性。结果:合成9个未见报道的目标产物,其结构均经1H NMS,ESI-MS确证;样品浓度为10μmol/L时,化合物14对VEGFR-2的抑制率为68.56%,舒尼替尼为62.53%。结论:化合物14对VEGFR-2的抑制活性优于阳性对照舒尼替尼。     

疏血通对VEGFR-2及SRF表达的影响

目的探讨生物药品疏血通对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)和血清应答因子(SRF)表达的影响及其促进血管生长的机制。方法在内皮细胞培养基中加入药物疏血通的稀释液,药物与细胞作用后,在6个特定的时间点,采用免疫细胞化学染色方法,通过阳性细胞计数,检测VEGFR-2和SRF蛋白的表达。结果与对照组比较,疏血通处理组VEGFR-2和SRF蛋白表达水平明显增高(P<0.01)。结论疏血通能明显增加体外培养的血管内皮细胞VEGFR-2和SRF的表达,其促血管生长的可能机制之一是通过诱导内皮细胞增殖及血管平滑肌细胞分化,从而促进新生血管形成。     

Notch 信号通路与兔深II 度烧伤创面血管相关因子的表达

目的：探讨Notch信号通路与兔深II度烧伤模型创面血管相关因子表达的关系。方法：120只新西兰大白 兔,随机分为阻滞剂组、模型组、对照组。其中阻滞剂组于造模前1 d及造成深II度烫伤后连续14 d按2 mg/kg注射γ-分 泌酶阻滞剂(gamma-secretase inhibitor,GSI),每天1次;模型组同期注射生理盐水,每天1次;对照组不予造模,余同 模型组。每组分别于第3,7,14,21,28天随机抽取8只处死,采用免疫组织化学法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)、 基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein 2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)的表达。结果： 模型组与阻滞剂组造模后21 d内VEGF和VEGFR-2的表达逐步上升,第21天后有所下降,而MMP-2和MMP-9的表达逐步 下降,第21天后有所上升,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间点模型组VEGF和VEGFR-2的表达均 高于阻滞剂组,MMP-2和MMP-9的表达均低于阻滞剂组,差异具有统计学意义(P<0.05),阻滞剂组在造模后21 d内, VEGFR-2的表达与VEGF呈正相关,而MMP-2和MMP-9则与VEGF呈负相关。结论：在兔深II度烧伤模型创面中,Notch 信号通路被阻滞能够减弱创面血管生成因子VEGF和VEGFR-2的表达,而上调抑制因子MMP-2和MMP-9的表达。     

桃红四物汤促进产后血瘀大鼠子宫修复的作用

目的 观察桃红四物汤对产后血瘀大鼠子宫修复的促进作用,探讨其与内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2）的关联性。方法 选取产后血瘀模型复制成功的大鼠40只,将其随机分为桃红四物汤高剂量（18.0 g/kg）、中剂量（9.0 g/kg）、低剂量（4.5 g/kg）组,阳性对照组（益母草颗粒4.3 g/kg）和模型组（蒸馏水）,另取正常雌性大鼠作为正常对照组。连续给药7 d后,腹主动脉取血,分离子宫,苏木精-伊红染色法观察子宫血瘀状态,免疫组织化学法检测子宫VEGFR-2表达情况;酶联免疫吸附法检测血清中ET-1、iNOS及VEGF水平。结果 桃红四物汤可明显改善子宫血瘀程度,促进子宫组织中VEGFR-2的表达;桃红四物汤高、中剂量组大鼠血清VEGF及iNOS水平明显升高（P＜0.05）,ET-1水平明显降低（P＜0.05）。结论 桃红四物汤可促进产后血瘀大鼠子宫修复,其修复作用可能与调节子宫血管舒缩功能及促进子宫血管新生有关。     

VEGFR-3抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤模型的影响

目的 研究血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3）抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤模型生长的抑制作用。方法 利用人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞建立裸鼠喉癌模型。将24只裸鼠模型随机分成2组：治疗组和空白对照组，每组12只，分别腹腔内注射VEGFR-3抗体和生理盐水，观察肿瘤体积及重量变化，进行微淋巴管计数，绘制生长曲线并计算抑瘤率。结果VEGFR-3抗体组移植瘤体积和重量小于生理盐水组，有统计学意义（t体积=56.90，P〈0.05；t重量=11.64，P〈0.05）。EGFR-3抗体抑瘤率为48.21%。但组间微淋巴管计数无差异（t=1.48，P〉0.05）。结论 VEGFR-3抗体可以抑制裸鼠人喉鳞癌细胞移植瘤的生长，其作用机制可能与VEGFC和VEGFR-3的抑制有关。     

血管内皮生长因子受体在大鼠脊髓组织中的表达与分布

目的观察血管内皮生长因子受体VEGFR-1与VEGFR-2在大鼠脊髓组织的表达与分布. 方法取成年雄性Wistar大鼠腰段脊髓组织,采用免疫组织化学方法和逆转录-聚合酶链式反应技术,对VEGF受体蛋白及mRNA在大鼠脊髓组织中的表达与分布进行研究.结果 VEGF的两种受体蛋白在大鼠正常脊髓组织的微血管均有表达,并且VEGFR-2更主要的表达于脊髓运动神经元、胶质细胞及周边白质中的神经纤维,其mRNA的表达水平明显高于VEGFR-1(P<0.05). 结论VEGF通过VEGFR-1、VEGFR-2两种受体共同作用促进脊髓微血管的形成,维持神经内环境的稳定;通过VEGFR-2发挥神经营养和神经保护作用,为今后进一步应用VEGF治疗脊髓损伤奠定了实验及理论基础.     

血管内皮生长因子及其受体表达水平下调增加垂体腺瘤卒中风险

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体在垂体腺瘤中的表达与垂体腺瘤卒中之间的关系。方法 本实验运用实时定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR,QPCR)检测了166例垂体腺瘤标本中VEGF及其受体mRNA的表达,结合病理结果,免疫组织化学和临床资料特点分组进行统计学分析。结果 出现肿瘤卒中的无功能腺瘤中VEGF和VEGF-3的表达水平降低与肿瘤卒中有关(P<0.05);VEGF-1和VEGFR-2表达水平与肿瘤卒中无明显相关(P>0.05)。结论 无功能垂体腺瘤的VEGF和VEGFR-3的表达下降与垂体腺瘤卒中有关。